Introduction
모델 동물의 다양한 분자 및 세포 수준에서 발달 메커니즘을 조사하기 위해 발달 생물학에 사용됩니다. 예를 들어, 양서류와 조류 종은 널리 이러한 태아가 어머니의 외부 개발하기 때문에 태아의 직접 조작에 적합한 클래식 모델 동물로 사용되어왔다. 이 동물과는 달리, 포유류의 태아는 엄마의 자궁에서 성장하고, 이후 단계에서의 성장은 자궁의 기능에 결정적으로 의존한다. 따라서, 직접적 초기 단계에서 마우스 및 래트에서 것과 포유류 배아를 조작하는 통상적 어렵다. 1960 년대에, 데니스 새로운 지속적인 산소 공급 및 열 제어 1 WEC 장치를 사용하여 포유류의 전체 배아 문화 (WEC) 기술을 설립했다. WEC에서, 마우스 및 쥐의 배아는 생체, (즉, 자궁의 이상으로) 증가 할 수 있습니다. WEC 기술은 종종 다양한 Chemic의를 추가하여 기형에 사용되었지만AL은 배양액에 화합물이 기술은 또한 포유 동물 2-4에서 고유 발달 메카니즘을 조사하기 위해 다양한 개발 생물학 연구에서 사용되었다. 예를 들어, WEC는 형광 염료 4.0, 세포 이식 (6) 및 리포 펙션 (7) 및 일렉트로 8-13 통한 유전자 도입을 이용하여 야생형과 돌연변이 등의 배아 세포 라벨링 등의 다른 기술과 결합된다.
최근 자궁 조작에 나중 단계에서 쥐의 배아에서 발달 과정을 분석하는 데 사용되었으며, 일렉트로 기술 14 ~ 16과 결합되어 있습니다. 그러나, 이들 기술은 초기 단계 배아에 DNA 용액의 정확한 로컬 주입을 달성 어려움으로 인해 postimplantation 및 midgestation 배아의 조작에 적합하지 않다. 비록 초기 배아 (에 초음파 유도 세포 이식 및 바이러스 벡터를 주입 즉,, E8.5-E-9.5 마우스의) 자궁 내 이전에 17, 18, 우수한 기술은 높은 성공률로이 실험을 수행하는 데 필요한보고되었습니다. 따라서, 높은 접근성 생체와 WEC는 마우스와 쥐 배아의 조작에 대한 장점이 있습니다.
수컷 쥐에서 준비 즉시 원심 분리 (IC) 쥐의 혈청은 종종 WEC 매체에 사용됩니다. 배아 (쥐 마우스 나 E10.0에서 E8.0 이전 즉,) postimplantation 단계에서 배양하면, 합성 중간 IC 쥐 혈청의 혼합물은 종종 WEC 19을위한 매체로 사용됩니다. 더 현재 대안 미디어가 할 수 없기 때문에 그러나, 중반 임신에서 문화 배아에 (즉., E8.0 12.5 마우스 배아 또는 쥐의 배아에서 E10.0-E14.5에서), 100 %의 혈청 매체로 사용한다 2 일 이상 체외에서 정상적으로 성장하는 배아.
고품질 쥐 혈청의 제조는WEC 실험에서 재현성을 달성하기위한 중요한 단계. 연기를 원심 분리에 비해, IC는 적혈구의 대부분이 이미 피브린 응괴로부터 분리 되었기 때문에 혈청 피브린 응괴를 짜내 수집 될 때 용혈을 줄이는 이점이있다. 용혈성 쥐의 혈청은 래트 및 마우스 배아의 정상적인 성장을 지원하는 데 실패 할 때, 즉시 원심 분리하여 혈청을 준비 지연 원심 분리를 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 우리의 프로토콜이 다른 프로토콜에 비해 두 단계를 추가로 포함 18 ~ 20 (예., 이전에 첫 번째 원심 분리에 얼음에 수집 된 혈액을 저장하고 처음으로 원심 분리 한 후 4 ° C에서 2 시간 동안 수집 된 혈액 샘플을 유지). 전반 단계는 혈병의 형성을 지연시킬 수 있고, 후자의 단계는 락 스퀴즈 피브린 응괴의 응고를 촉진시킨다. 따라서, 우리의 프로토콜은 초보자를 사용할 수 있습니다. 그러나, 재생 채혈하고 혈청단순히 프로토콜 책을 참조하여 정확하게 추출은 19 ~ 21 매우 어렵습니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 수컷 쥐와 원심 분리하여 혈청을 추출의 복부 대동맥에서 채혈을 포함 최적의 IC 쥐 혈청의 준비를위한 우리의 표준 프로토콜을 보여줍니다.
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Protocol
참고 : 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하였다. 의학의 동북 대학 의과 대학의 동물 실험에 대한위원회는 여기에 기술 된 실험 절차를 승인했다.
1. 마취와 개복술
- 혈액 수집의 경우, 특정 병원균이없는 수컷 흰쥐를 사용합니다. 물을 제공하는 동안 적어도 18 시간 동안 쥐를 빨리. 혈액을 수집하기 위해 연령 (550-650그램) 6-8 개월에 은퇴 한 남성 개종 쥐를 사용합니다.
- 10 분 동안 2.0-3.5 L / min으로 마취를 소개하는 마취 장치에 연결 상자에, 흡입 마취제 2.5-4.0 % 이소 플루 란 (isoflurane)을, 흐름. 마취를 소개하는 상자에 쥐를 전송합니다.
- 집게와 발에 자극에 대한 반응의 손실을 확인하여 마취를 확인합니다. 쥐 위스콘신의 코를 커버깊게 채혈 동안 래트를 마취 마취 장치에 접속 마스크를 토륨. 농도 및 유량은 각각 2.5-4.0 %에서 유지 2.0-3.5 L / 분됩니다.
참고 : 배아이 시약 전시 이소 플루 란 (22) 마취 쥐에서 얻은 혈청에서 배양 된 배아에 비해 배아 발달의 지연으로 마취 쥐에서 수집 된 혈청에서 배양하기 때문에 할로 세인은 흡입 마취에 사용해서는 안된다.
- 집게와 발에 자극에 대한 반응의 손실을 확인하여 마취를 확인합니다. 쥐 위스콘신의 코를 커버깊게 채혈 동안 래트를 마취 마취 장치에 접속 마스크를 토륨. 농도 및 유량은 각각 2.5-4.0 %에서 유지 2.0-3.5 L / 분됩니다.
- 모피의 오염을 방지하기 위해, 마취 된 쥐의 복부에 70 % 에탄올을 주입하여 피부를 소독. 포셉 한 쌍의 하부 영역에서 소독 된 피부와 복부 벽을 선택하고 내부 장기를 노출하는 큰 가위로 가슴 지역으로 동시에 이러한 레이어를 잘라. 포셉 한 쌍의 복강 외부의 창자를 반영합니다.
- 와 함께 두 다리쪽으로 피부와 복부 벽을 잘라큰 가위의 쌍은 더 뒤 복부를 노출합니다. 포셉 한 쌍의 복강 외부에 여분의 지방을 반영한다.
- 포셉 두 쌍을 사용하여 중간 선에서 내장 지방을 선택하고 복부 대동맥을 노출 평행 방향으로 조심스럽게 지방을 분할. 쉽게 복부 대동맥의 분기점을 식별 할 수있는 길이 방향으로 내장 지방을 분할하려면이 절차를 반복합니다. 또, 대동맥 박동성이며,이 특성을 이용하여 인접 대정맥으로부터 구별 될 수있다.
- 포셉 두 쌍의 신중 복부 대동맥 주위에 지방과 분기를 들고 복부 대동맥에 지방을 분리합니다.
2. 혈액 수집
- 조심스럽게 아래 방향으로 경사와 대동맥의 분기점, 즉시 두개골 20 ML의 주사기에 연결된 21 G 바늘의 끝 부분을 삽입합니다. 하나와 주사기를 잡고손과 남성 쥐의 혈액 15 ㎖를 수집하기 위해 천천히 주사기를 잡아 당깁니다.
- 주사기에서 바늘을 제거하고, 두 개의 얼음처럼 차가운 10-ML 멸균 테스트 튜브 (그림 1A)에 혈액을 붓는다. 원심은 혈액 응고의 형성을 지연 할 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. 한 번에 여러 개의 튜브를 원심 분리하여 원심 분리 시간을 줄일 수 있습니다.
- 개흉술 및 심장이나 잘린 절단에 의해 마취 된 쥐를 안락사.
3. 쥐 혈청 준비
- 상부층과 하부층 (도 1C)에 혈액을 분리하기 위해 1200 XG 실온 (RT)에서 5 분 동안 수집 된 혈액을 원심 분리기.
- 섬유소의 응고를 해결하기 위해 1.5 ~ 2 시간 동안 4 ° C에서 튜브를 유지합니다.
- 곡선 포셉 한 쌍을 사용하여 상위 계층에있는 섬유소의 응고를 선택하고, 혈청을 분리하는 섬유소 응고를 짠다. 그런 다음 할 일에 직면 곡선 집게와 섬유소 응고를 눌러두 개의 레이어 (그림 1D) 사이의 인터페이스 근처 wnwards.
- 또한 섬유소의 응고를 분리하는 단계 3.3를 반복합니다.
- 1,200 XG 및 RT (그림 1E)에서 5 분 동안 테스트 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 층류 공기 흐름 캐비닛에 멸균 피펫을 사용하여 15 ㎖의 멸균 튜브에 혈청을 전송합니다.
- 남아있는 붉은 세포를 제거하기 위해 1,200 XG와 RT에서 5 분 동안 수집 된 쥐의 혈청을 원심 분리기.
- 튜브 (그림 1 층)의 하단에 잔류 붉은 세포에 의한 오염을 방지하기 위해 멸균 피펫을 사용하여 관을 소독 새로운 15 ㎖의주의 혈청 해변.
- 보체계를 실활 30 분 동안 56 ℃에서 수욕 혈청을 배양한다.
- 층류 공기 흐름 캐비닛에 RT로 쥐의 혈청 튜브를 냉각. 혈청 개별 멸균 튜브에 10 ml로 분주합니다. 사용 (그림 1H)까지 -20 ° C에서 튜브를 저장합니다.
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Representative Results
도 1은 혈액 세포 및 혈청의 분리에 개시된 방법의 대표적인 결과를 나타낸다. 우리는 일반적으로 은퇴 한 남성 쥐 (그림 1A)에서 혈액 15 ㎖를 얻을 수 있습니다. 원심 분리에 의해 수집 된 혈액 혈청과 화살표로 표시되는 피브린 응고, 및 혈액 세포 (도 1c)를 포함하는 하부층을 포함하는 상부 층으로 분리 될 수있다. 중요한 사실은, 용혈성 혈액 샘플은 혈청, 혈액 층 (도 1b)로 분리 될 수 없다. 2 시간 동안 4 ° C에서 튜브를 떠난 후, 섬유소 응고 고체가됩니다. 이 응고 곡선 포셉 한 쌍의 (그림 1D)를 사용하여 섬유소 응고에서 혈청을 분리하는 데 편리합니다. 시험관이어서 원심 분리 하였다. 섬유소 응고 혈청과 혈구 층 (그림 1E) 사이의 인터페이스에서 볼 수 있습니다. 두 개의 테스트 튜브에서 혈청에 정리 된일회용 피펫을 사용하여 새 관. 전체 절차가 성공하면 우리는 수컷 쥐에서 혈청의 약 6 ml의를 얻을 수 있습니다. 더 빨강 세포를 제거하기 위해, 수집 된 혈청을 다시 원심 분리 하였다. 나머지 적혈구 튜브 (도 1F)의 하단에 침전. 우리는 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 우리는 원심 분리 후 상층에서 혈청을 수집 할 수있는 경우에도 용혈의 정도를 판단하기 위해 정제 된 혈청의 색상을 선택. 가벼운 용혈과 쥐의 혈청은 분홍빛이 도는 색 (그림 1G에 바로 관) 전시 동안 WEC위한 이상적인 쥐의 혈청은 일반적으로 (그림 1G에 튜브를 왼쪽) 밝은 노란색을 나타낸다. IC 쥐의 혈청 (그림 상반기 왼쪽) -20 ° C에서 적어도 6-12개월 저장할 수 있습니다. 냉동 때 가벼운 용혈과 혈청 (그림 1H에 남아있는) 이상적인 혈청보다 더 깊은 색상을 나타내었다.
그림 1. 혈액을 원심 분리 및 수컷 쥐에서 혈청의 준비를위한 절차. A) 수컷 래트로부터 수집 된 혈액 샘플). 원심 분리를위한 두 개의 시험관으로 등분 B, C) 비 분리 된 샘플 (B) 및 혈청 및 피브린 응괴를 함유 상층에 이상적인 분리 (C 화살표 아르 및 제 원심. D) 후에 혈액 세포를 함유하는 하층 피브린 응괴는 포셉의 쌍을 사용하여 압착한다. E) 혈청과 적혈구 층을 초 원심 분리 후. 혈액 세포의 섬유소 응고가 인터페이스 (화살촉)에서 관찰된다. F) 강수량 세 번째 원심 분리 (화살표). G) 후 왼쪽 튜브는 빛 노란 색으로 이상적인 쥐의 혈청을 보여줍니다. 오른쪽 관은 약한 용혈과 쥐의 혈청을 보여줍니다.
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Discussion
WEC 실험 결과의 재현성이 높은 품질의 IC 쥐의 혈청과 정확한 배아 해부 기술 3의 사용에 의존하고 있습니다. 금식은 혈액에있는 포도당의 농도를 표준화 할 필요가 있기 때문에 혈액을 수집하기 전에 금식의 기간을 단축하지 마십시오. 호르몬 수준은 발정주기에 따른 여성 동물에서 변화하기 때문에 암컷 쥐 혈청의 제조에 사용되지 않아야하고, 에스트라 디올과 같은 호르몬 변화는 배아 배양에 부적합하다. 또, 극단적 지방산 수컷 래트 혈액 지질 오염 고액 피하기 위해 혈청 제조에 사용되어서는 안된다.
피를 수집 할 때, 먼저 동맥 혈액의 색이 마취 정상적인 호흡을 반영, 밝은 붉은 색 있는지 확인합니다. 감소 호흡 수집 혈액의 양의 감소에 이르게한다. 이러한 경우에 복구하려면 일시적 주사기 PU되는 속도를 줄이기LLED. 혈청 준비에서 가장 중요한 문제는 용혈입니다. 수집 된 혈액 샘플이 심한 용혈을 나타낼 경우에, 혈액은 원심 분리에 의해 2 층으로 분리하지 못한다. 약간 용혈 혈청 차선의 개발을 지원하는 경우가 있기 때문에, 혈청은 폐기되어야한다. 용혈 강제 압력에 의해 유도되는 경향으로 혈액을 수집 할 때, 주사기 천천히 끌어한다. 이는 수집 된 혈액 샘플은 용혈이 높아, 테스트 튜브에 붓고 때 혈액을 버블 링 피하는 것이 중요하다.
문화 마우스 배아에, 수컷 마우스에서 수집 IC 혈청이 이상적 일 수있다; 우리가 마우스에서 혈액의 충분한 양을 확보 할 수 있기 때문에, 이러한 요건은 실용적이지 않다. 우리가 쥐의 혈청을 준비 할 때, 우리는 적어도 10은 수컷 쥐를 사육 은퇴 준비합니다. 연구실에서는 채혈 일상적 두 명 이상에 의해 수행된다 : 개인은 혈액 및 개별 마취를 수집하고 수행처음으로 원심 분리.
지금까지 화학적 매체를 결합하여 WEC 상업 쥐의 혈청을 사용하여 여러 연구는 23 ~ 25을보고되었습니다. 예를 들어, 50 % 시판 래트 혈청 DMEM 및 50 %의 혼합물을 36 시간 23 시간 40 24 E9.75 마우스 배아의 정상적인 성장 E8.5 마우스 배아의 정상적인 성장을 지원한다. 다른 프로토콜에서 N-2로 보충 다른 회사에 50 %의 F12 매체에서 사용 가능한 50 %의 쥐의 혈청으로 구성된 혼합물은 24 시간 25 E7.5과 E8.5 마우스 배아의 적절한 성장을 지원합니다. 그러나, 이러한 조합 미디어는 생쥐의 E11.5-E12.5 쥐에 E13.5-E14.5 등의 나중 단계에서, 쥐, 마우스 배아의 배양에 적합 여부를 불분명하게 남아있다. 대신 쥐 혈청의 다양한 대안 미디어를 사용하여 WEC 연구는 또한 26 일부터 28 일을보고되었습니다. 예를 들어, DMEM/F12 및 20 % 소 태아 혈청 (FBS)의 조합을 지원 DEVEL28 시간 26 E11.5에서 쥐의 배아의 opment. 그러나이 매체는 28 시간 26 E10.5에서 쥐의 배아 배양에 적합하지 않습니다. 따라서, 우리는 FBS가 포함 된 배지에서 태아의 정상적인 성장이 배아의 배아 단계에 따라 달라집니다 있다고 생각합니다.
에서만 시판 배아 줄기 세포 매체 소 혈청 알부민, 및 N-2 사 등 정의 시약 구성된 무 혈청 배지를 이용하여 WEC가보고되었다. 이 매체는 16-40 시간 27 E10.5 마우스 배아의 문화를 지원, 28. Morre-스콧, 등. 24 시간 배양 한 마우스 배아의 왕관 - 투 - 엉덩이 크기는 E11보다 훨씬 작 시연 자궁 내에서 성장 .5 배아. 그러나, somites과 후근 신경절과 같은 주요 구조는,이 배양 된 배아의 정상적인 나타납니다. 한편, Kalaskar과 로더데일이 매체에 테스트 배아의 60 %가 표준을 전시보고알 개발 18 시간 후,하지만 추가 20 ~ 22 시간 동안 배양 한 배아에서 좋은 개발의 비율 30 ~ 40 %로 떨어졌다. 이러한 연구와는 달리, 우리는 성공적으로 이틀 동안 우리의 프로토콜을 사용하여 생산 100 % IC 쥐의 혈청에서 배양 마우스와 쥐 배아의 좋은 개발 재현 할 수 있습니다 (즉., 약 48 시간)을 E12.5에서 쥐 6 E10.5에 24 시간에 한 번 매체를 변경하여 마우스 8. 이러한 결과는 IC 쥐의 혈청을 제조하는 우리의 방법은 포유 동물 WECat 다른 배아 단계를 적용하는 실험의 다양한 유용하는 것이 좋습니다. 따라서, 우리는 우리의 비디오 프로토콜이 새로운 연구자들이 실험실에 WEC를 사용하여 실험을 소개하는 데 도움이되기를 바랍니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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