Introduction
Разнообразие модельных животных используются в биологии развития, чтобы исследовать механизмы развития на молекулярном и клеточном уровнях. Например, амфибий и птиц видов были широко использованы в качестве классических модельных животных, которые подходят для прямого манипулирования эмбрионов, потому что эти эмбрионы разрабатывать за пределами матери. В отличие от этих животных, эмбрионов млекопитающих растут в матке матери, и рост на более поздних стадиях в решающей степени зависит от функции матки. Таким образом, это, как правило, трудно непосредственно манипулировать эмбрионов млекопитающих, таких как те, от мышей и крыс на ранних стадиях. В 1960 году Денис Новый создана млекопитающего всю культуру эмбрионов (ВЭС) технологии с использованием WEC аппараты с непрерывной подачи кислорода и теплового контроля 1. В WEC, мыши и крысы эмбрионы могут расти экс естественных, (то есть, за пределами матки). Хотя ВЭС техника часто используется в тератологии, добавив различные химикодр. соединений в культуральной среде, этот метод также был использован в различных биологических исследований развития изучить уникальные механизмы развития у млекопитающих 2-4. Например, ВДК в сочетании с другими методами, такими как маркировки клеток, в эмбрионов дикого типа и мутантных с помощью флуоресцентного красителя 5, трансплантацию клеток 6, и введение генов с помощью липофекции 7 и 8-13 электропорации.
В последнее время в маточно манипуляции были использованы для анализа процессов развития зародышей грызунов на более поздних стадиях и была объединена с методами электропорации 14-16. Однако, эти методы не подходят для манипуляции послеимплантационных и середине беременности эмбрионов из-за трудностей, достигших точную локальную инъекцию раствора ДНК в эмбрионы на ранних стадиях. Хотя трансплантация ультразвуковым контролем клеток и инъекции вирусных векторов в ранних эмбрионов (то есть, Были зарегистрированы E8.5-E-9.5 в мыши) в утробе матери ранее 17,18, отличные навыки, необходимые для выполнения этих экспериментов с высокой вероятностью успеха. Таким образом, ВДК с высокой доступностью экс виво имеет преимущества по отношению к манипуляции мышей и крыс эмбрионов.
Сразу центрифугировали (IC) сыворотки крыс получали из самцов крыс часто используется для ПЭВ среды. Когда эмбрионы культивируют на стадии постимплантационного (т.е. раньше, чем E8.0 у мыши или E10.0 у крыс), смесь синтетической среде и IC крысиной сыворотки часто используется в качестве среды для ВДК 19. Однако, чтобы культуры эмбрионов на середине беременности (то есть., E8.0-12.5 в мышиных эмбрионов или E10.0-E14.5 в крысиных эмбрионов), 100% сывороточного должны использоваться в качестве средства, потому что ни в настоящее время альтернативные СМИ не позволяет эмбрионы для выращивания обычно в пробирке в течение более 2 дней.
Подготовка высококачественной крысиной сыворотки являетсяважным шагом для достижения воспроизводимости в ВЭК экспериментов. По сравнению с задержкой центрифугированием, IC имеет преимущество уменьшения гемолиза, когда сыворотку собирали путем выдавливания фибриновый сгусток, потому что большинство эритроцитов уже отделена от фибринового сгустка. Как гемолитической сыворотки крыс не может поддерживать нормальный рост крыс и мышей эмбрионов, подготовка сыворотке с помощью немедленного центрифугирования предпочтительно с использованием препарата замедленного центрифугирование. Наш протокол содержит два дополнительных шагов по сравнению с другими протоколами 18-20 (т.е.., Хранения собранной крови на льду до первого центрифугирования и поддержание собранные образцы крови в течение 2 часов при 4 ° С после первого центрифугирования). Первый шаг может задержать образование сгустка крови, и последний шаг способствует затвердевание фибринового сгустка для легкого сжатия. Таким образом, наша протокол может быть использован новичками. Однако, воспроизводя сбора крови и сывороткиДобыча точно, просто ссылаясь на протокольных книг чрезвычайно трудно 19-21. В этом видео статье мы демонстрируем нашу стандартный протокол для подготовки оптимального IC крысиной сыворотки, которая включает сбор крови из брюшной аорты самцов крыс и извлечения сыворотке путем центрифугирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Комитет по экспериментов на животных в Тохоку школы медицины университета утвердил экспериментальные процедуры, описанные здесь.
1. Анестезия и Лапаротомия
- Для сбора крови, использовать конкретного патогена самцов крыс Спрэг Dawley. Быстрая крыс, по крайней мере 18 часов, обеспечивая воду. Используйте пенсию самцов крыс нейтронах на 6-8 месячного возраста (550-650 г) для сбора крови.
- Расход 2,5-4,0% изофлуран, который является ингаляционное анестетик, в коробку, подключенного к устройству анестезии вводить анестезию в 2,0-3,5 л / мин в течение 10 мин. Трансфер крыс в поле ввести наркоз.
- Подтвердите обезболивания путем проверки потери ответ на стимуляцию на лапах с щипцами. Накройте нос Wi крысй маску, соединенную с анестезии аппарата глубоко обезболить крыс во время сбора крови. Концентрация и расход поддерживается на 2,5-4,0% и 2,0-3,5 л / мин, соответственно.
Примечание: галотан не должны использоваться для ингаляционного наркоза, потому что эмбрионы культивируют в сыворотке, которая собирается от крыс, анестезированных с этим реагентом демонстрируют задержки в эмбриональном развитии по сравнению с эмбрионами, культивированных в сыворотке, полученной от крыс анестезируют изофлураном 22.
- Подтвердите обезболивания путем проверки потери ответ на стимуляцию на лапах с щипцами. Накройте нос Wi крысй маску, соединенную с анестезии аппарата глубоко обезболить крыс во время сбора крови. Концентрация и расход поддерживается на 2,5-4,0% и 2,0-3,5 л / мин, соответственно.
- Чтобы избежать загрязнения меха, дезинфекции кожи, поливая 70% этанола на животе под наркозом крысы. Встреча дезинфекции кожи и брюшной стенки в нижней области с парой щипцов и сократить эти слои одновременно к области грудной клетки с парой больших ножниц подвергать внутренние органы. Отражение кишечник за пределами брюшной полости с парой щипцов.
- Разрежьте кожу и брюшную стенку к задних конечностей сПара большими ножницами для дальнейшего подвергайте задней брюшной области. Отражение лишний жир пределами брюшной полости с парой щипцов.
- Поднимите висцерального жира по срединной линии, используя две пары щипцов и аккуратно разделить жира в параллельном направлении, чтобы разоблачить брюшной аорты. Повторите эту процедуру, чтобы разделить висцерального жира в продольном направлении, чтобы легко идентифицировать бифуркации брюшной аорты. Кроме того, аорта и пульсирующий можно отличить от соседней полой вены с помощью этой характеристики.
- Встреча жир вокруг брюшной аорты и бифуркации тщательно с двумя парами щипцов и отделить жира на брюшной аорты.
2. Забор крови
- Осторожно вставьте кончик 21 G иглы, соединенной с 20 мл шприц сразу краниально к бифуркации аорты, с фаской в направлении вниз. Держите шприц с однимС другой стороны, и потяните шприц медленно собирать 15 мл крови из самца крысы.
- Удалите иглу из шприца, и залить кровью на две 10-мл стерильные пробирки испытаний ледяные (рис. 1А). Держите труб на льду до центрифугирования отложить формирование тромба. Сокращение времени центрифугирования путем центрифугирования несколько трубок в одно время.
- Усыпить наркозом крыса по торакотомии и резки сердце или обезглавливание.
3. Крыса Сыворотка Подготовка
- Центрифуга собранной крови в течение 5 мин при 1200 х г и при комнатной температуре (RT), чтобы отделить кровь в верхних и нижних слоев (рис. 1с).
- Хранить пробирки при 4 ° С в течение 1,5-2 часов, чтобы зафиксировать фибриновый сгусток.
- Встреча фибриновый сгусток в верхнем слое с помощью пары изогнутых щипцов, и сжать фибриновый сгусток, чтобы отделить сыворотку. Затем нажмите сгусток фибрина с изогнутыми щипцами, стоящих перед сделайwnwards вблизи границы раздела между двумя слоями (фиг. 1D).
- Повторите шаг 3,3 дальнейшего отделить сгусток фибрина.
- Центрифуга пробирки в течение 5 мин при 1200 х г и комнатной температуре (рис. 1E).
- Тщательно передачи сыворотки в 15 мл стерильной пробирке с использованием стерильной пипетки в ламинарном шкафу воздушного потока.
- Центрифуга собранную сыворотки крыс в течение 5 мин при 1200 мкг в и РТ для удаления оставшихся эритроцитов.
- Бассейн сыворотку тщательно в новый 15 мл стерилизованных трубу с помощью стерильной пипетки, чтобы избежать загрязнения остаточными эритроцитов на дне пробирки (рис. 1F).
- Инкубировать сыворотку на водяной бане при 56 ° С в течение 30 мин для инактивации систему комплемента.
- Охлаждают трубки крысиной сыворотки до комнатной температуры в ламинарном шкафу воздушного потока. Сыворотка должна быть аликвоты по 10 мл в стерильные пробирки отдельных. не хранить пробирки при температуре от -20 ° С до использования (рис. 1H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты описанных процедур для разделения клеток крови и сыворотки. Как правило, мы получаем 15 мл крови из отставного самцов крыс (рис. 1А). По центрифугирования собирали кровь может быть разделена на верхнюю слоем, содержащим сыворотки и фибриновый сгусток, который указан стрелкой, и нижний слой, содержащий клетки крови (рис. 1с). Важно отметить, гемолитические образцы крови не может быть отделена в сыворотке крови и слоев (фиг. 1b). После выхода из трубки при 4 ° С в течение 2 часов, фибриновый сгусток становится твердым. Это отверждение удобно для разделения сыворотки от сгустка фибрина с помощью пары изогнутых щипцов (рис. 1D). Пробирку затем центрифугировали. Фибриновый сгусток видна на границе раздела между сыворотке и клеток крови слоев (рис. 1E). Сыворотка из двух пробирок были собраны вновая трубка Пипеткой. Мы можем получить приблизительно 6 мл сыворотки от самцов крыс если вся процедура является успешным. Для дальнейшего удалить эритроциты, собирают сыворотку снова центрифугировали. Все остальные красные клетки осаждают на дне пробирки (рис. 1F). Мы передается супернатант в новую пробирку и проверили цвет очищенной сыворотке судить о степени гемолиза, даже если мы имеем возможность собирать сыворотку из верхнего слоя после центрифугирования. Идеальный сыворотки крыс в течение МВЭК обычно имеет светло-желтый цвет (левый трубки на рисунке 1 г), в то время как сыворотки крыс с легкой гемолизе обладает розоватого цвета (справа трубки на рисунке 1 г). IC сыворотки крыс можно хранить в течение по крайней мере 6-12 месяцев при -20 ° С (слева на рисунке 1H). Сыворотка с легкой гемолиз выставлены более глубокий цвет, чем идеального сыворотки при замораживании (слева на рисунке 1 полугодие).
Рисунок 1. Процедуры центрифугирования крови и подготовке сыворотки самцов крыс. A) Образцы крови, собранные из самца крысы разделены поровну на две пробирки для центрифугирования. B, C) неразделенными образец (B) и идеально разделение на верхнем слое, содержащей сыворотки и фибриновый сгусток (стрелка на C) и нижний слой, содержащий клетки крови после первого центрифугирования. D) фибриновый сгусток сжимается с помощью пары щипцов. E) сыворотке и слои клеток крови после второго центрифугирования. Фибриновый сгусток наблюдается при интерфейс (стрелками). F) Осадки клеток крови после третьего центрифугированием (стрелка). G) Левая трубка показывает идеальную сыворотки крыс с легкой желтоватого цвета. Право трубка показывает сыворотки крыс с мягким гемолиз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспроизводимые результаты в ВЭК экспериментов зависят от использования высококачественного IC крысиной сыворотки и точной техники эмбрион рассечение 3. Не сократить период поста перед сбором крови, потому что пост необходимо стандартизировать концентрации глюкозы в крови. Самок крыс не должны использоваться для приготовления сыворотки, поскольку уровень гормонов изменить у самок животных в соответствии с эстрального цикла, и такие изменения в эстрадиола гормонов непригодны для эмбрионов культур. Кроме того, чрезвычайно жирных самцов крыс не должны использоваться для подготовки сыворотки, чтобы избежать большого количества загрязнений липидов в крови.
При сборе крови, сначала убедиться, что цвет артериальной крови ярко-красного цвета, отражающие нормальное дыхание под наркозом. Снижение дыхание приводит к уменьшению количества собранной крови. Чтобы восстановить в таких случаях, временно снизить скорость, с которой шприц PUвыполненным. Наиболее важной проблемой в сыворотке препарата гемолиз. Если собранные образцы крови обнаруживают сильную гемолиз, кровь не может быть разделены на два слоя центрифугированием. Потому мягко гемолизированные сыворотки может поддерживать суб-оптимального развития, должны быть отброшены такие сыворотки. Как правило, гемолиз быть вызвано принудительным давлением, шприц должен быть выведены медленно при сборе крови. Важно, чтобы избежать пузырьков в кровь, когда собранные образцы крови разливают в пробирки, что увеличивает гемолиз.
Для эмбрионов культура мыши, ИК сыворотку собирали из самцов мышей может быть идеальным; Однако это требование не является практичным, поскольку мы не можем получить достаточно большой объем крови от мыши. Когда мы готовим сыворотки крыс, мы готовим по крайней мере, 10 на пенсию разведения самцов крыс. В нашей лаборатории, сбор крови осуществляется регулярно, по крайней мере двух лиц: индивид сбора крови и индивидуальный обезболивающее и выполненияпервое центрифугирование.
На данный момент несколько исследований с использованием коммерческого сыворотки крыс в WEC, комбинируя химически определенной среде не поступало 23-25. Например, смесь 50% коммерчески доступного крысиной сыворотки и 50% DMEM поддерживает нормальный рост зародышей E8.5 мыши в течение 36 ч и 23 нормального роста мышиных эмбрионов E9.75 в течение 40 ч. 24. В другом протоколе, смесь состоит из 50% крысиной сыворотки доступного от другой компании и 50% среде F12 с добавлением N-2 также поддерживает надлежащий рост E7.5 и E8.5 эмбрионов мыши в течение 24 ч. 25. Тем не менее, остается неясным, является ли пригодны для культуры крыс и мышей эмбрионов эти комбинаторные СМИ на более поздних стадиях, таких как E11.5-E12.5 у мышей и E13.5-E14.5 у крыс. WEC исследования с использованием различных альтернативных средств массовой информации, а не крысиной сыворотки также сообщалось 26-28. Например, сочетание DMEM/F12 и 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) поддерживает Develвития эмбрионов крыс от E11.5 на 28 часов 26. Тем не менее, эта среда не подходит для крыс культивирования эмбрионов от E10.5 на 28 часов 26. Таким образом, мы считаем, что нормальный рост эмбрионов в среде, содержащей FBS зависит от эмбриональной стадии эмбрионов.
ВЭС с использованием бессывороточной культуральной среды, состоящей только из определенных реагентов, в том числе коммерчески доступных эмбриональных стволовых клеток СМИ, бычий сывороточный альбумин, и N-2 дополнения не поступало. Эта среда поддерживает культуру эмбрионов E10.5 мыши на 16-40 ч. 27, 28. Morre-Скотт и др.. Показали, что размер макушки до крестца из эмбрионов мыши, культивируемых в течение 24 ч, значительно меньше, чем у Е11 0,5 эмбрионы, выращенные в утробе матери. Тем не менее, основные структуры, такие как сомитах и ганглиях задних корешков, выглядят нормальными в этих культивируемых эмбрионов. С другой стороны, Kalaskar и Лодердейл сообщалось, что 60% исследованных эмбрионов в этой среде выставлены нормуаль развитие 18 часа спустя, но темпы хорошего развития у эмбрионов, культивируемых в течение дополнительного 20-22 час упала до 30-40%. В отличие от этих исследований, мы можем успешно воспроизвести хорошее развитие мышей и крыс эмбрионов, культивируемых в 100% СК крысиной сыворотки производится с помощью нашего протокола в течение двух дней (т.е.., Примерно 48 ч) от E12.5 у крыс 6 или E10.5 у мышей 8 путем изменения среды один раз в 24 часа. Эти результаты показывают, что наш способ получения IC крысиной сыворотки полезно для различных экспериментов, применяющих млекопитающих WECat различных эмбриональных стадий. Таким образом, мы надеемся, что наш протокол видео поможет новым исследователи ввести эксперименты с использованием WEC в свои лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
