Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ortotopisk Injektion af brystkræft celler i brystfedtpuden af ​​mus til at studere tumorvækst.

Published: February 8, 2015 doi: 10.3791/51967

Summary

Cancer er en kompleks sygdom, der påvirkes af væv, der omgiver tumoren samt lokal pro- og anti-inflammatoriske mediatorer. Derfor kan orthotrope injektion modeller, snarere end subkutane modeller være nyttigt til at studere udviklingen af ​​kræft på en måde, der bedre efterligner human patologi.

Abstract

Brystkræft vækst kan studeres i mus ved anvendelse af en overflod af modeller. Genetisk manipulation af brystkræft celler kan give indsigt i funktionerne af proteiner involveret i onkogen progression eller hjælp til at opdage nye tumorsuppressorer. Desuden kan injicere kræftceller i mus med forskellige genotyper give en bedre forståelse af betydningen af ​​stromale rum. Mange modeller kan være nyttigt at undersøge visse aspekter af sygdomsprogression, men ikke rekapitulere hele kræft processen. I modsætning hertil brystcancerceller indpodning til brystfedtpuden af ​​mus bedre rekapitulerer placeringen af ​​sygdom og tilstedeværelsen af ​​det korrekte stromal rum og derfor bedre efterligner human cancersygdomsmodificerende. I denne artikel beskriver vi, hvordan at implantere brystkræftceller i mus orthotopisk og forklare, hvordan at indsamle væv til at analysere: 14px; line-højde:. 28px; "> tumor miljø og metastase til fjerne organer anvendelse af denne model, mange aspekter (vækst, angiogenese og metastase) af cancer kan undersøges ved blot at tilvejebringe en passende miljø for tumorceller at vokse.

Introduction

Kræft er en meget kompleks sygdom, der har været genstand for undersøgelser i over århundreder. Brystkræft er den mest almindelige cancertype; det forekommer overvejende hos kvinder, men kan sporadisk også forekomme hos mænd 27. Sygdommen er primært forårsaget af tabet af styremekanismen ledelsesorgan celledeling, hvilket igen fører til en uendelig vækst af celler i kroppen. Disse fejl kan være forårsaget af flere mekanismer: første, raske celler brug vækstsignaler fra de omkringliggende celler for at formere henviser cancerceller gøre deres egne vækstfaktorer og øge ekspressionen af vækstfaktorreceptorer således at opnå en højere proliferationshastighed 1; andet cancerceller er mindre modtagelige for anti-proliferative signaler 8; tredje, at afbalancere celleantallet i kroppen celledød er også påkrævet; dog kræftceller flygte fra programmeret celledød, betegnet apoptosis 14; fjerde adhærerer til ekstracellulære matricerfor at overleve, men tumorceller kan vokse uden behov for fastgørelse og viser modstand mod anoikis 19; femte aktivering af telomerase omgår telomer afkortning og forhindrer den replikative ældning 21; sidst men ikke mindst, springer DNA kvalitetskontrol af efterfølgende mitose resulterer i ændret genetisk indhold 15,16. For at identificere onkogener eller tumorsuppressorer, der spiller en rolle i denne dereguleret spredning, tumor vækst eksperimenter i mus er afgørende.

Primær tumorvækst er generelt ikke den vigtigste årsag til dødsfald. Migration af cancerceller fra det primære sted til et andet sted, kaldes metastase, er den førende årsag til dødsfald i de fleste kræftpatienter 22. Metastase indebærer tumorcelleinvasion, intravasation, rejser gennem cirkulationen, undgå immunangreb, ekstravasation og vækst på det sekundære site. Epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er et centralt proces imetastase og indebærer et skift i genekspressionsprofiler giver celler med højere motilitet og invasivitet, som er forudsætninger for metastaserende cellen 12. Da kræft proces er den resulterende af en kombination af forskellige foranstaltninger, herunder gensidige interaktioner mellem kræftceller, stromale celler og pro- og anti-inflammatoriske celler, en in vitro metode til kræft ofte ikke giver fuld indsigt i kræft proces. Tilsvarende anticancerbehandlinger påvirker tumorvaskulaturen kan ofte ikke undersøgt in vitro, således anvendelsen af in vivo fremgangsmåder er uundgåelig.

At studere brystkræft progression, er blevet udviklet forskellige eksperimentelle metoder. Den mest udbredte model er den subkutane injektion af brystcancerceller i mus 5. I denne forsøgsopstilling kan investigator indføre en lang række ændringer af en cellelinje af valg in vitro (dvs.opregulering, nedregulering af proteiner) og injicere cellerne under huden. Selv om denne fremgangsmåde er ligetil og injektionsprocessen er enkel uden behov for at udføre kirurgi på mus, er det sted, hvor tumoren injiceres ikke repræsentere lokale brysttumor miljø og fraværet af dette miljø kan resultere i brystkræft udvikling, adskiller sig fra hvad der er observeret i human patologi. For det andet er gensplejsede mus anvendes ofte som et in vivo værktøj til at studere brystkræft progression. I denne model er onkogen (dvs. PyMT, Neu) ekspression drevet af en brystvæv-specifik promotor, der fører til dannelsen af spontan brysttumor s. Denne forsøgsopstilling er nyttigt at undersøge behandling aspekt af sygdommen ved at injicere lægemidler eller antistoffer under kontrol tumorstørrelse i tid 3. Men avl af disse mus med andre musestammer deficiente eller muteret i et gen af ​​interesse kan også give insights i rollen af forskellige proteiner i brysttumorvækst 24. Ulempen ved denne model er, at det er udsat for variation i tumor størrelse og antal. Desuden er niveauet af transgenekspression afhænger integration site i genomet, og kan skifte fra en musestamme til en anden 4. I denne model, kan ekspressionen af transgenet opnås ved alle cellerne med epitel oprindelse henviser i human sygdom, kun en subpopulation af celler udtrykker onkogenet eller nedregulere tumor suppressor niveau 26. At studere metastase, kan brystkræftceller også injiceres intravenøst ​​(en model kaldet eksperimentel metastase) 25. Men denne fremgangsmåde kun rekapitulerer den metastatiske proces delvist; det omgår kravet om tumorceller til at invadere og intravasate og starter fra det punkt, hvor tumorceller er let til stede i kredsløbet.

I vores arbejde bruger vi en ortotopisk injicereion model til at studere inddragelse af gener af interesse i brystkræft progression 13. Vi overudtrykker proteinet i humane brystkræftceller, og indsprøjtes i yverfedt pude af NOD / SCID gamma (NSG) mus. Denne metode er fordelagtig på mange måder: det giver meget hurtige og forskellige genetiske ændringer i det injicerede cellelinje, det dækker hele processen med brystkræft progression fra primær tumor vækst metastase på patologisk relevante steder, og det giver også en god forsøgsmodel for at studere virkningen af ​​terapeutiske behandlinger på tidlige eller sene stadier af sygdommen. Desuden kan ved hjælp af denne model en undersøge den rolle, stromale versus cancercellelinier afledte proteiner sygdomsprogression ved anvendelse af genetisk modificerede mus eller celler. Selv subkutane injektioner er lettere at udføre, ortotopisk modeller giver anledning til en mere tumorigen og mere metastatisk cancer cellepopulation. Således opnåede resultater ved hjælp af subkutan injektions kunne være enten falsk-negative eller falsk positive 6,17 tilskynde til anvendelse af ortotopisk modeller til at studere tumorvækst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af dyrevelfærd udvalg i Leiden University Medical Center (LUMC).

1. Fremstilling af celler, Instrumenter og mus

  1. En dag før operation, barbere NOD / SCID gamma (NSG) mus fra den fjerde brystvorten med midterlinjen og afveje mus for at kontrollere, at alle mus har nogenlunde sammenlignelige vægte.
  2. Autoklaver en saks, to pincetter og to lige myg pincet (figur 1A).
  3. På dagen for operationen, vaske humant brystadenocarcinom (MDA-MB-231) celler, der vil blive injiceret en gang med phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, og Trypsinisér cellerne. Stands trypsin ved tilsætning af 10 ml serum indeholdende DMEM medier oven på cellerne. Centrifuger cellerne ved 1200 rpm i 7 minutter ved stuetemperatur for at fjerne serum ved resuspendering af cellerne i enten PBS eller medium uden serum. Centrifuger dem igen for at fjerne spor af serum fuldstændigt. Resuspender cellerne i PBS ellermedier.
  4. Tæl cellerne med et hæmocytometer og beregne mængden af ​​celler. Brug 500.000 celler / mus i højst 150 pi. Valgfri til PBS eller medier, opblande cellerne i matrigel.
    BEMÆRK: Bestem mængden af ​​celler afhængig af celletype anvendes.
  5. Placer celler i et sterilt mikrocentrifugerør og holde dem på is.
  6. Fyld en 50 ml konisk centrifugerør med 35 ml PBS pH 7,4 og en anden 50 ml konisk centrifugerør med 70% ethanol. Soak vatpinde i hvert rør.

2. ortotopisk Injection

  1. Udføre operationen i en steril hætte for at opretholde en steril atmosfære. Bedøver musen ved subkutan injektion xylazin / ketamin blanding i en dosis på 10 mg / kg, 100 mg / kg legemsvægt henholdsvis. Fastgør musen på en varmepude. Bekræft succes anæstesi på grund af manglende reaktion på tå knivspids.
    BEMÆRK: Hvis man ikke er meget fortrolig med kirurgiske procedurer, kan kirurgi tage længere tid. Arrangereanæstesi dosis i overensstemmelse hermed.
  2. Anvend oftalmisk salve på øjnene af mus, for at forhindre øjnene mod udtørring.
  3. Rengør barberede område ved hjælp af vatpind dyppet i ethanol fremstillet i trin 1.6. Skiftende scrubs der bruger betadine og alkohol tre gange i en cirkulær måde roterer væk fra det planlagte incisionssted skal udføres. Alternativt kan du bruge ionoforen som desinfektionsmiddel.
  4. Lav et lille snit mellem fjerde brystvorten og midterlinjen med en saks og lave en lomme ved at indsætte vatpind fugtet med PBS pH 7,4.
  5. Brug en pincet for at blotlægge brystfedtpuden. Overhold fedtpuden ved sin hvide farve.
  6. Klem fedtpuden med den anden pincet fra sin base; ved at gøre dette, fuldt udsætte fedtpuden (figur 1B) til at udføre indsprøjtninger nemt.
  7. Homogeniseres celleblandingen ved at pipettere op og ned. Forsigtigt aspireres 50 pi cellesuspension i en insulinsprøjte og tilføreden brystfedtpuden ved at holde nålen vandret. Bekræft vellykket injektion ved at kontrollere for hævelse af fedt pad.
  8. Slip fedtpuden forsigtigt.
  9. Suturere indsnit ved hjælp af en nål driver. Lav tre omgange ved at dreje sutur omkring nålen driver i uret, mod uret og uret. Bør der anvendes to knuder pr sutur.
    BEMÆRK: Sørg for, at knuderne er tætte ellers mus kan åbne suturerne.
  10. Efter operationen, injicere et analgetikum, såsom TEMGESIC på 0,05-0,1 mg / kg legemsvægt, subkutant for at lindre smerten.
  11. Efterlad ikke dyr uden opsyn, indtil de får bevidsthed og vedligeholde brystbenet recumbence. Læg alle de dyr i forskellige bure, indtil de er fuldt tilbagebetalt.
  12. For at opretholde sterilitet, bruge autoklaverede bure og vand. Skift burene hver tredje dag for at holde stemningen ren.

3. Høst organer til analyse

  1. Pådag for høsten, 8 uger efter implantation af cellerne fyldes 15 ml koniske centrifugerør med 3 ml Bouins opløsning for hver mus. Derudover bruge to 15 ml rør fyldt med 5 ml formalin opløsning pr mus.
  2. Bedøve dyr ved at injicere xylazin / ketamin ved en dosis på 10 mg / kg 100 mg / kg legemsvægt subkutant. Vent, indtil dyret mister tå tilbagetrækning knivspids refleks.
  3. Fastgør dyret med nåle på en base. Gøre en lang, lodret midtlinjeincision med en saks. Lav to vandrette snit lige under det forreste ben og over den bageste ben. Frilægges tumoren ved at fastgøre huden til basen. Mål tumorvolumen ved hjælp af en skydelære.
  4. Dissociere tumor fra huden med en saks. Snap fryse en del af tumoren i flydende nitrogen til RNA-isolation. Placer den anden side, i det koniske centrifugerør fyldt med formalin til at udføre immunhistokemi efter paraffinindlejring.
  5. Forsigtigt tage lungerne. Placervenstre lunge i Bouins opløsning. Hold lungen i opløsning i 3 dage. Overhold overfladisk metastatiske foci klart blotte øje. Eventuelt placere højre lunge i formalin til at kontrollere mikrometastase hjælp hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning.
    BEMÆRK: Selvom, lunge metastase observeret hyppigt i brystkræft, kan man også ønsker at indsamle knogler, lever, hjerne og milt til at analysere metastaser. Cellerne ved den metastatiske område er tættere og morfologisk forskellige og kan derfor skelnes let fra lungevæv.
  6. En dag efter høst, sug formalin løsning fra 15 ml rør og erstatte med 70% ethanol. Indlejre vævet i paraffin og udføre immunhistokemiske studier.
  7. For blodanalyse, åbne brysthulen med en saks. Træk 450 pi blod via hjertepunktur. Blodprøve anbringes i et mikrocentrifugerør indeholdende 50 pi 3,2% natriumcitrat. Efter blod opsamles, spinde det ved 2.000 xg i 10 kmn. Opbevar plasmaprøverne ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
    BEMÆRK: Der er flere andre blodprøvetagning teknikker, der almindeligvis anvendes i praksis 20 og den teknik, der skal anvendes, afhænger af forsøgsopstilling og videnskabsmand valg. Hvis blodprøve ikke er påkrævet, aflive dyret efter dyret protokollen eller som pr retningslinjerne institution.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket anvendelse af "ortotopisk brystkræft model" er baseret på en ordentlig indsprøjtning af celler i yverfedt pad. Eksperimentelle fejl som upræcise podning af celler eller lækage kan føre til variationer i tumorstørrelse eller fraværet af en tumor, som fører til dannelsen af en struktur ser ligner en brystfedtpude injiceret med en kontrol buffer (figur 2A). Den vækst af tumoren er afhængig af arten af den injicerede cellelinie og generelt kan iagttages gennem huden af mus (figur 2B). I modsætning til in vitro-forsøg, kan væksten af tumorcellerne ikke være konstant i tid in vivo (figur 2C). På grund af iltmangel og mangel på næringsstoffer, kan nekrotiske områder danner og disse områder vil påvirke væksten af tumoren (figur 2D). Desuden kan genet af interesse påvirke en bestemt fasecancer progression (tidlig eller sen), således afhængigt af forsøgsopstillingen, tumorvækst kan begynde hurtigt, men langsommere ved slutningen eller vice versa.

Der bør udvises forsigtighed under proceduren af ​​tumor fjernelse; streng håndtering kan påvirke strukturen af ​​tumor og fører til problemer i immunhistokemisk analyse. Området omkring tumoren kan vise store fartøjer, der opstår fra vaskulær remodellering. Disse skibe spiller en afgørende rolle i fjernelse af affaldsprodukter og forsyne tumorvæv med næringsstoffer og ilt og derved lette tumorvækst (figur 2B). Dannelse af neovessels (angiogenese) kan undersøges ved farvning tumoren for neovessel markører (dvs. CD31, CD34).

Indsamling af lungerne i Bouins opløsning bidrager til at visualisere overfladisk metastatiske foci på lungerne (figur 3A). Brændpunkterne kan skelnes fra lungevæv ved hjælp af bleg farve end er nemme at opdage 18. Metastase kan udtrykkes som antallet af foci dannet på lungeoverfladen. Men dannelse af foci er cellelinje-afhængig; ikke-aggressive celler giver anledning til kun mikrometastase eller ingen metastaser overhovedet. Micro metastase kan let identificeres med et hæmatoxylin / eosin farvning på paraffinindstøbt lungevæv (figur 3C).

Figur 1
Figur 1:. Materialer og metoder (A) kirurgiske udstyr der kræves til indsprøjtning af brystcancerceller i brystfedtpuden (B) repræsentativt billede, der viser eksponering for brystfedtpuden..

Figur 2
Figur 2:. Oversigt over ortotopisk bryst tumorvækst i mus (A) Media kontrol eller (C) Tumorvolumen blev målt med en skydelære ved hjælp af følgende formel:.. Tumorvolumen = 0,5 x længde x bredde x bredde (D) Samlet morfologi af tumoren analyseres med H & E farvning. I står for infiltrerede celler, T angiver tumorceller og N står for nekrotisk område. (Målestok = 200 um)

Figur 3
Figur 3: tumormetastase lunger (A) Lunger fra mus, som blev orthotopisk injiceret med tumorceller (MDA-MB-231).. Inkubation af lungerne i Bouins opløsning udsætter metastatiske foci på lungerne. (B) Lunger fra kontrolmusat undergik orthotopisk injektion af kontrol- medier. Som det tydeligt ses, at disse kontrolforanstaltninger lungerne ikke viser makroskopiske metastaser. (C) H & E farvning viser metastatisk region i lungevæv. Indsatsen viser en lav forstørrelse oversigt over lungevævet indeholdende metastatisk fokus. Den sorte stiplede rektangel i indsatsen er repræsenteret i stort panel. Tumorceller er angivet med hvide stiplede linie; Bemærk de større og tættere kerner. (Black skala bar = 100 um, hvid skala bar = 20 um)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Orthotopisk injektion af brystcancerceller er en kraftfuld model til at undersøge alle aspekter af kræft vækst. Implantation af disse celler i brystfedtpuden af ​​musene bør udføres omhyggeligt for at undgå variation i tumorvækst. Vigtigst indsprøjte den samme mængde celler til hver mus er afgørende. For at gøre dette, bør man Trypsinisér cellerne strengt uden at påvirke cellernes levedygtighed. Bør der ses bort Ikke-levedygtige celler under celletælling og reagenser (dvs. trypanblåt), der kan hjælpe til at skelne mellem døde og levedygtige celler kan være anvendelige til bestemmelse af antallet af levedygtige celler. Dannelse af klumper af celler bør undgås ved at pipettere cellerne op og ned som dannelse af celleklumper forårsage problemer under celletælling og fører til fejlagtig beregning af celletallet. Et andet vigtigt aspekt, der skal tages i betragtning, er mængden af ​​cellerne selv. Som beskrevet i protokollen sektion, celles pelleteres for at suspendere dem i PBS eller medier. Før tilsætning af PBS eller medier, kan mængden af ​​celler estimeres ved sammenligning pelleten med rør fyldt med forskellige mængder af medier. Efterfølgende volumen celle kan trækkes fra den tiltænkte medier volumen, i henhold til følgende formel:

Volumen af ​​medier, der skal tilføjes = Beregnet volumen - Cell volumen

Reagenser, der anvendes i protokollen, kan påvirke resultatet af forsøget; derfor protokollen bør justeres i overensstemmelse hermed, afhængigt af problemstilling. For eksempel, hvis forsøget har til formål at belyse den rolle, et membranprotein i tumorudvikling, kan trypsinbehandling resultere i spaltning af membranproteinet og forårsage artefakter 9. Hvis dette er et problem ved anvendelse af pufret EDTA-opløsning eller skrabe cellerne er et alternativ til at løsne cellerne. Som nævnt ovenfor kan celler resuspenderet i medier, PBS eller matrigel FOr injektion. Blandt disse matrigel er en praktisk mulighed som matrigel polymeriserer i fedt pad, hvilket minimerer celler lækker ud af fatpad. Desuden kan indpodning i nærvær af matrigel forbedre tumorvækst og metastatiske potentiale af visse cellelinier, såsom brystkræft cellelinien MDA-MB-435 2, humant submandibulære carcinom A253, humane epidermoide carcinoma Kb og musemelanom B16F10 celler 7. Bemærk at nogle Matrigel præparater indeholder vækstfaktorer, der potentielt påvirker de eksperimentelle resultater. Men vækstfaktor-udtømte matrigel fås fra forskellige leverandører. Derudover Matrigel fungerer som en ekstracellulær matrix (ECM) og aktiverer integrin delmængder. Således, hvis forskning spørgsmål involverer rolle integrin funktion i tumorvækst, bør man anvende medier eller PBS som en bærer for brystcancerceller.

I vores forsøgsopstilling, vi injicerede humane brystcancerceller (MDA-MB-231) iyverfedt pude af NSG mus. Brugen af ​​immunsvækkede mus naturligvis gør det sværere at undersøge inddragelsen af ​​immunregulatoriske gener i cancer udvikling. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at denne teknik kan også anvendes i mus med intakt immunsystem, hvis de celler, der skal injiceres har museoprindelse 23. Desuden MDA-MB-231 cellelinje er østrogen-receptor negative (ER-) derfor er virkningen af ​​hormoner i brystkræft udvikling mangler. Alligevel vores tidligere arbejde viste, at denne teknik er også muligt for ER + brystcancerceller, såsom MCF-7 13. Papers anvender denne metode til at studere tumorvækst af almindeligt anvendte brystcancercellelinier er anført nedenfor:

Selve proceduren indeholder nogle kritiske trin så godt. I modsætning til subkutane injektioner, ortotopisk injektioner involverer kirurgiske indgreb på mus. Derfor bør kirurgiske redskaber renses godt og autoklaveres. Af note, implantation af humane celler imammae fedtpuder kræver anvendelse af immundeficiente mus (fx NOD / SCID). Derfor injektioner bør fortrinsvis udføres i et biologisk sikkerhedsskab, ved hjælp af sterile instrumenter. Desuden under injektionen, nålen bør holdes på det rigtige vinkel med nålen åbningen opad. Hold nålen i denne position reducerer lækage og på denne måde lykkes injektion kan kontrolleres ved at observere hævelse af yverfedt pad. Hertil kommer, når udføre kirurgi, er det afgørende at lave et snit i nogen afstand fra brystfedtpuden for at undgå interferens af sårhelingsprocessen med tumorvækst. Imidlertid bør snittet ikke gøres for fjernt fra brystfedtpuden enten som udsætte brystfedtpuden kan være vanskeligt.

Ved at følge proceduren, skal dyrene kontrolleres regelmæssigt. På grund af kirurgi og eksponering for bedøvelsesmiddel, kan mus oplever væsentlig ubehag eller enddadø. Således den første uge efter indgrebet er kritisk og mus bør overvåges nøje. Afhængigt af væksthastighed af de implanterede celler, kan måles tumorvolumen op til 4 gange om ugen. De injicerede celler kan også være mærket med et fluorescerende protein eller luciferase, muliggør sporing af primære og metastatiske tumorceller, ved anvendelse af en lysfølsom kamera. Tumorer bør aldrig have lov til at nå meget store størrelser som sår kan forekomme, der skader tumorvæv. Dette kan hæmme korrekt immunhistokemiske analyser af tumorvæv. Når tumoren høstes, kunne man overveje hakning tumoren og dyrkning af dispergerede tumorceller at oprette en ny brystcancer cellelinje at undersøge forskelle mellem forældre- og mammay fedtpude bestået (MFP) cellelinier 11.

Afslutningsvis ortotopisk brystkræft implantation, som vi er skitseret i grønbogen er et meget nyttigt værktøj til at studere kræftrelaterede processer. En can manipulere genomet af de injicerede celler ved enten opregulering eller nedregulering af genet af interesse og kontrollere dens virkning på den primære tumorvækst, angiogenese eller metastase. Denne fremgangsmåde er nyttigt at studere protoonkogener, tumor supressors eller gener, der er involveret i EMT. Desuden kan de cellelinier injiceres genetisk modificerede mus til at undersøge effekten af ​​stromale rum i cancer progression. Vi opfordrer på det kraftigste brugen af ​​ortotopisk injektion teknik igen førnævnte brystkræft modeller på grund af sin høje sammenfatning af patofysiologisk proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bouin's solution Sigma-Aldrich HT10132 Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128 Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230 Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps Fine Science Tools 13008-12 Used for stiching
Angled forceps Electron microscopy sciences 72991-4c These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors B Braun Medicals BC056R Used to cut open the mice
Straight forceps B Braun Medicals BD025R This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice Charles River 005557 Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231 Sigma-Aldrich 92020424 Experimental cells used for injections
Oculentum simplex Teva Pharmachemie Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine Fischer Scientific 19-898-859 Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine Sigma-Aldrich X1251, K2753 Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic Schering-Plough Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM Life sciences 11995 For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate Aniara A12-8480-10 Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
  2. Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
  3. Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
  4. Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
  5. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  6. Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
  7. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
  8. Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
  9. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
  10. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
  11. Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
  12. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  13. Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
  14. Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
  15. Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
  16. Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
  17. Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
  18. Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
  19. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  20. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  21. Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
  22. Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
  23. Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
  24. Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
  25. Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
  26. Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling? Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
  27. Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).

Tags

Medicine Breast Cancer tumorvækst ortotopisk Injection Metastase
Ortotopisk Injektion af brystkræft celler i brystfedtpuden af ​​mus til at studere tumorvækst.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocatürk, B., Versteeg, H. H.More

Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.. J. Vis. Exp. (96), e51967, doi:10.3791/51967 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter