Fremstilling af rotteserum Egnet til pattedyr Hele Embryo Culture

Introduction

En række af model-dyr anvendes i udviklingsmæssige biologi til at undersøge udviklingsmæssige mekanismer på det molekylære og cellulære niveau. For eksempel har padder og fuglearter i vid udstrækning blevet anvendt som klassiske model dyr, der er egnet til direkte manipulation af embryoner, fordi disse embryoer udvikler uden for moderen. I modsætning til disse dyr, pattedyr embryoner vokse i livmoderen af ​​moderen, og væksten på senere stadier er helt afhængig af den funktion af livmoderen. Derfor er det typisk vanskeligt direkte at manipulere mammale embryoer, såsom dem fra mus og rotter i tidlige stadier. I 1960'erne Denis Ny etableret et pattedyr hel embryo kultur (WEC) teknik ved hjælp WEC apparater med en konstant forsyning ilt og varme kontrol ^1.. I WEC kan muse-og rotte-embryoner vokse ex vivo (dvs. uden for livmoderen). Selv WEC teknik ofte blev brugt i teratologi ved at tilføje forskellige chemical forbindelser i dyrkningsmediet, denne teknik er også blevet brugt i forskellige udviklingsmæssige biologiske undersøgelser for at undersøge unikke udviklingsmæssige mekanismer i pattedyr ^2-4. For eksempel er WEC kombineres med andre teknikker, såsom cellemærkning, i vildtype-og mutant embryoner ved hjælp af fluorescerende farvestof ^5, celletransplantation ⁶ og genindførsel via lipofektion ⁷ og elektroporation ^8-13.

For nylig er in utero manipulation blevet anvendt til at analysere udviklingsprocesser i gnavere embryoner på senere stadier og er blevet kombineret med elektroporeringsteknikker ^14-16. Men disse teknikker er ikke egnede til manipulation af implantation og midgestation embryoner grund vanskeligt ved at opnå nøjagtig lokal injektion af DNA-opløsningen i embryoner i de tidlige faser. Selvom ultralyd-vejledt celle transplantation og injektion af virale vektorer i tidlige embryoner (dvs., E8.5-E-9.5 i mus) i livmoderen er blevet rapporteret tidligere ^17,18, er fremragende færdigheder, der kræves for at udføre disse eksperimenter med en høj succesrate. Derfor WEC med høj tilgængelighed ex vivo har fordele med hensyn til manipulation af muse-og rotte-embryoner.

Umiddelbart centrifugeret (IC) rotteserum fremstillet ud fra hanrotter anvendes ofte til WEC medium. Når embryoner dyrkes på implantation etape (dvs. tidligere end E8.0 i musen eller E10.0 i rotte), er en blanding af syntetisk medium og IC rotteserum ofte brugt som et medium for WEC ^19. Men for at kultur embryoner på midten af drægtigheden (dvs.., E8.0-12.5 i mus embryoner eller E10.0-E14.5 i rotte embryoner), 100% serum bør anvendes som et medium, fordi der ikke i øjeblikket tilgængelige alternativ medier giver embryoner til at vokse normalt in vitro i mere end 2 dage.

Fremstillingen af ​​høj kvalitet rotteserum eret afgørende skridt for at opnå reproducerbarhed i WEC eksperimenter. Sammenlignet med forsinket centrifugering, IC har den fordel at reducere hæmolyse når serum opsamles ved at klemme fibrinkoaglet fordi de fleste af de røde blodlegemer er allerede blevet adskilt fra fibrinkoagulat. Som hæmolytisk rotteserum undlader at støtte den normale vækst af rotter og mus embryoner, udarbejdelse af serum ved hjælp af øjeblikkelig centrifugering er at foretrække frem for forberedelse hjælp forsinket centrifugering. Vores protokol indeholder to yderligere trin i forhold til andre protokoller, ^18-20 (dvs.., Lagring tappet blod på is før den første centrifugering og opretholdelse af de indsamlede blodprøver i 2 timer ved 4 ° C efter den første centrifugering). Den tidligere trin kan forsinke dannelse af blodprop, og sidstnævnte trin fremmer størkning af fibrinkoagel let klemning. Derfor kan vores protokol anvendes af begyndere. Men gengivelse blodtapning og serumudvinding nøjagtigt ved blot at henvise til protokol bøger er yderst vanskeligt ^19-21. I denne video artikel vil vi vise vores standard protokol for udarbejdelse af optimale IC rotte serum, som omfatter indsamling af blod fra den abdominale aorta hos hanrotter og udvinding af serum ved centrifugering.

Protocol

BEMÆRK: Dyreforsøg er udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Udvalget for dyreforsøg i Tohoku University School of Medicine godkendt de eksperimentelle procedurer, der er beskrevet heri.

1. Anæstesi og Laparotomi

1. For tapning anvende specifikke patogenfrie Sprague-Dawley rotter. Fast rotterne i mindst 18 timer, samtidig med at vand. Brug pensionerede mandlige opdrætter rotter ved 6-8 måneders alderen (550-650 g) til opsamling af blod.
2. Flow 2,5-4,0% isofluran, som er en inhalationsanæstesimiddel, ind i en kasse forbundet til en anæstesi apparat til at indføre anæstesi på 2,0-3,5 l / min i 10 min. Overfør rotter ind i feltet for at indføre anæstesi.
   1. Bekræft bedøvelse ved at kontrollere for tabet af respons på stimulation på poterne med pincet. Dæk næsen af ​​rotter with en maske tilsluttet en anæstesi apparatur til dybt bedøver rotterne under blodprøvetagning. Koncentrationen og strømmen opretholdes på 2,5-4,0% og 2,0-3,5 L / min.
      BEMÆRK: Halothan bør ikke anvendes til inhalation anæstesi fordi embryoner dyrket i serum, der er indsamlet fra rotter bedøvet med dette reagens udviser en forsinkelse i fosterudviklingen forhold til embryoner dyrket i serum opnået fra rotter bedøvet med isofluran ^22.
3. For at undgå forurening af pels, desinficere huden ved at hælde 70% ethanol på maven af ​​den bedøvede rotte. Saml den desinficerede hud og bugvæggen ved den nedre region med en tang og skære disse lag samtidigt mod thorax region med et par store saks for at blotlægge de indre organer. Afspejle tarmen uden for bughulen med en pincet.
4. Skær huden og bugvæggen mod bagbenene medpar store saks til yderligere at udsætte den bageste maveregionen. Afspejle det ekstra fedt uden for bughulen med en pincet.
5. Afhente visceralt fedt på midterlinjen bruger to par tænger og opdele fedt omhyggeligt i en parallel retning for at blotlægge den abdominale aorta. Gentag denne procedure for at opdele visceralt fedt i en langsgående retning til nemt at identificere forgreningen af ​​den abdominale aorta. Desuden aorta er pulserende og kan skelnes fra de tilstødende vena cava ved hjælp af denne egenskab.
6. Saml fedt omkring den abdominale aorta og forgreningen forsigtigt med to par tænger og adskille fedt på den abdominale aorta.

2.. Blodprøvetagning

1. Sæt forsigtigt spidsen af ​​en 21 G nål forbundet til en 20 ml sprøjte umiddelbart craniale til bifurkation af aorta, med facet i en nedadgående retning. Hold sprøjten med den enehånd og trække sprøjten langsomt at indsamle 15 ml blod fra en hanrotte.
2. Fjern kanylen fra sprøjten, og hæld blodet i to iskolde 10 ml sterile reagensglas (figur 1a). Hold rør på is indtil centrifugering til at forsinke dannelsen af ​​blodprop. Reducer centrifugeringstiden ved centrifugering flere rør på én gang.
3. Aflive den bedøvede rotte ved torakotomi og skære hjertet eller halshugning.

3.. Rotteserum Fremstilling

1. Centrifuger tappet blod i 5 minutter ved 1.200 xg og stuetemperatur (RT) for at adskille blodet i øvre og nedre lag (figur 1C).
2. Hold rørene ved 4 ° C i 1,5-2 timer til at fastsætte fibrinkoagulatet.
3. Saml fibrinkoaglet i det øverste lag ved hjælp af et par krumme pincet og presse fibrinklumpen at adskille serummet. Tryk derefter på fibrinprop med de buede pincet står downwards nær grænsefladen mellem de to lag (figur 1D).
4. Gentag trin 3.3 for yderligere at frigøre fibrinkoagulatet.
5. Centrifuger reagensglassene i 5 min ved 1200 xg og RT (fig. 1E).
6. Overføre forsigtigt serum i et 15 ml sterilt rør ved hjælp af en steril pipette i en laminar air flow-kabinet.
7. Centrifuger indsamlet rotteserum i 5 minutter ved 1.200 xg og RT for at fjerne eventuelle resterende røde blodlegemer.
8. Pool serum forsigtigt i en ny 15 ml steriliseret rør ved hjælp af en steril pipette til at undgå forurening med resterende røde celler i bunden af røret (fig. 1F).
9. Inkuberes serum i et vandbad ved 56 ° C i 30 minutter for at inaktivere komplementsystemet.
10. Cool rørene i rotteserum til RT i laminar luft-strømning. Serummet skal alikvoteres til 10 ml i individuelle sterile rør. Opbevar rør ved -20 ° C indtil anvendelse (figur 1 H).

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative resultater af de beskrevne procedurer til separation af blodceller og serum. Vi typisk opnå 15 ml blod fra en pensioneret hanrotte (figur 1A). Ved centrifugering, kan det opsamlede blod adskilles i et øvre lag, der indeholder serum og fibrinklynge, der er angivet med en pil og et nedre lag, der indeholder blodlegemer (figur 1C). Vigtigt er det, kan blodprøver hæmolytiske ikke adskilles i serum og blod lag (figur 1b). Efter at have forladt røret ved 4 ° C i 2 timer, bliver fibrinkoagulatet faststof. Denne størkning er bekvemt for adskillelse af serum fra fibrinkoaglet hjælp af et par buede pincet (figur 1D). Reagensglasset blev derefter centrifugeret. Fibrinkoaglet er synlig ved grænsefladen mellem serum og blod cellelag (figur 1E). Serummet fra de to reagensglas blev samlet iet nyt rør ved hjælp af en engangspipette. Vi kan få cirka 6 ml serum fra en hanrotte hvis hele proceduren er vellykket. For yderligere at fjerne røde blodlegemer, blev opsamlet serum centrifugeres igen. Eventuelle resterende røde celler udfældet på bunden af røret (fig. 1F). Vi overføres supernatanten til et nyt rør og kontrolleres farven af ​​det oprensede serum til at bedømme graden af ​​hæmolyse, selvom vi er i stand til at indsamle serummet fra det øverste lag efter centrifugering. Den ideelle rotte serum til WEC typisk udviser en lys gul farve (venstre rør i figur 1G), mens rotter serum med mild hæmolyse udviser en rødlig farve (højre rør i figur 1G). IC rotteserum kan opbevares i mindst 6-12 måneder ved -20 ° C (til venstre i figur 1 H). Serum med mild hæmolyse udviste en dybere farve end den ideelle serum når frosne (til venstre i figur 1 H).

Fig. 1. Procedurer til blod centrifugering og forberedelse af serum fra hanrotter. A) blodprøver fra en hanrotte er delt ind i to reagensglas til centrifugering. B, C) ​​Ikke-adskilte prøve (B) og ideelle separation i det øvre lag, der indeholder serum og fibrinkoaglet (pil i C) og det nedre lag indeholdende blodlegemer efter den første centrifugering. D) Fibrinklyngen presses ved hjælp af en pincet. E) serum og blod cellelag efter den anden centrifugering. Fibrinklyngen observeret ved grænseflade (pilespidser). F) Nedbør af blodceller efter den tredje centrifugering (pil). G) Den venstre rør viser ideel rotte serum med en lys gullig farve. Den rigtige rør viser rotteserum med mild hæmolyse.

Discussion

Reproducerbare resultater i WEC eksperimenter er afhængige af anvendelsen af høj kvalitet IC rotteserum og nøjagtig embryo dissektion teknik ^3. Må ikke forkorte perioden for fastende før indsamling af blod, fordi fasten er nødvendigt at standardisere glucosekoncentrationer i blodet. Hunrotter bør ikke anvendes til fremstilling af serum fordi hormonniveau ændring i hundyr ifølge estrale cyklus, og sådanne ændringer i østradiol hormoner er uegnede til embryo kulturer. Desuden bør ekstremt fede hanrotter ikke anvendes til serum forberedelse til at undgå en stor mængde af lipid forurening i blodet.

Ved afhentning af blod, først sikre sig, at farven på det arterielle blod er en klar rød farve, hvilket afspejler normal vejrtrækning under anæstesi. Nedsat vejrtrækning fører til en reduktion af mængden af ​​opsamlet blod. At komme sig i sådanne tilfælde midlertidigt reducere den hastighed, hvormed sprøjten er pulled. Det mest kritiske problem i serum forberedelse er hæmolyse. Hvis de indsamlede blodprøver udviser svær hæmolyse, blodet ikke adskilles i to lag ved centrifugering. Fordi mildt hæmolyseret serum kan støtte sub-optimal udvikling bør en sådan serum kasseres. Som hæmolyse tendens til at være fremkaldt af tvungen pres, bør sprøjten trækkes langsomt, når indsamling af blod. Det er vigtigt at undgå boblende blodet, når de indsamlede blodprøver hældes i reagensglas, hvilket øger hæmolyse.

Til kultur museembryoner kan IC serum opsamlet fra hanmus være ideelt; Men dette krav er ikke praktisk, fordi vi ikke kan få en tilstrækkelig stor mængde blod fra en mus. Når vi forbereder rotteserum vi forbereder mindst 10 pensioneret avl hanrotter. I vores laboratorium er blodprøvetagning rutinemæssigt udføres af mindst to personer: Individet blodtapningen og den enkelte bedøve og udførerførste centrifugering.

Til dato har flere undersøgelser ved hjælp af kommercielle rotte serum i WEC ved at kombinere kemisk defineret medium blevet rapporteret ^23-25. For eksempel kan en blanding af 50% kommercielt tilgængelige rotteserum og 50% DMEM understøtter normal vækst af E8.5 musefostre i 36 timer ²³ og normal vækst af E9.75 musefostre 40 hr ^24. I en anden protokol, en blanding af 50% rotteserum fås fra en anden virksomhed og 50% F12-medium suppleret med N-2 understøtter også korrekt vækst af E7.5 og E8.5 musefostre for 24 hr ^25. Det er dog fortsat uklart, om disse kombinatoriske medier er egnet til dyrkning af rotter og mus embryoner på senere faser, såsom E11.5-E12.5 i mus og E13.5-E14.5 hos rotter. WEC undersøgelser ved hjælp af forskellige alternative medier i stedet for rotte serum er også rapporteret ^26-28. For eksempel kan en kombination af DMEM/F12 og 20% ​​føtalt bovint serum (FBS) støtter udvikling af rotte embryoner fra E11.5 for 28 hr ^26. Men dette medium er ikke egnet for rotte-embryo kultur fra E10.5 for 28 hr ^26. Derfor mener vi, at den normale vækst af embryoner i medium indeholdende FBS er afhængig af fosterstadiet af embryonerne.

WEC anvendelse af serum-frit dyrkningsmedier kun består af definerede reagenser, herunder kommercielt tilgængelige embryonale stamceller medier, bovint serumalbumin, og N-2-supplement er blevet rapporteret. Dette medie understøtter kultur E10.5 mus embryoner til 16-40 hr ^{27, 28.} Morre-Scott et al. Påvist, at krone-til-rump størrelse museembryoer dyrket i 24 timer er væsentligt mindre end E11 .5 embryoner dyrket i livmoderen. Men de vigtigste strukturer, såsom somitter og dorsalrodsganglier synes normal i disse dyrkede embryoner. På den anden side, Kalaskar og Lauderdale rapporterede, at 60% af de undersøgte i dette medium embryoner udviste normenal udvikling 18 timer senere, men hastigheden af ​​en god udvikling i embryoner dyrket i yderligere 20-22 hr faldet til 30-40%. I modsætning til disse studier kan vi med succes reproducere god udvikling af muse-og rotte-embryoner dyrket i 100% IC rotteserum fremstillet ved hjælp af vores protokol for to dage (dvs.. Ca 48 timer) fra E12.5 rotter ⁶ eller E10.5 i mus ⁸ ved at ændre mediet gang på 24 timer. Disse resultater tyder på, at vores fremgangsmåde til fremstilling af IC rotteserum er anvendelig til en bred vifte af eksperimenter, der anvender pattedyr WECat forskellige fosterstadiet. Derfor håber vi, at vores video protokol vil hjælpe nye forskere præsentere eksperimenter med WEC til deres laboratorier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Abbott	B506	For rat anesthesia.
Large scissors	Napox	B-7H	Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.
Curved forceps	Napox	A-3-2	Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat	Charles Rivers Laboratories		Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml)	TERUMO	SS-29ESZ
Needle (21 G x 5/8")	TERUMO	NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml)	ASIAKIZAI	1101C000B-10	For collection of boold
Sterile disposable pipette	Eiken Chemical	CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)	Falcon	2196