Summary
La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.
Abstract
La glándula lagrimal (LG) segrega lágrimas acuosas necesarias para mantener la estructura y la función de la córnea, un tejido transparente esencial para la visión. En el ser humano una sola LG reside en la órbita sobre el extremo lateral de cada ojo la entrega de lágrimas a la superficie ocular a través de 3 - 5 conductos. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal exorbital (LG) situado anterior y ventral de la oreja. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto para formar una red interconectada intrincada de los acinos y conductos de secreción. Este elaborado proceso ha sido bien documentado en muchos otros órganos epiteliales, tales como el páncreas y la glándula salival. Sin embargo, el LG ha sido mucho menos explorada y los mecanismos que controlan la morfogénesis son mal bajoresistido. Tenemos la sospecha de que esta falta de representación como un sistema modelo es una consecuencia de las dificultades relacionadas con la búsqueda, la disección y el cultivo de la LG. Por lo tanto, aquí se describen técnicas de disección de embriones cosecha y post-natal LG y métodos de cultivo ex vivo de los tejidos.
Introduction
La glándula lagrimal (LG) es responsable de la secreción de lágrima acuosa crítica para la agudeza visual y la salud, el mantenimiento y la protección de las células de la superficie ocular. LG resultados disfunción en uno de los trastornos oculares más comunes y debilitantes: acuoso deficiente en seco de Enfermedades de los ojos, que se caracteriza por la irritación ocular, sensibilidad a la luz y la disminución de la visión 1. En el ser humano la LG reside en la órbita por encima del extremo lateral del ojo donde 3 - 5 excretores lágrimas de depósito conductos sobre la superficie ocular. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal (LG) situado anterior y ventral de la oreja (exorbital) con lágrimas que viajan al ojo a través de un solo conducto excretor. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto a parasoy una intrincada red interconectada de acinos y conductos de secreción (Figura 1) 2. Durante el desarrollo del epitelio se vasculariza, así como en gran medida inervado por los nervios parasimpáticos del ganglio pterigopalatina y en menor medida por los nervios simpáticos del ganglio cervical superior 3. Las interacciones entre cada uno de estos tipos de células es decir, células neuronales, epiteliales, endoteliales y mesenquimales, son esenciales para la función y el mantenimiento del tejido adulto. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de coordinación de desarrollo LG y regeneración, así como la forma en guías de comunicación de tipo de células entre estos procesos sigue siendo poco clara.
El advenimiento de las embrionarias ex vivo las técnicas de cultivo ha permitido la identificación de las vías de desarrollo y regenerativos en múltiples órganos de ramificación 4. El cultivo ex vivo da el investigador la capacidad de manipular el órgano (memecánico, genético o químico) bajo condiciones definidas, así como para caracterizar el desarrollo de órganos y las interacciones célula-célula en tiempo real. El LG exorbital del ratón es altamente susceptible a esta técnica y estudios recientes han definido sistemas que regulan su desarrollo 2,5 señalización. Sin embargo, a pesar de la necesidad de comprender las señales moleculares que sustentan el desarrollo de LG y la regeneración, en la actualidad sigue siendo poco estudiada, probablemente debido a las dificultades técnicas para aislar el órgano. En este trabajo se describe cómo aislar y llevar a cabo el cultivo ex vivo de la embrionaria murina LG para definir los programas de desarrollo.
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Protocol
Todo el trabajo de los animales se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco.
1. embrionarias de ratón lagrimal Glándulas (LG): La recolección y Microdisección
- Siguiendo los procedimientos aprobados por los Animales institucionales para comité de ética de la investigación científica, la eutanasia programada embarazadas CD-1 (o transgénicos) las hembras con el aumento de inhalación de CO2, seguido de confirmación por dislocación cervical a los embriones de cosecha en el día embrionario adecuado. Designar el día de la vagina e0 descubrimiento enchufe.
Nota: las glándulas lagrimales (LGS) puede ser cosechada desde el escenario solo brote e14 en adelante. Sin embargo, e16 (5-10 yemas) embriones dan los resultados más consistentes para el cultivo ex vivo. - Esterilizar la ventral lado del ratón usando etanol al 70%. Apriete la piel y hacer una incisión en la línea media con unas tijeras quirúrgicas estériles; cortar a través de la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. Retire los 2 cuernos uterinos cortando a lo largo de la mesometrio en la parte superior de cada cuerno uterino y el lugar en PBS frío (tampón fosfato salino) o medio DMEM F12 suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Con unas pinzas (# 5), eliminar los embriones de las bolsas amnióticas y colocar en una segunda placa de Petri estéril que contiene PBS frío. Tenga cuidado de no tocar los ojos o la zona de la cabeza.
- Coloque embrión en un microscopio de disección con una base de transiluminación. Si el embrión es <e17, realice los pasos 1.5 a 1.7. Si los embriones son> e17, estos pasos pueden ser útiles, pero no son esenciales, por lo tanto, continúe con el paso 1.8.
- Cortar la cabeza del torso justo por debajo de la mandíbula inferior (paso 1, Figura 2) usinga bisturí estéril (# 10 cuchilla). Girar la cabeza de manera que la mandíbula se encuentra ahora en la placa de disección. Utilice pinzas para estabilizar la cabeza y el bisturí para eliminar alrededor de ¼ de la parte dorsal del cerebro (el paso 2, 1 de corte, figura 2) - esto es especialmente importante una vez que el cartílago se endurece alrededor de e15.
- Oriente la cabeza para que el bisturí puede perforar la nariz entre los ojos. Haga un corte a través del centro de la cabeza, de modo que los ojos están puestos en mitades separadas (paso 2, 2º corte, Figura 2).
- El uso de dos # 5 pinzas, tomar la mitad de la cabeza y quite el exceso de tejido (véase el paso 3, Figura 2). Asegúrese de orientar la cabeza por lo que el LG (que se encuentra en la esquina posterior inferior del ojo) no se pierde en este proceso de eliminación. Eliminar el exceso de cerebral, cartílago y tejido nasal circundante y debajo del ojo. Puesto que la glándula es apenas visible en este momento, garantizar el ojo está orientada correctamente después de exceso de tejido eliminación to evitar la pérdida de la ubicación de la LG.
- Agarrar con cuidado la piel de la parte posterior, en la esquina inferior del ojo con las dos pinzas. Quitar la piel tirando cuidadosamente abierta con las pinzas para exponer el LG. Utilice iluminación adicional por encima y por debajo del tejido para ayudar a visualizar el LG.
Nota: El LG, distinguibles por su aparición como un botón en un conducto dentro de un mesénquima condensado más oscuro, debe ser visible en este punto. - Empezar con cuidado para diseccionar el LG y mesénquima asociado (consulte el diagrama e imágenes) de distancia del tejido que rodea el uso de fórceps, teniendo cuidado de no agarrar el LG o su conducto asociado. Una vez que la glándula está libre del tejido circundante, eliminar suavemente toda la glándula agarrando el epitelio que rodea el ojo en la base del conducto de LG. Tenga cuidado para preservar el mesénquima que rodea el epitelio, que se puede observar como un mesénquima condensado en el que los invagina epitelio.
NOTA: Algunos eliminación adicional de tissue (los pequeños fragmentos de hueso, músculo y tejido conectivo) pueden ser necesarias para evitar factores de señalización / crecimiento de los tejidos vecinos. - Para el cultivo, la cosecha 4 - 5 glándulas y mesénquima asociado por placa (GL se colocan inmediatamente después de la disección); recoger un mínimo de 14 ganglios por cada 100 l de tampón de lisis de ARN por RT-PCR 6.
2. Prepare las placas para ex vivo Cultura
Este procedimiento se basa en que la empleada para el desarrollo de la glándula salival 7,8.
- Añadir 200 l de DMEM F12 (suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) medios de cultivo con 50 mg / ml de ácido ascórbico y 50 mg / ml holo-transferrina a un plato de 50 mm de diámetro de micropocillos con fondo de vidrio 7.
Nota: F12 DMEM fue elegido ya que previamente nos pareció que para maximizar la morfogénesis de la glándula salival embrionaria. - Flotador un Polycarb 13 mmfiltro de membrana de 0,1 micras Oñate con poros en la parte superior de los medios de comunicación.
- Paso opcional: Diluir laminina 3-D 1: 1 con DMEM / F12 para hacer una concentración final de 3 mg / ml (200 l utilizar la pipeta para mezclar suavemente; centrifugar durante 1 min si aparecen burbujas). Añadir 15 l de esta diluyeron laminina 3-D para filtrar.
Nota: Esta dilución se encontró que era óptimo para el mantenimiento de la LG en su estado 3D sin comprometer ramificación epitelial. Sin embargo, no es esencial para la cultura de LG. - Coloque 4 - 5 LG en filtro o en laminina. Cultura GL ex vivo por 24 - 48 h (Figura 3) o fijar con PFA al 4% durante 20 min para su posterior análisis por qPCR o inmunotinción (Figura 4). Para el análisis qPCR de tejido glandular embrionario, por favor consulte Rebustini et al., 2011. Para el análisis de inmunofluorescencia de los tejidos glandulares embrionarias por favor consulte las siguientes citas: Hoffman et al, (2002) y Steinberg correo.t al., (2005).
3. Ratón postnatal y adulto lagrimal Glándulas (LG): Disección
- La eutanasia del ratón postnatal de acuerdo a las normas del comité de ética animal apropiado. Para cachorros postnatal día 8 o más jóvenes, la eutanasia por el corte de la cabeza con unas tijeras estériles. Para el día postnatal 8 años o más, rociar la piel con etanol al 70%.
- Para localizar el LG, yacía ratón lateral lado bajo un microscopio de disección con iluminación desde arriba. Nota: El LG postnatal y adulto se limita con la arteria carótida, el músculo masetero y la dermis (ver Figura 5).
- El uso de pequeñas tijeras de disección, hacer pequeña incisión en la epidermis lateralmente desde donde se debe colocar el LG.
- Con unas pinzas, abra la epidermis hacia la oreja para exponer el LG.
- Utilice pinzas para aflojar suavemente LG del tejido circundante.
- Una vez que el LG se libera del tejido circundante, retire con cuidado el LG por el conducto,agarrando donde el conducto y el epitelio que rodea el ojo se conectan (Figura 1).
- Coloque los GL en tampón de lisis de ARN para RT-PCR, o fijar con PFA al 4% durante 20 min para inmunotinción.
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Representative Results
El LG desarrolla a través del proceso de la morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro de los gobiernos locales de embriones disecados en e14, e15, e16, e17, y P2 ilustran este evento.
Figura 1. El LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis de ramificación epitelial. Imágenes de campo claro GL embrionarias recién disecados en e14, e15, e16, e17 y P2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Tenga en cuenta que como el epitelio aumenta de tamaño, la cantidad de mesénquima disminuye. Los pasos experimentales para la microdisección de los GL embrionarias se representan en la Figura 2.
Figura 2. Esquema de los pasos involucrados en LG microdisección de embriones de ratón. Diagrama esquemático de la disección y extracción del LG del ratón embrionario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Para el cultivo de LG utilizamos rutinariamente embriones E16 debido a la consistencia en el crecimiento ex vivo. Como se muestra en la Figura 3, LG en condiciones de cultivo ex vivo se desarrollan de una manera similar a la glándula in vivo (compárese con la Figura 1).
Figura 3. Excultura vivo de e16 GL recapitula en la morfogénesis vivo. GL E16 se derivaron de Pax6-Cre, los embriones GFP, GFP, donde se expresa por el epitelio. Imágenes fluorescentes consecutivos se tomaron de esta única glándula a 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Aquí se emplearon embriones Pax6-Cre, las buenas prácticas agrarias (también llamado Le-Cre 5) para destacar las células epiteliales, lo que nos permite tomar imágenes fluorescentes consecutivas del epitelio de ramificación sobre el período de cultivo de 48 h. Los ratones que albergaban el Pax6-Cre, transgén GFP se pueden obtener de JAX: Tg (Pax6-Cre, GFP) 1Pgr pero no son necesarios para la disección y la cultura glándula.
Culturas o recién disecados LG entonces se puede fijar para el análisis de inmunofluorescencia. Figura 4 scómos la visualización de 4 compartimentos celulares, mesénquima, epitelio (EpCAM), los nervios (Tubb3) y los vasos sanguíneos (PECAM), en un LG e16 de un tipo salvaje (CD1) embrión.
Figura 4. El LG se compone de varios tipos de células incluyendo epitelial, neuronal y las células endoteliales. E16 LG se immunostained para las células epiteliales (EpCAM, verde), las neuronas (Tubb3, rojo) y las células endoteliales (PECAM, cian). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Para el tejido recién diseccionado es más fácil para incrustar la primera LG en laminina, como se hizo para el cultivo, así como para inmovilizar la glándula para la fijación y la manipulación posterior. La Figura 5 muestra un esquemapara la disección del postnatal / adulto LG.
Figura 5. Esquema de pasos involucrados en LG microdisección de ratón postnatal y adulto. Diagrama esquemático de la disección y extracción de la LG de ratón, ya sea después del parto o un adulto. Un Pax6-Cre, GFP postnatal día 30 del ratón se utiliza para visualizar la posición del LG y el conducto asociado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
La posición de la post-natal / adulto LG se ha visualizado mediante el uso de la Pax6-Cre, GFP ratón.
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Discussion
La versatilidad de la cultura y manipular el LG ex vivo ofrece ventajas significativas para el estudio de su desarrollo. Esto incluye la velocidad a la cual el investigador es capaz de probar las hipótesis y la multitud de las perturbaciones que se pueden realizar para evaluar cómo epitelial, neuronal, endotelial y células mesencyhmal interactúan para formar el órgano. Sin embargo, hay una serie de advertencias cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, en virtud de su aislamiento de la glándula ya no está conectado a la vasculatura periférica o del sistema nervioso, que puede afectar las vías de señalización están probando si trabajan en conjunción con las señales entregadas por los nervios o vasos sanguíneos 9,10. En segundo lugar, los tejidos no-LG circundantes pueden proporcionar factores que regulan el desarrollo LG 4. Para evitar esto otros componentes del tejido no-mesenquimales se deben retirar antes de la cultura. En tercer lugar, en la actualidad no somos capaces de proporcionar las condiciones necesarias para cytodifferent completaiation en un tejido completamente funcional. Este es el caso para todos los órganos cultivados ex vivo y es probable debido a múltiples razones, incluyendo la ausencia de vasos sanguíneos y nervios funcionales y / o fuerzas mecánicas de los tejidos circundantes. A pesar de estas advertencias, los mecanismos descubiertos en cultivo ex vivo han demostrado ser recapitulado en posteriores experimentos in vivo, haciendo de este un sistema robusto para probar nuevas hipótesis 8,11.
Se ha demostrado que las vías de desarrollo y regenerativos se superponen de manera significativa, lo que indica que el sistema de cultivo ex vivo también se puede emplear para estudiar la regeneración de órganos 12. Aunque no hemos demostrado este aspecto aquí estamos, y otros, hemos demostrado previamente la glándula salival embrionaria se puede utilizar para modelar los efectos de la radiación terapéutica en el daño de órganos y regeneración 13. Se necesitan futuros estudios para explorar el uso de la LG sistema ex vivo comoun modelo para la regeneración de tejidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el financiamiento proporcionado por el Programa de Asignación de Recursos de la UCSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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