Introduction
Una variedad de modelos animales se utilizan en la biología del desarrollo para investigar los mecanismos de desarrollo a nivel molecular y celular. Por ejemplo, las especies de anfibios y aves han sido ampliamente utilizados como animales modelo clásico que son adecuados para la manipulación directa de embriones debido a que estos embriones se desarrollan fuera de la madre. En contraste con estos animales, los embriones de mamíferos crecen en el útero de la madre, y el crecimiento en etapas posteriores es crucialmente dependiente de la función del útero. Por lo tanto, normalmente es difícil de manipular directamente los embriones de mamíferos tales como los del ratón y la rata en las primeras etapas. En la década de 1960, Denis Nueva estableció un cultivo de embriones de mamíferos toda técnica (WEC), utilizando aparatos de WEC con un suministro de oxígeno continuo y control de calor 1. En WEC, ratón y rata embriones pueden crecer ex vivo, (es decir, fuera del útero). Aunque la técnica de WEC fue utilizado a menudo en teratología, mediante la adición de varios chemicotros compuestos en el medio de cultivo, esta técnica también se ha utilizado en varios estudios de biología del desarrollo para examinar los mecanismos de desarrollo únicos en mamíferos 2-4. Por ejemplo, el CME se combina con otras técnicas, como el etiquetado de las células, en los de tipo salvaje y mutante embriones mediante el uso de tinte fluorescente 5, el trasplante de células 6, y la introducción de genes a través de lipofección y electroporación 7 8-13.
Recientemente, la manipulación en el útero se ha utilizado para analizar los procesos de desarrollo en embriones de roedores en etapas posteriores y se ha combinado con técnicas de electroporación 14-16. Sin embargo, estas técnicas no son adecuadas para la manipulación de embriones postimplante y mitad de la gestación debido a dificultades para alcanzar la inyección local exacta de la solución de ADN en embriones en las primeras etapas. Aunque el trasplante de células guiada por ultrasonido y la inyección de vectores virales en embriones tempranos (es decir,, Se ha informado de E8.5-E-9.5 en el ratón) en el útero previamente 17,18, se requieren excelentes habilidades para llevar a cabo estos experimentos con un alto índice de éxito. Por lo tanto, el CME con alta accesibilidad ex vivo tiene ventajas con respecto a la manipulación de embriones de ratón y rata.
Inmediatamente se centrifugó (IC) de suero de rata preparado a partir de ratas macho se utiliza a menudo para el medio WEC. Cuando los embriones se cultivan en la fase después de la implantación (es decir, antes de E8.0 en el ratón o E10.0 en la rata), una mezcla de medio sintético y suero de rata IC se utiliza a menudo como un medio para la WEC 19. Sin embargo, a los embriones de cultivo a la mitad de la gestación (es decir., E8.0-12.5 en embriones de ratón E10.0-E14.5 o en embriones de rata), 100% de suero debe ser usado como un medio porque no hay medios de comunicación alternativa disponible actualmente permite embriones para crecer normalmente in vitro durante más de 2 días.
La preparación de suero de rata de alta calidad esun paso crítico para lograr la reproducibilidad en los experimentos de WEC. En comparación con retraso centrifugación, IC tiene el beneficio de reducir la hemólisis cuando el suero se recogió por apretar el coágulo de fibrina, porque la mayoría de las células rojas de la sangre ya se han separado del coágulo de fibrina. Como suero de rata hemolítica no apoya el crecimiento normal de los embriones de rata y ratón, la preparación de suero utilizando centrifugación inmediata es preferible a la preparación usando retraso centrifugación. Nuestro protocolo contiene dos pasos adicionales en comparación con otros protocolos 18-20 (es decir., El almacenamiento de la sangre recogida en hielo antes de la primera centrifugación y el mantenimiento de las muestras de sangre recogidas durante 2 horas a 4 ° C después de la primera centrifugación). La etapa anterior puede retrasar la formación del coágulo de sangre, y el segundo paso promueve la solidificación del coágulo de fibrina para una fácil compresión. Por lo tanto, nuestro protocolo se puede utilizar por los principiantes. Sin embargo, la reproducción de la recogida de sangre y sueroextracción con precisión por una simple referencia a los libros de protocolo es extremadamente difícil 19-21. En este artículo de vídeo, demostramos nuestro protocolo estándar para la preparación de suero de rata óptima IC, que incluye la recogida de sangre de la aorta abdominal de las ratas macho y la extracción del suero por centrifugación.
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Protocol
NOTA: Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Comité de Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tohoku aprobó los procedimientos experimentales descritos en el presente documento.
1. Anestesia y laparotomía
- Para la recolección de la sangre, use ratas libres de patógenos específicos Sprague-Dawley. Fast las ratas durante al menos 18 horas, mientras que el suministro de agua. Utilice jubilados ratas reproductoras masculinas a los 6-8 meses de edad (550-650 g) para la recogida de sangre.
- Flujo 2,5-4,0% de isoflurano, que es un anestésico de inhalación, en una caja conectada a un aparato de anestesia para introducir la anestesia en 2,0-3,5 l / min durante 10 min. Traslado ratas en el cuadro para introducir la anestesia.
- Confirmar anestesia mediante la comprobación de la pérdida de la respuesta a la estimulación en las patas con fórceps. Cúbrase la nariz de la wi ratasth una máscara conectada a un aparato de anestesia para anestesiar profundamente las ratas durante la extracción de sangre. La concentración y el flujo se mantienen a 2,5-4,0% y 2,0-3,5 l / min, respectivamente.
NOTA: halotano no se debe utilizar para la anestesia de inhalación porque los embriones cultivados en el suero que se recoge de ratas anestesiadas con este reactivo exhiben un retraso en el desarrollo embrionario en comparación con los embriones cultivados en el suero obtenido de ratas anestesiadas con isoflurano 22.
- Confirmar anestesia mediante la comprobación de la pérdida de la respuesta a la estimulación en las patas con fórceps. Cúbrase la nariz de la wi ratasth una máscara conectada a un aparato de anestesia para anestesiar profundamente las ratas durante la extracción de sangre. La concentración y el flujo se mantienen a 2,5-4,0% y 2,0-3,5 l / min, respectivamente.
- Para evitar la contaminación de la piel, la desinfección de la piel mediante el vertido de etanol al 70% en el abdomen de la rata anestesiada. Recoger la piel desinfectada y la pared abdominal en la región inferior con un par de pinzas y cortar estas capas simultáneamente hacia la región del tórax con un par de tijeras grandes para exponer los órganos internos. Reflejar el intestino fuera de la cavidad abdominal con un par de pinzas.
- Cortar la piel y la pared abdominal hacia las extremidades traseras con unpar de tijeras grandes para exponer aún más la región abdominal posterior. Reflejar la grasa extra fuera de la cavidad abdominal con un par de pinzas.
- Recoger la grasa visceral en la línea media usando dos pares de pinzas y dividir la grasa cuidadosamente en una dirección paralela para exponer la aorta abdominal. Repita este procedimiento para dividir la grasa visceral en una dirección longitudinal para identificar fácilmente la bifurcación de la aorta abdominal. Además, la aorta es pulsátil y se puede distinguir de la vena cava adyacente utilizando esta característica.
- Recoge la grasa alrededor de la aorta abdominal y la bifurcación con cuidado con dos pares de pinzas y se separa la grasa en la aorta abdominal.
2. Extracción de sangre
- Con cuidado, inserte la punta de una aguja 21 conectada a una jeringa de 20 ml inmediatamente craneal a la bifurcación de la aorta, con el bisel en una dirección hacia abajo. Sostenga la jeringa con unamano, y tire la jeringa lentamente para recoger 15 ml de sangre de una rata macho.
- Retire la aguja de la jeringa, y verter la sangre en dos tubos helados de 10 ml estériles de prueba (Figura 1A). Mantener los tubos en hielo hasta la centrifugación para retrasar la formación del coágulo de sangre. Reducir el tiempo de centrifugación por centrifugación varios tubos al mismo tiempo.
- La eutanasia a la rata anestesiada por toracotomía y cortar el corazón o la decapitación.
3. Rata Preparación de suero
- Centrifugar la sangre recogida durante 5 min a 1200 x g y temperatura ambiente (TA) para separar la sangre en las capas superior e inferior (Figura 1C).
- Mantener los tubos a 4 º C durante 1,5 a 2 horas para arreglar el coágulo de fibrina.
- Levante el coágulo de fibrina en la capa superior con un par de pinzas curvas, y exprimir el coágulo de fibrina para separar el suero. A continuación, pulse el coágulo de fibrina con las pinzas curvas enfrentan downwards cerca de la interfaz entre las dos capas (Figura 1D).
- Repita el paso 3.3 para separar aún más el coágulo de fibrina.
- Centrifugar los tubos de ensayo durante 5 min a 1200 xg y RT (Figura 1E).
- Transferir cuidadosamente el suero en un tubo estéril de 15 ml utilizando una pipeta estéril en un gabinete de flujo laminar de aire.
- Centrifugar el suero de rata recogido durante 5 min a 1200 xg y RT para eliminar cualquier resto de células rojas.
- Reúnase el suero con cuidado en un nuevo tubo de 15 ml esterilizados utilizando una pipeta estéril para evitar la contaminación por los glóbulos rojos residuales en la parte inferior del tubo (Figura 1F).
- Incubar el suero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 minutos para inactivar el sistema de complemento.
- Enfriar los tubos de suero de rata a RT en el gabinete de flujo de aire laminar. El suero debe ser dividió en alícuotas a 10 ml en tubos estériles individuales. Guarde los tubos a -20 ° C hasta su uso (Figura 1H).
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Representative Results
La Figura 1 muestra los resultados representativos de los procedimientos descritos para la separación de células de la sangre y suero. Por lo general obtenemos 15 ml de sangre de una rata macho retirado (Figura 1A). Por centrifugación, la sangre recogida se puede separar en una capa superior que contiene el suero y el coágulo de fibrina, que se indica con una flecha, y una capa inferior que contiene las células de la sangre (Figura 1C). Es importante destacar que las muestras de sangre hemolíticas no se pueden separar en suero y las capas de la sangre (Figura 1B). Después de dejar el tubo a 4 º C durante 2 h, el coágulo de fibrina se convierte en sólido. Esta solidificación es conveniente para la separación del suero del coágulo de fibrina usando un par de pinzas curvas (Figura 1D). El tubo de ensayo se centrifugó posteriormente. El coágulo de fibrina es visible en la interfaz entre el suero y capas de células de la sangre (Figura 1E). El suero de los dos tubos de ensayo y se concentra enun nuevo tubo utilizando una pipeta desechable. Podemos obtener aproximadamente 6 ml de suero de una rata macho si todo el procedimiento tiene éxito. Para eliminar adicionalmente las células rojas, el suero recogido se centrifugó de nuevo. Cualquier glóbulos rojos restantes se precipitaron en la parte inferior del tubo (Figura 1F). Transferimos el sobrenadante a un nuevo tubo y se verificaron el color del suero purificado para juzgar el grado de hemólisis aunque somos capaces de recoger el suero de la capa superior después de la centrifugación. El suero de rata ideal para WEC típicamente exhibe un color amarillo claro (tubo de la izquierda en la Figura 1G), mientras que el suero de ratas con hemólisis leve exhibe un color rosáceo (tubo de la derecha en la Figura 1G). Suero de rata IC se puede almacenar durante al menos 6-12 meses a -20 ° C (a la izquierda en la Figura 1H). El suero con hemólisis leve mostraba un color más profundo que el suero ideales cuando se congela (a la izquierda en la Figura 1H).
Figura 1. Procedimientos para la centrifugación de sangre y preparación de suero de ratas macho. A) Las muestras de sangre de una rata macho se dividen en partes iguales en dos tubos de ensayo para la centrifugación. B, C) de la muestra no separada (B) y la separación ideales en la capa superior que contiene el suero y el coágulo de fibrina (flecha en C) y la capa inferior que contiene las células de la sangre después de la primera centrifugación. D) El coágulo de fibrina se aprieta utilizando un par de pinzas. E) el suero y células de sangre capas después de la segunda centrifugación. El coágulo de fibrina se observa en la interfaz (puntas de flecha). F) Precipitación de células de la sangre después de la tercera centrifugación (flecha). G) El tubo de la izquierda muestra de suero ideales rata con un color amarillento claro. El tubo de la derecha muestra de suero de rata con hemólisis leve.
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Discussion
Resultados reproducibles en experimentos WEC dependen de la utilización de alta calidad IC suero de rata y técnica de disección precisa embrión 3. No acortar el período de ayuno antes de la recogida de sangre, porque el ayuno es necesario normalizar las concentraciones de glucosa en la sangre. Las ratas hembras no deben ser utilizados para la preparación de suero debido a los niveles hormonales cambian en animales hembras de acuerdo con el ciclo estral, y tales cambios en las hormonas estradiol no son adecuados para los cultivos de embriones. Además, las ratas extremadamente graso masculinos no deben ser utilizados para la preparación de suero para evitar una gran cantidad de contaminación de lípidos en la sangre.
Cuando la recogida de la sangre, primero garantizar que el color de la sangre arterial es un color rojo brillante, que refleja la respiración normal bajo anestesia. Disminución de la respiración conduce a una reducción de la cantidad de sangre recogida. Para recuperar en tales casos, reducir temporalmente la velocidad a la que la jeringa es de la PUlled. El problema más crítico en la preparación de suero es la hemólisis. Si las muestras de sangre recogidas presentan hemólisis severa, la sangre no puede ser separado en dos capas por centrifugación. Debido a que el suero ligeramente hemolizaron puede apoyar el desarrollo de sub-óptimo, tales suero debe ser desechada. Como hemólisis tiende a ser inducido por la presión forzada, la jeringa debe tirar poco a poco en la recogida de la sangre. Es importante evitar el burbujeo de la sangre cuando las muestras de sangre recogidas se vierten en tubos de ensayo, lo que aumenta la hemólisis.
Para los embriones de ratón cultura, suero IC recogidos de los ratones macho puede ser ideal; Sin embargo, este requisito no es práctico porque no podemos obtener un gran volumen suficiente de sangre de un ratón. Cuando preparamos suero de rata, nos preparamos al menos 10 jubilados cría ratas macho. En nuestro laboratorio, la recogida de sangre se realiza rutinariamente por al menos dos individuos: el individuo la recogida de la sangre y el anestesiante individual y la realización de laprimera centrifugación.
Hasta la fecha, varios estudios utilizando suero de rata comercial en WEC mediante la combinación de medio definido químicamente se han reportado 23-25. Por ejemplo, una mezcla de 50% de suero de rata disponible comercialmente y 50% de DMEM apoya el crecimiento normal de los embriones E8.5 ratón durante 36 h 23 y el crecimiento normal de los embriones de ratón E9.75 durante 40 h 24. En otro protocolo, una mezcla compuesta de 50% de suero de rata disponible de otra compañía y 50% de medio F12 suplementado con N-2 también soporta el crecimiento adecuado de E7.5 y E8.5 embriones de ratón durante 24 horas 25. Sin embargo, no queda claro si estos medios combinatorios son adecuadas para el cultivo de embriones de rata y ratón en etapas posteriores, como E11.5-E12.5 en ratones y E13.5-E14.5 en ratas. Estudios WEC utilizando diversos medios de comunicación alternativos en lugar de suero de rata también se ha informado de 26-28. Por ejemplo, una combinación de DMEM/F12 y suero bovino fetal al 20% (FBS) apoya el desarrollorrollo de embriones de rata de E11.5 a 28 horas 26. Sin embargo, este medio no es adecuado para el cultivo de embriones de rata a partir de E10.5 de 28 horas 26. Por lo tanto, creemos que el crecimiento normal de los embriones en medio que contenía FBS depende de la etapa embrionaria de los embriones.
WEC usando medios de cultivo libre de suero compuesto sólo de reactivos definidos, incluyendo los medios de comunicación disponibles comercialmente células madre embrionarias, albúmina de suero bovino, y N-2 suplemento han sido reportados. Este medio favorece el cultivo de embriones de ratón E10.5 para 16-40 horas 27, 28. Morre-Scott, et al. Demostraron que el tamaño de la corona a nalgas de embriones de ratón en cultivo durante 24 horas es significativamente menor que el de E11 0.5 embriones cultivados en el útero. Sin embargo, las principales estructuras, tales como somitas y los ganglios radiculares dorsales, parecen normales en estos embriones cultivados. Por otro lado, Kalaskar y Lauderdale informaron de que 60% de los embriones ensayados en este medio exhibió normadesarrollo al 18 horas más tarde, pero la tasa de buen desarrollo en embriones cultivados para un 20-22 h adicionales se redujo a 30-40%. En contraste con estos estudios, podemos reproducir con éxito un buen desarrollo de los embriones de ratón y de rata cultivadas en el 100% de suero de rata IC producido utilizando nuestro protocolo de dos días (es decir., Aproximadamente 48 horas) desde E12.5 en ratas 6 o E10.5 en ratones 8 cambiando el medio una vez a las 24 h. Estos resultados sugieren que nuestro método para la preparación de suero de rata IC es útil para una variedad de experimentos aplicando WECat diferentes etapas embrionarias de mamíferos. Por lo tanto, esperamos que nuestro protocolo de vídeo ayudará a los nuevos investigadores introducen experimentos utilizando WEC a sus laboratorios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For rat anesthesia. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21 G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
References
- New, D. A. T. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford, UK. 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. , 3rd ed, CSH Press. New York, New York. 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
