Introduction
Uma variedade de modelos animais são utilizados na biologia do desenvolvimento para investigar os mecanismos de desenvolvimento aos níveis celular e molecular. Por exemplo, as espécies de anfíbios e de aves foram amplamente utilizados como animais modelo clássicas que são adequados para a manipulação directa de embriões porque estes embriões se desenvolvem fora da mãe. Em contraste a estes animais, embriões de mamíferos crescem no útero da mãe, e em fases posteriores do crescimento é crucialmente dependente da função do útero. Portanto, é normalmente difícil de manipular diretamente embriões de mamíferos, como os do rato e rato em estágios iniciais. Na década de 1960, Denis New estabeleceu um conjunto de mamíferos cultura de embriões (WEC) técnica usando aparatos WEC com um suprimento contínuo de oxigênio e controle de calor 1. Em WEC, ratinhos e ratos de embriões podem crescer ex vivo (isto é, fora do útero). Embora a técnica WEC foi muitas vezes utilizado em teratologia, adicionando vários isquêmicaai os compostos no meio de cultura, esta técnica também tem sido utilizado em vários estudos de biologia de desenvolvimento para examinar os mecanismos de desenvolvimento únicos em mamíferos 2-4. Por exemplo, o CME é combinado com outras técnicas, tais como a marcação celular, no tipo selvagem e mutantes embriões utilizando corante fluorescente 5, 6, o transplante de células, e introdução de genes através de lipofecção e 7 electroporação 8-13.
Recentemente, na manipulação útero foi usado para analisar os processos de desenvolvimento em embriões de roedores em fases posteriores e foi combinado com as técnicas de electroporação 14-16. No entanto, estas técnicas não são adequadas para a manipulação de pós-implantação e midgestation embriões, devido à dificuldade em atingir o local de injecção exacta da solução de ADN em embriões nas fases iniciais. Embora o transplante de células guiadas por ultra-som e injeção de vetores virais em embriões (ie, Têm sido relatados E8.5-E-9.5 no mouse) no útero previamente 17,18, excelentes habilidades são necessários para realizar esses experimentos com uma elevada taxa de sucesso. Portanto, o CME com elevada acessibilidade ex vivo tem vantagens no que diz respeito à manipulação de embriões de ratinho e de rato.
Centrifugadas imediatamente (IC) soro de rato preparada a partir de ratos machos é usado frequentemente para o meio WEC. Quando os embriões são cultivados na fase de pós-implantação (ou seja, mais cedo do que E8.0 no rato ou no rato E10.0), uma mistura de meio sintético e IC de soro de rato é frequentemente utilizado como um meio para WEC 19. No entanto, a cultura de embriões em meados de gestação (ou seja., E8.0-12.5 em embriões de camundongos ou E10.0-E14.5 em embriões de ratos), com 100% de soro deve ser usado como um meio, porque nenhuma mídia alternativa disponível atualmente permite embriões para crescer normalmente in vitro durante mais de 2 dias.
A preparação do soro de rato de alta qualidade éum passo fundamental para alcançar reprodutibilidade nos experimentos do CME. Comparado a centrifugação retardada, IC tem a vantagem de reduzir a hemólise, quando o soro é recolhido por aperto do coágulo de fibrina, porque a maior parte dos glóbulos vermelhos já têm sido separado do coágulo de fibrina. Como soro de rato hemolítico não suporta o crescimento normal de embriões de rato e de ratinho, a preparação do soro usando centrifugação imediata é preferível para a preparação usando centrifugação retardada. Nosso protocolo contém dois passos adicionais, em comparação com outros protocolos de 18-20 (ou seja., Armazenar o sangue recolhido em gelo antes da primeira centrifugação e mantendo as amostras de sangue recolhidas durante 2 horas a 4 ° C após a primeira centrifugação). A etapa anterior pode atrasar a formação do coágulo de sangue, e o último passo promove a solidificação do coágulo de fibrina para fácil espremer. Por isso, o nosso protocolo pode ser utilizado por principiantes. No entanto, a coleta de sangue e soro reproduzindoextração de precisão, simplesmente referindo-se a livros de protocolo é extremamente difícil 19-21. Neste artigo de vídeo, demonstramos nosso protocolo padrão para a preparação de IC óptima de soro de rato, que inclui a recolha de sangue a partir da aorta abdominal de ratos machos e de extracção do soro por centrifugação.
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Protocol
NOTA: Experimentos em animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O Comitê de Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Tohoku aprovou os procedimentos experimentais aqui descritos.
1. Anestesia e Laparotomia
- Para a coleta de sangue, usar ratos machos específicos isentos de agentes patogénicos Sprague-Dawley. Rápido os ratos, pelo menos, 18 horas, enquanto o fornecimento de água. Use ratos reprodutores masculinos reformados em 6-8 meses de idade (550-650 g) para a recolha de sangue.
- Fluxo de 2,5-4,0% de isoflurano, o que é um anestésico por inalação, numa caixa ligada a um aparelho de anestesia para introduzir anestesia em 2,0-3,5 L / min durante 10 min. Transferência de ratos na caixa para introduzir a anestesia.
- Confirmar anestesiados verificando a perda de resposta à estimulação com as patas com uma pinça. Cubra o nariz do wi ratosth uma máscara ligada a um aparelho de anestesia para anestesiar profundamente os ratos durante a recolha de sangue. A concentração e o fluxo são mantidos a 2,5-4,0% e 2,0-3,5 l / min, respectivamente.
NOTA: halotano não deve ser utilizada para a anestesia por inalação porque os embriões cultivados no soro que é recolhida a partir de ratos anestesiados com esta exposição reagente um atraso no desenvolvimento embrionário em comparação com embriões cultivados em soro obtido a partir de ratos anestesiados com isoflurano 22.
- Confirmar anestesiados verificando a perda de resposta à estimulação com as patas com uma pinça. Cubra o nariz do wi ratosth uma máscara ligada a um aparelho de anestesia para anestesiar profundamente os ratos durante a recolha de sangue. A concentração e o fluxo são mantidos a 2,5-4,0% e 2,0-3,5 l / min, respectivamente.
- Para evitar a contaminação da pele, desinfectar a pele por vazamento de etanol a 70% para o abdómen de ratos anestesiados. Escolha-se a pele desinfectada e parede abdominal na região inferior, com um par de pinças e cortar estas camadas simultaneamente para a região do tórax, com um par de tesouras grandes para expor os órgãos internos. Reflectir o intestino fora da cavidade abdominal com um par de pinças.
- Cortar a pele ea parede abdominal para os membros posteriores compar de tesouras grandes para expor ainda mais a região abdominal posterior. Reflectir a gordura extra no exterior da cavidade abdominal com um par de pinças.
- Escolha-se a gordura visceral na linha média usando dois pares de pinças e dividir a gordura cuidadosamente numa direcção paralela para expor a aorta abdominal. Repetir este procedimento para dividir a gordura visceral no sentido longitudinal para identificar facilmente a bifurcação da aorta abdominal. Além disso, a aorta é pulsátil e pode ser distinguida a partir da veia cava adjacente usando esta característica.
- Escolha-se a gordura em torno da aorta abdominal e a bifurcação cuidadosamente com duas pinças e separar a gordura na aorta abdominal.
2. Coleta de Sangue
- Cuidadosamente insira a ponta de uma agulha G 21, ligado a uma seringa de 20 ml imediatamente craniana à bifurcação da aorta, com o chanfro no sentido descendente. Segure a seringa com umalado, e puxe a seringa lentamente para coletar 15 ml de sangue de um rato macho.
- Retire a agulha da seringa, e derramar o sangue em duas de 10 ml tubos de ensaio estéreis geladas (Figura 1A). Manter os tubos em gelo até à centrifugação para retardar a formação do coágulo de sangue. Reduzir o tempo de centrifugação por vários tubos de centrifugação de uma só vez.
- Eutanásia rato anestesiado por toracotomia e cortando o coração ou decapitação.
3. Rato Soro Preparação
- Centrifuga-se o sangue recolhido durante 5 min a 1200 x g e à temperatura ambiente (RT) para separar o sangue nas camadas inferiores e superiores (Figura 1C).
- Manter os tubos a 4 ° C durante 1,5-2 horas para corrigir o coágulo de fibrina.
- Escolha-se o coágulo de fibrina na camada superior usando um par de pinças curvas, e espremer o coágulo de fibrina para separar o soro. Em seguida, pressione o coágulo de fibrina com as pinças curvas enfrentam tarefaswnwards perto da interface entre as duas camadas (Figura 1D).
- Repetir o passo 3.3 para separar ainda mais o coágulo de fibrina.
- Centrifugar os tubos de ensaio durante 5 min a 1200 xg e RT (Figura 1E).
- Transferir cuidadosamente o soro para um tubo de 15 ml estéril, usando uma pipeta estéril numa câmara de fluxo de ar laminar.
- Centrifuga-se o soro de rato recolhidos durante 5 min a 1200 xg e RT a remover todos os restantes glóbulos vermelhos.
- Piscina do soro cuidadosamente em um novo 15 ml esterilizados tubo com uma pipeta estéril para evitar a contaminação por células vermelhas residuais na parte inferior do tubo (Figura 1F).
- Incubar o soro em um banho de água a 56 ° C durante 30 minutos, para inactivar o sistema do complemento.
- Arrefecer os tubos de soro de rato para RT no gabinete laminar do fluxo de ar. O soro deve ser aliquotado a 10 ml em tubos estéreis individuais. Armazenar os tubos a -20 ° C até à sua utilização (Figura 1H).
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Representative Results
A Figura 1 mostra os resultados representativos dos procedimentos descritos para a separação das células do sangue e do soro. Nós normalmente obter 15 ml de sangue a partir de um rato macho reformado (Figura 1A). Por centrifugação, o sangue recolhido pode ser separada numa camada superior que contém o soro e o coágulo de fibrina, o qual é indicado com uma seta, e uma camada inferior contendo células de sangue (Figura 1C). Importante, as amostras de sangue não hemolíticas pode ser separada em camadas e soro do sangue (Figura 1B). Depois de deixar o tubo a 4 ° C durante 2 horas, o coágulo de fibrina se torna sólido. Esta solidificação é conveniente para a separação do soro a partir do coágulo de fibrina com um par de pinças curvas (Figura 1D). O tubo de ensaio foi em seguida centrifugada. O coágulo de fibrina é visível na interface entre o soro e as camadas de células do sangue (Figura 1E). O soro a partir dos dois tubos de ensaio foram recolhidas emum novo tubo, usando uma pipeta descartável. Podemos obter cerca de 6 ml de soro de um rato macho, se todo o procedimento é bem sucedido. Para remover ainda mais as células vermelhas, o soro colhido foi centrifugado outra vez. Quaisquer eritrócitos restantes precipitado no fundo do tubo (Figura 1F). Nós transferimos o sobrenadante para um novo tubo e verificou a cor do soro purificado para julgar o grau de hemólise, embora sejamos capazes de coletar o soro da camada superior após a centrifugação. O soro de rato ideal para WEC geralmente exibe uma cor amarelo-claro (tubo de esquerda na Figura 1G), enquanto soro de rato com hemólise leve apresenta uma cor rosada (tubo de direita na Figura 1G). IC de soro de rato pode ser armazenado durante pelo menos 6-12 meses a -20 ° C (à esquerda na Figura 1H). O soro com hemólise leve exibiu uma cor mais intensa do que o ideal, quando o soro congelado (à esquerda na Figura 1H).
Figura 1. Procedimentos para a centrifugação de sangue e preparação do soro de ratos macho. A) As amostras de sangue colhidas a partir de um rato macho são divididas igualmente em dois tubos de ensaio de centrifugação. B, C) da amostra não-separados (B) e de separação ideal para a camada superior contendo o soro e o coágulo de fibrina (seta em C) e a camada inferior contendo as células sanguíneas após a primeira centrifugação. D) O coágulo de fibrina é comprimida usando um par de fórceps. E) As camadas de soro e de células do sangue após a segunda centrifugação. O coágulo de fibrina é observada na interface (pontas de seta) F) Precipitação de células sanguíneas. Após a terceira centrifugação (seta). G) O tubo da esquerda mostra soro de rato ideal, com uma cor ligeiramente amarelada. O tubo da direita mostra soro de rato com hemólise leve.
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Discussion
Resultados reprodutíveis em experiências CME são dependentes da utilização de alta qualidade IC de soro de rato e precisas técnica de dissecção embrião 3. Não encurte o período de jejum antes de coletar o sangue, porque o jejum é necessário padronizar as concentrações de glicose no sangue. Os ratos fêmea não deve ser utilizado para a preparação do soro, porque os níveis de hormona de alterar em animais do sexo feminino de acordo com o ciclo estral, e tais variações de hormonas estradiol são inadequados para culturas de embriões. Além disso, os ratos machos extremamente gordos não deve ser utilizada para a preparação de soro a fim de evitar uma grande quantidade de contaminação de lípidos no sangue.
Ao coletar o sangue, primeiro verifique se a cor do sangue arterial é uma cor vermelho brilhante, refletindo a respiração normal sob anestesia. Diminuição da respiração leva a uma redução da quantidade de sangue recolhida. Para recuperar, em tais casos, reduzir temporariamente a velocidade a que a seringa é pulled. O problema mais crítico na preparação do soro é a hemólise. Se as amostras de sangue recolhidas apresentam grave hemólise, o sangue não consegue ser separada em duas camadas por centrifugação. Porque soro levemente hemólise pode apoiar o desenvolvimento de sub-óptima, como soro deve ser descartada. Como a hemólise tende a ser induzida pela pressão forçada, a seringa deve ser puxado lentamente ao recolher o sangue. É importante evitar o borbulhamento do sangue quando as amostras de sangue recolhidas são vertida em tubos de ensaio, o que aumenta a hemólise.
Para embriões cultura do rato, IC soro coletadas de camundongos machos pode ser ideal; no entanto, este requisito não é prático, porque não podemos obter um grande volume suficiente de sangue a partir de um mouse. Quando preparamos soro de rato, preparamos pelo menos 10 aposentados reprodução ratos machos. No nosso laboratório, de recolha de sangue é rotineiramente realizado por, pelo menos, dois indivíduos: o indivíduo a recolha do sangue e do anestesiante individual e realizando oprimeira centrifugação.
Até o momento, vários estudos utilizando soro de rato comercial no WEC, combinando meio quimicamente definido foram relatados 23-25. Por exemplo, uma mistura de 50% de soro de rato disponíveis comercialmente e 50% de DMEM suporta o crescimento normal dos embriões E8.5 rato durante 36 h 23 e o crescimento normal dos embriões E9.75 rato durante 40 horas 24. Em um outro protocolo, uma mistura composta por 50% de soro de rato disponíveis a partir de uma outra companhia e 50% de meio F12 suplementado com N-2 também suporta o crescimento adequado de embriões E7.5 e E8.5 rato durante 24 horas 25. No entanto, ainda não está claro se esses meios combinatórios são adequados para o cultivo de embriões de ratos e camundongos em fases posteriores, como E11.5-E12.5 em ratos e E13.5-E14.5 em ratos. Estudos do CME por vários meios alternativos, em vez de soro de rato também foram relatados 26-28. Por exemplo, uma combinação de DMEM/F12 e 20% de soro fetal bovino (FBS) apoia o desenvolvimentovolvimento de embriões de ratos de E11.5 para 28 h 26. No entanto, este meio não é adequado para a cultura de embriões de rato a partir de E10.5 de 28 h 26. Portanto, cremos que o crescimento normal dos embriões em meio contendo FBS a é dependente da fase embrionária dos embriões.
WEC utilizando meios de cultura isentos de soro, composto apenas de reagentes definidos, incluindo os meios de comunicação disponíveis comercialmente em células estaminais embrionárias, albumina de soro bovino, e N-2 suplemento foram relatados. Este meio de suporte da cultura de embriões de rato E10.5 para 16-40 hr 27, 28. Morre-Scott, et al. Demonstraram que o tamanho da copa para garupa de embriões de rato em cultura durante 24 horas é significativamente menor do que a de E11 0,5 embriões cultivados in utero. No entanto, as estruturas principais, tais como somitos e gânglios da raiz dorsal, parecem normais nestes embriões cultivadas. Por outro lado, e Kalaskar Lauderdale relatou que 60% dos embriões testados neste meio exibiram normadesenvolvimento ai 18 horas mais tarde, mas a taxa de bom desenvolvimento de embriões em cultura de um 20-22 horas adicionais caiu para 30-40%. Em contraste com estes estudos, podemos reproduzir com sucesso o bom desenvolvimento do rato e do rato embriões cultivados em 100% IC soro de rato produzido usando nosso protocolo por dois dias (isto é., Cerca de 48 horas) a partir E12.5 em ratos 6 ou E10.5 em ratos 8, alterando o meio de uma vez em 24 horas. Estes resultados sugerem que o método para a preparação de IC de soro de rato é útil para uma variedade de experiências de aplicação WECat diferentes estágios embrionários de mamíferos. Portanto, esperamos que o nosso protocolo de vídeo vai ajudar a introduzir novos pesquisadores experimentos usando WEC para seus laboratórios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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