המניפולציה Murine דמעות בלוטת

Summary

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

Abstract

בלוטת הדמעות (LG) מפרישה דמעות מימיות הכרחיות לשמירה על המבנה והתפקוד של הקרנית, רקמה שקופה חיונית לראייה. באדם LG יחיד מתגורר במסלול מעל הקצה לרוחב של כל עין ומספקת דמעות על פני השטח של העין באמצעות 3 - 5 צינורות. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת דמעות exorbital הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור כדי ליצור רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה. תהליך מורכב זה תועד היטב באיברים רבים אפיתל אחרים כגון הלבלב ובלוטות רוק. עם זאת, LG היה הרבה פחות חקר ומנגנוני השליטה המורפוגנזה הם גרוע תחתעמד. אנו חושדים כי תת-ייצוג זה כמערכת מודל הוא תוצאה של הקשיים הקשורים במציאה, לנתח וculturing LG. לכן, כאן אנו מתארים טכניקות לנתיחה לעובריים קציר ולאחר הלידה LG ושיטות לתרבות vivo לשעבר של הרקמה.

Introduction

בלוטת הדמעות (LG) היא אחראית להפרשת דמעות מימית קריטית לחדות ראייה והבריאות, תחזוקה, והגנה על התאים של פני השטח העין. תוצאות תפקוד לקוי של LG באחת מההפרעות עיניות הנפוצות והמתישות ביותר: יבשים חסר מימית מחלות עיניים, אשר מאופיינת על ידי גירוי עיני, רגישות לאור וירידה בראייה ^1. באדם LG מתגורר במסלול מעל הקצה הלטרלי של העין שבו 3 - 5 דמעות הפקדת צינוריות הפרשה על פני השטח של העין. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת הדמעות הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן (exorbital) עם דמעות בנסיעות לעין באמצעות צינור הפרשה אחד. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור למ 'רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה (איור 1) ^2. במהלך פיתוח האפיתל הופך כלי דם, כמו גם בכבדות innervated על ידי העצבים הפאראסימפתטית של גנגליון pterygopalatine ומידה פחותה יותר על ידי עצבים סימפטיים מצוואר רחם הגנגליון מעולה ^3. יחסי גומלין בין כל אחד מהתאים האלה סוגים כלומר תאים עצביים, אפיתל, אנדותל וmesenchymal, חיוניים לתפקוד ולתחזוקה של הרקמות בוגרות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס תיאום פיתוח LG והתחדשות כמו גם איך תקשורת בין-סוג התא מנחה תהליכים אלה עדיין לא ברורים.

כניסתו של עוברי לשעבר טכניקות תרבות vivo אפשרה זיהוי של מסלולים התפתחותיים ומשובים באיברי הסתעפות מרובים ^4. Culturing ex vivo נותן החוקר היכולת לתפעל את האיבר (chanical, גנטי או כימי) בתנאים מוגדרים, כמו גם לאפיין אינטראקציות התפתחות איברים ותאי תאים בזמן אמת. LG exorbital של העכבר הוא נוח מאוד בטכניקה זו ומחקרים שנעשו לאחרונה הוגדרו מערכות אזעקה המווסתות את התפתחותה ^2,5. עם זאת, על אף הצורך להבין רמזים מולקולריים שבבסיס התפתחות LG והתחדשות, זה כרגע נשאר understudied, ככל הנראה בשל הקשיים הטכניים בבידוד האיברים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולבצע תרבות vivo לשעבר של LG העכברי העוברי להגדיר תוכניות התפתחותיות.

Protocol

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה תחת בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.

1. עכבר עוברי דמעות בלוטות (LG): קצירה וMicrodissection

1. בעקבות נהלים שאושרו על ידי בעלי חיים המוסדיים לועדת אתיקה המדעית מחקר, להרדים מתוזמן נשים CD-1 (או מהונדס) בהריון עם משאיפת CO ₂ עולה, ואחריו אישור על ידי נקע בצוואר הרחם לעוברי קציר ביום העוברי המתאים. לייעד את היום של E0 גילוי תוסף נרתיק.
   הערה: בלוטות דמע (LGS) ניתן לקצור מבמת הניצן אחת E14 ואילך. עם זאת, E16 - עוברים (5 10 ניצנים) לתת תוצאות עקביות ביותר לתרבות ex vivo.
2. לעקר את vצד entral של העכבר באמצעות אתנול 70%. לצבוט את העור ועושה חתך בקו האמצע עם מספריים כירורגיות סטרילי; לחתוך את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. הסר את קרן הרחם 2 על ידי חיתוך לאורך mesometrium בחלק העליון של כל קרן רחם ומקום בקור PBS (בופר פוספט) או תקשורת F12 DMEM בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
3. בעזרת מלקחיים (# 5), להסיר עוברים מהצ'קים מי השפיר ומקום לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה שנייה PBS הקר. היזהר שלא לגעת בעיניים או באזור הראש.
4. הנח עובר על מיקרוסקופ לנתח עם בסיס שקוף. אם העובר הוא <E17, לבצע שלבי 1.5-1.7. אם הם עובר> E17, השלבים הבאים עשויים להיות מועילים, אך אינם חיוניים, ולכן המשיכו לשלב 1.8.
5. לנתק את הראש מהגוף, ממש מתחת ללסת התחתונה התחתונה (השלב ​​1, איור 2) usinאזמל סטרילי ga (# 10 להב). לסובב את הראש כדי שהלסת התחתונה היא עכשיו על הצלחת לנתח. שימוש במלקחיים כדי לייצב את הראש ואזמל כדי להסיר כ ¼ מהצד הגב של מוח (שלב 2, 1 חתך ^st, איור 2) - זה חשוב במיוחד ברגע שהסחוס מתקשח סביב E15.
6. כוון את הראש כך שהאזמל יכול לחדור את האף בין העיניים. ביצוע חתך דרך מרכז הראש, כך שהעיניים נמצאות כעת בחצי נפרדים (שלב 2, 2 חתך ^nd, איור 2).
7. באמצעות שני # 5 מלקחיים, לקחת מחצית מהראש ולהסיר רקמה עודפת (ראה שלב 3, איור 2). הקפד לכוון את הראש כל כך LG (הממוקם בפינה האחורית התחתונה של העין) הוא לא איבד בתהליך ההסרה זה. הסר מוחי עודפים, סחוס, ורקמות האף מסביב ומתחת לעין. מאז הבלוטה היא בקושי נראית בשלב זה, להבטיח את העין בכיוון נכון לאחר t הסרת רקמה עודפתo להימנע מאיבוד המיקום של LG.
8. לתפוס בזהירות את העור מאחורי, בפינה תחתונה של העין עם שני המלקחיים. הסר את העור על ידי משיכת פתוחה בזהירות עם המלקחיים כדי לחשוף את LG. השתמש בתאורה נוספת מעל ומתחת לרקמה כדי לעזור להמחיש את LG.
   הערה: LG, להבחין במראה שלה כמו ניצן בצינור בתוך mesenchyme כהה יותר, תמצית, צריך להיות גלוי בשלב זה.
9. יתחיל בזהירות לנתח את LG וmesenchyme קשור (ראה לשרטט ותמונות) מהרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים, נזהר שלא לתפוס את LG או הצינור הקשורים אליו. ברגע שהבלוטה היא חופשית מהרקמה הסובבת, בעדינות להסיר את כל הבלוטה על ידי אחיזת האפיטל המקיף את העין בבסיס צינור LG. דואג לשמר את mesenchyme מקיף את האפיתל, אשר ניתן לצפות כmesenchyme תמצית לתוכו invaginates האפיתל.
   הערה: חלק ההסרה נוספת של tissuדואר (כל שברי עצמות קטנים, שרירים, ורקמות חיבור) עשויים להיות נחוצים כדי להימנע מאיתות גורמים / צמיחה לשכנתה רקמה.
10. לתרבות, קציר 4 - 5 בלוטות וmesenchyme קשורים לכל צלחת (LGS צופה מייד עם נתיחה); לאסוף מינימום של 14 בלוטות לשל חיץ תמוגה RNA לRT-PCR ⁶ 100 μl.

2. להכין צלחות לאקס תרבות Vivo

הליך זה מבוסס על שהעסיק לבלוטות רוק פיתוח ^7,8.

1. הוסף 200 μl של F12 DMEM (בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) תקשורת ותרבות עם 50 מיקרוגרם / חומצה אסקורבית מיליליטר ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר הולוגרמות transferrin לצלחת microwell קוטר 50 מ"מ עם רצפת זכוכית ^7.
   הערה: F12 DMEM נבחר כפי שמצאנו אותו בעבר על מנת למקסם את המורפוגנזה בבלוטת הרוק העוברית.
2. לצוף polycarb 13 מ"ממסנן קרום Onate עם 0.1 מיקרומטר נקבוביות על גבי מדיה.
3. שלב אופציונאלי: לדלל laminin 3-D 1: 1 עם DMEM / F12 כדי להפוך את הריכוז סופי של 3 מ"ג / מיליליטר (200 להשתמש פיפטה μl לערבב בעדינות; צנטריפוגות 1 דקות אם מופיעות בועות). הוסף 15 μl זה מדולל laminin 3-D כדי לסנן.
   הערה: דילול זו נמצא להיות אופטימלי לשמירת LG במצב 3D שלה מבלי להתפשר על הסתעפות אפיתל. עם זאת, זה לא חיוני לתרבות של LG.
4. מניחים 4 - 5 LG על מסנן או לlaminin. תרבות LGS vivo לשעבר ל24-48 שעות (איור 3) או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לניתוח נוסף על ידי qPCR או immunostaining (איור 4). לניתוח qPCR של רקמת בלוטות עוברית, עיין באל Rebustini et., 2011. לניתוח immunofluorescent של רקמות בלוטות עוברי עיינו בציטוטים הבאים: et al הופמן, (2002) ו- e שטיינברג.t אל., (2005).

3. עכבר אחרי לידה ומבוגרי דמעות בלוטות (LG): Dissection

1. להרדים את העכבר לאחר הלידה על פי הסטנדרטים של ועדת אתיקה של בעלי החיים המתאימה. לגורים לאחר לידה יום 8 או צעירים יותר, להרדים על ידי ניתוק הראש עם מספריים סטריליים. ליום לידה 8 ומעלה, לרסס פרווה עם 70% אתנול.
2. כדי לאתר את LG, להניח את העכבר לרוחב צד כלפי מעלה, תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. הערה: LG לאחר הלידה והמבוגרת גובל בעורק הראשי, השריר המלעס והדרמיס (ראה תרשים 5).
3. בעזרת מספריים לנתיחה קטנים, לעשות חתך קטן בעור רוחבי משם צריך להיות ממוקם LG.
4. בעזרת מלקחיים, למשוך לפתוח את האפידרמיס לכיוון האוזן כדי לחשוף את LG.
5. שימוש במלקחיים כדי לשחרר בעדינות LG מרקמה הסובבת.
6. ברגע שהוא שוחרר מבית LG רקמה הסובב, להסיר את LG בקפידה על ידי הצינור,על ידי אחיזה בי הצינור והאפיטל המקיף את העין להתחבר (איור 1).
7. הנח LGS במאגר תמוגה RNA לRT-PCR, או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לimmunostaining.

Representative Results

LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל. תמונות Brightfield של LGS העוברי גזור בE14, E15, E16, E17, וP2 להמחיש את האירוע הזה.

איור 1. LG מתפתח בתהליך של אפיתל הסתעפות המורפוגנזה. תמונות Brightfield של LGS העוברי טרי גזור בE14, E15, E16, E17 ו- P2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שים לב שככל שעולה האפיתל בגודל, כמות mesenchyme יורדת. הצעדים הניסיוניים עבור microdissection של LGS העוברי מתוארים באיור 2.

בתוך עמודים = "תמיד">
איור 2. סכמטי של שלבים הכרוכים בmicrodissection LG מעוברי עכברים. תרשים סכמטי של הנתיחה וההסרה של LG מהעכבר העוברי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לתרבות LG אנו מנצלים באופן שיגרתי עוברים E16 בשל העקביות בצמיחת ex vivo. כפי שניתן לראות באיור 3, LG בex vivo תנאי התרבות מתפתחים באופן דומה לבלוטת in vivo (השווה לאיור 1).

איור 3. Exתרבות vivo של E16 LGS משחזרת בהמורפוגנזה vivo. LGS E16 נגזר Pax6-Cre, עוברי GFP, שבו GFP מתבטא באפיתל. תמונות ניאון רצופות נלקחו מבלוטה יחידה זה ב 0, 3, 6, 12, 24, ו -48 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כאן אנו מועסקים Pax6-Cre, GFP (המכונה גם לה-Cre ⁵⁾ עובר כדי להדגיש תאי אפיתל, ומאפשרים לנו לקחת תמונות ניאון ברציפות של האפיתל ההסתעפות על פני תקופת התרבות 48 שעות. ניתן להשיג עכברים מחסה Pax6-Cre, transgene GFP מJAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr אך הן אינם הכרחיות לנתיחה בלוטה ותרבות.

תרבויות או טרי גזור אז יכול להיות קבוע LG לניתוח immunofluorescent. איור 4 שלhows ההדמיה של 4 תאים סלולריים, mesenchyme, אפיתל (EpCAM), עצבים (Tubb3) וכלי דם (PECAM), בLG E16 מעובר הסוג בר (CD1).

איור 4. LG מורכב מסוגי תאים רבים, כולל אפיתל, עצבי ותאי האנדותל. E16 LG היה immunostained לתאי האפיתל (EpCAM, ירוקה), תאי עצב (Tubb3, אדום) ותאי האנדותל (PECAM, ציאן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לרקמה טרי גזור קל יותר ראשון להטביע את LG בlaminin, כפי שנעשה לתרבות, כדי לשתק את הבלוטה לקיבעון וטיפול שלאחר מכן. איור 5 מראה סכמטילנתיחה של לאחר הלידה / המבוגר LG.

איור 5. סכמטי של שלבים הכרוכים בmicrodissection LG מעכבר שלאחר לידה ומבוגר. תרשים סכמטי של הנתיחה וההסרה של LG מעכבר או לאחר לידה או מבוגר. Pax6-Cre, יום 30 עכבר GFP שלאחר לידה היה בשימוש כדי להמחיש את עמדתו של LG והדביק הקשורים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

העמדה שלאחר הלידה / המבוגר LG כבר דמיין באמצעות Pax6-Cre, העכבר GFP.

Discussion

צדדיות לתרבות ולתפעל את LG vivo לשעבר מספק יתרונות משמעותיים ללימוד הפיתוח שלה. זה כולל את המהירות שבה החוקר הוא מסוגל לבחון השערות והריבוי של הפרעות שניתן לבצע כדי להעריך עד כמה אפיתל, עצבי, אנדותל ותאי mesencyhmal אינטראקציה ליצירת האיברים. עם זאת, ישנם מספר סייגים כאשר ניצול מודל זה. ראשית, מכוח בידודה הבלוטה כבר לא מחוברת לכלי הדם ההיקפיים או במערכת עצבים, אשר עשוי להשפיע על מסלולי האיתות נבדקים אם הם עובדים בשיתוף עם אותות מועברים על ידי העצבים או כלי דם ^9,10. שנית, הרקמות שאינן LG מקיפות עשויות לספק גורמים המווסתים את התפתחות LG ^4. כדי להימנע ממרכיבי רקמה זו אחרות שאינה mesenchymal יש להסיר לפני לתרבות. שלישית, כרגע אנחנו לא מסוגלים לספק את התנאים דרושים לcytodifferent מלאiation לרקמה פונקציונלית מלא. זהו המקרה לכל האיברים בתרבית ex vivo וסביר בשל סיבות רבות, כולל היעדר כלי פונקציונליים דם ועצבים ו / או כוחות מכאניים מרקמות הסובבות. למרות אזהרות אלה, מנגנונים שהתגלו בתרבות לשעבר vivo הראו שסכמו שבלאחר מכן בניסויי vivo, מה שהופך את זה מערכת חזקה לבדיקת השערות חדשות ^8,11.

הוכח שמסלולי התפתחותיים ומשובים חופפים באופן משמעותי, מצביע על כך שמערכת התרבות לשעבר vivo יכול גם להיות מועסקות על מנת ללמוד התחדשות איבר ^12. למרות שלא הפגין את ההיבט הזה אנחנו כאן, ואחרים, הראינו בעבר בלוטת הרוק העוברי יכולה לשמש מודל ההשפעות של קרינה טיפולית על נזק לאיברים והתחדשות ^13. יש צורך במחקרים עתידיים כדי לחקור את השימוש במערכת LG vivo לשעבר כמודל לשחזור רקמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.