Introduction
الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية في كل مكان وفيرة من الدماغ. ومن الثابت أن الخلايا النجمية خدمة الدعم الحيوي والأدوار التماثل الساكن بما في ذلك التخفيف من K + التركيز في الفضاء خارج الخلية، امتصاص الناقلات العصبية، فضلا عن توفير المواد المغذية. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة أنها أيضا عرض [كا 2+] ط إشارات، والتي تحدث بشكل عفوي وبنسبة نشاط الخلايا العصبية 1. وجود نجمية [كا 2+] ط إشارات لقد كان يعتقد على نحو متزايد لتحريك تواصلهم مع الخلايا العصبية، وعلى هذا النحو قد تفسر على أنها شكل من أشكال "كا 2+ استثارة" داخل الخلايا النجمية. وتشير البيانات المتاحة على مدى العقدين الماضيين في ضبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية التي قد تواصل، ربما بطريقة ثنائية الاتجاه. أولا، تستجيب الخلايا النجمية في كثير من الأحيان مع زيادة في [كا 2+] أنا عندما تفعيلها من خلال الموصلات العصبية وneuromodulators سراحهم من الخلايا العصبية 2. الثانية، [كا 2+] ط زيادات في الخلايا النجمية تسبب اطلاق سراح يشير الجزيئات من الخلايا النجمية التي بدورها قد تؤثر على الخلايا العصبية والأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن الجزيئات التي صدرت من الخلايا النجمية تؤدي إلى تغيرات في وظائف من نقاط الاشتباك العصبي، والدوائر والسلوك في نهاية المطاف 3-5 عبر نجمية إلى إشارات الخلايا العصبية. ومع ذلك، يظل هذا المجال البحوث تتطور بسرعة، وقيل أن فهم أفضل ومفصل نجمية [كا 2+] هناك حاجة ط لحل بعض الشكوك الحالية 6.
في الأعمال السابقة، وقد تبين أن تحميل الجزء الأكبر من العضوية الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر إلى فشل الخلايا النجمية لكشف موثوق [كا 2+] ط إشارات داخل الخلايا النجمية بكاملها في الثقافة و7-10 في الموقع. وقد نوقشت هذه النتائج من قبل الولايات المتحدة وغيرها 6،11،12. ومؤسسة Emerginز الصورة هي أن [كا 2+] ط إشارات ضمن عمليات نجمية (على سبيل المثال، الفروع والأفرع)، وهي المواقع الأساسية للتفاعل مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية، ونادرا ما يتم استكشافها بالتفصيل. في الآونة الأخيرة، واستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP3 عصاري خلوي، GCaMP5G وGCaMP6 وغشاء البلازما الإصدارات المربوطة (على سبيل المثال، LCK-GCaMP3) قد يسمح دراسة [كا 2+] ط إشارات في مقصورات صغيرة من الخلايا النجمية مثل هذه عمليات رقيقة، بالقرب من غشاء البلازما وداخل الأراضي كلها 7،8. ومع ذلك، GECIs ديك عيب واحد على العضوية الكالسيوم 2+ مؤشر الأصباغ وهذا هو الشرط للطرق الوراثية لتقديم جينات ترميز بشكل انتقائي على الخلايا النجمية في الجسم الحي لفترات تتراوح بين أسابيع لGECIs أن يكون مناسب التعبير عنها. وعادة ما يتحقق التعبير في الجسم الحي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا، الضربة القاضية في الفئران أو مع فيروس أساس تسليم التطبيقالصراصير. في المقالة إن الرب الحالية نفيدكم الأساليب والإجراءات المستخدمة لتقديم GECIs إلى الخلايا النجمية الجسم المخطط باستخدام فيروسات الغدة المرتبطة. ونحن نركز على خلوي GCaMP3 كمثال على ذلك، ولكن يعمل نفس الإجراء الأساسي لأي GECI الآخرين أو البروتين الفلوري مراسلة مقرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع البروتوكولات الحيوانية وفقا للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا.
1.1) إعداد ممص مكروى وAAV2 / 5 الفيروسات تحميل
- استخدام غرامة بال micropipettes الزجاج البورسليكات لحقن الفيروس. سحب ممص مكروى باستخدام برنامج سحب من خطوتين مع مجتذب العمودي. شطبة ماصة بزاوية 40 درجة باستخدام طاحونة ماصة. سوف ماصة الذي يعتبر مثاليا للاستخدام يكون قطرها غيض من 20 - 40 ميكرون، ويبلغ طوله عرقوب عن 6 - 7 مم. الأوتوكلاف ماصة والأدوات الجراحية. وتعقيم الحفر بواسطة المسح مع الايثانول 70٪.
- تخزين فيروس AAV2 / 5-GfaABC 1-D.cyto GCaMP3.SV40 (1.5 × 10 13 GC / مل)، في -80 درجة مئوية في 10 مكل. فقط قبل الجراحة، واخراج مأخوذة من الثلاجة وتخزينها على الجليد حتى استخدامها لملء عشرالبريد ممص مكروى.
- ملء ممص مكروى مع فيروس باستخدام مضخة الحقنة. ربط بإحكام واحدة من نهاية قطعة من الأنابيب، من خلال ضغط أنابيب بحجم مناسب المناسب، لحقنة زجاجية مع الغطاس المسلحة. إرفاق ممص مكروى تعقيمها إلى الطرف الآخر من قطعة من الأنابيب من خلال بحجم مناسب ضغط إبرة القابلة للإزالة المناسب.
- قبل تحميل ناقلات فيروسية، وإزالة فقاعات الهواء من نظام الضخ بما في ذلك أنابيب، محقنة وممص مكروى عن طريق ملء النظام مع الزيوت المعدنية الملونة مع السودان رابعا الأحمر (~ 1 ملغ / 50 مل) في حقنة 1 مل مع إبرة (27 G ).
- وضع قطعة نظيفة من بارافيلم تحت ممص مكروى الزجاج، والاستغناء من 5 - 10 ميكرولتر من ناقلات فيروسية على بارافيلم.
- تمتص ناقلات فيروسية عن طريق تحريك المكبس من حقنة الخلف عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة، وترسيم الحدود بين ناقلات النفط وعلى ماصة الزجاج.
1.2) التخدير، قص الشعر، HEAD التثبيت والإعداد للحج القحف
- وضع الماوس (P49-63، C57BL / 6) في غرفة مليئة N 2 O و O 2 و 5٪ الأيزوفلورين. تقييم عمق التخدير عن فقدان حركة هادفة وتباطأ معدل التنفس (~ 60-90 / دقيقة). قص الشعر على الرأس عندما يتم تخدير الفأر.
- تناسب الماوس في إطار التجسيمي، مع رئيسها تأمينها بواسطة القضبان الأذن حادة وأنفها وضعت في نظام التخدير والتهوية. الحفاظ على الأيزوفلورين المستمر عند 2 - 3٪. تطبيق مرهم الدموع الاصطناعية لكلتا العينين منذ الفئران تفقد المنعكس طرفة لهم تحت التخدير.
- إدارة 0.05 مل من البوبرينورفين (0.1 ملغ / مل) عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم.
- منطقة جراحية نظيفة مع 10٪ البوفيدون اليود والكحول 70٪ ثلاث مرات، بالتناوب بين الحلين وبدءا البوفيدون اليود. نبدأ من الجبهة ومسح نحو الخلف لإزالة أي قطع الشعر بالفعل.
- جعل شق الجلد على كبار سو الرأس الذي يبدأ بين العينين وينتهي بين الأذنين.
1.3) حج القحف وإبر دقيقة جدا
- إزالة السمحاق عن طريق تمرير مع مسحة القطن ومن ثم تجف على سطح الجمجمة مع كرات القطن الأسنان. جعل علامة حول موقع الحقن، وحفر حول حافة علامة باستخدام لدغ الصلب الصغيرة مدعوم من الحفر بسرعة عالية.
- إزالة العظام وتنظيف السطح مع المياه المالحة.
- وضع ماصة في ظهري ترك الوحشي المخطط مع الإحداثيات التالية (مم): +0.8 الأمامي الخلفي، وسطي الاطراف: +2.0، ظهري، بطني من سطح حنوني: -2.4 13. لاحظ أن هذه الإحداثيات تعني أن رأس الإبرة حقن مكروي يجلس فوق المخطط ظهراني (الشكل 1A، B)، وهذا يعني أن يخرقها إلا قليلا داخل هذه النواة. تجنب الأوعية الدموية الضارة. إذا يحدث ماصة ليكون الحق على الأوعية الدموية، وضبط قليلاتنسق كتبها ~ 0،1-0،2 مم.
- بدء حقن بمعدل حقنة وضعت في 0.2 ميكرولتر / دقيقة، وعادة حقن 1-1،5 ميكرولتر من الفيروس.
- ترك ماصة في المكان بعد الحقن لمدة 10 دقيقة، ثم سحب ماصة ببطء.
- الانتهاء من طريق إغلاق الجرح الجراحي مع خياطة مستمرة النايلون الخارجي خياطة.
1.4) الإنعاش
- ضع الماوس في قفص نظيفة على وسادة التدفئة لمدة 24 ساعة. لا عودة ماوس أن خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- إضافة ميثوبريم Sulfamethoxiazole (5 مل لكل 500 مل من الماء، تحتوي على 40 ملغ و 200 ملغ ميثوبريم sulfamethoxiazole) في الماء لمدة أسبوع. إدارة البوبرينورفين مرتين يوميا لمدة تصل إلى 3 أيام بعد الجراحة.
- الحفاظ على الماوس على ضوء الظلام دورة 12 ساعة، الطعام والماء يوميا، والثانية هي المرجحة مرة واحدة في اليوم الواحد يصل إلى 3 أيام بعد الجراحة. في هذه الأيام 3، وتعتبر أي الفأر مع فقدان أكثر من 10٪ من وزن الجسم كما للخطر، وسيتم الموت الرحيم بدلا من التعرض للالتجريب.
- بشكل منفصل، قم بتغيير القفص الماوس مرتين في الأسبوع، ورصد للصحة العامة مرة واحدة يوميا على الأقل. عادة، يتم استخدام الماوس غضون 2 - 3 أسابيع بعد إبر دقيقة جدا التجسيمي.
2. إعداد شريحة الدماغ الحاد للمتحد البؤر الكالسيوم 2+ التصوير
2.1) إعداد وتسجيل القطع الحلول.
- إعداد قطع حل تضم (مم): 194 السكروز، 30 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 10 D-الجلوكوز، 1 MgCl 2، 1.2 ناه 2 ص 4، و 26 NaHCO 3، مشبعة 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- إعداد الحل تسجيل تضم (مم): 124 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 1 MgCl 2، 10 D-الجلوكوز، 2 CaCl 2، 1.2 ناه 2 ص 4 3؛ درجة الحموضة 7،3-7،4، 290-295 الميلي أسمول، مشبعة 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. ملء كوب شريحة المخ بمحلول عقد التسجيل، والاحتفاظ بها في 34 درجة مئوية.
2.2) التقطيع
- بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع إبر دقيقة جدا التجسيمي، بعمق والميؤوس تخدير الماوس، ثم قطع رأس ذلك.
- استخراج الدماغ، واستخدام شفرة لإزالة النصف الأيمن uninjected، وجبل اليسار واحدة على علبة vibratome باستخدام الغراء عظمى. ملء علبة vibratome مع العازلة قطع الجليد الباردة، والحفاظ على تشبع مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
- قطع شرائح الدماغ الاكليلية الجسم المخطط أو السهمي في سمك 300 ميكرون. عادة، 5 - 4 الاكليلية، أو 6-7 شرائح الجسم المخطط السهمي يمكن جمعها.
- نقل الشرائح إلى عقد الكأس شريحة تحسنت في 34 درجة مئوية، والاحتفاظ بها هناك لمدة 30 دقيقة قبل تخزينها في درجة حرارة الغرفة لاحق recordiنانوغرام.
- احتضان شرائح الدماغ في المخزن تسجيل الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل [كا 2+] ط التصوير.
3. المناعية (IHC)
- بعد أسبوعين من حقن الفيروس، يروي الماوس transcardially مع برنامج تلفزيوني تليها 10٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني.
- إزالة، إصلاح آخر، بين عشية وضحاها، وcryoprotect الدماغ مخزنة في 30٪ سكروز لمدة 2 يوما على الأقل.
- إعداد 40 ميكرومتر المقاطع باستخدام مشراح ناظم البرد.
- شطف الأجزاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في 10 دقيقة الفاصلة.
- أقسام احتضان لمدة 1 ساعة في برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل الماعز العادي ومع 0.5٪ تريتون X-100.
- احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الأجسام المضادة الأولية التي أعدت في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ تريتون X-100. كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة كما يلي: الدجاج مكافحة GFP 1: 1000، والماوس المضادة للS100β 1: 400، والماوس مكافحة NeuN 1: 600، والماوس مخلقة مكافحة الجلوتامين 1: 300.
- شطف الأجزاء 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في 10 مفي فترات.
- احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية أعدت في برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل الماعز العادي لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كانت الأجسام المضادة الثانية على النحو التالي: الماعز المضادة للماوس Alexa546 1: 500، الماعز المضادة للدجاج Alexa488 1: 500.
- جبل الأقسام على الشرائح الزجاجية وجافة وتطبيق عدة قطرات من antifade المتوسطة المتزايدة، ثم تغطية ببطء الأقسام مع ساترة الزجاج. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية.
- التقاط صور على المجهر متحد البؤر مع 40X عدسة الغمر النفط مع الفتحة العددية 1.3.
4. متحد البؤر [كا 2+] ط التصوير
ملاحظة: [كا 2+] ط التصوير تم باستخدام مجهر متحد البؤر مع الغمر بالماء 40X عدسة الهدف مع الفتحة العددية 0.8.
- 2 مل لكل - ما بين 1 و 5 ساعة تشريح، مكان شريحة في غرفة تسجيل وsuperfuse مع العازلة تسجيل الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة مع معدل التدفق من 1 بعددقيقة. ثم وضع القيثارة البلاتين مع خيوط النايلون على أعلى شريحة لتقليل الحركة أثناء التجربة.
- تصور وتحديد المخطط الظهري مع التلألؤ مشرق الميدان تحت هدف الغمر بالماء 10X.
- التبديل إلى غمر المياه 40X عدسة الهدف، وتشغيل خط 488 نانومتر ليزر الأرجون. عن طريق تغيير البؤري، والعثور على خلايا تقع على بعد حوالي 20 ميكرون تحت سطح شريحة، عرض مضان القاعدية في سوما والفروع والأفرع. من المذكرة، وخلايا للخطر عادة مضان عرض مستوى أعلى من المتوسط، والتي ينبغي تجنبها.
- استخدام وضع "إطار مسح" لبدء المسح الضوئي. عادة، لشدة الليزر تعديل إلى 0.5 - 5٪ من الحد الأقصى لانتاج كافية لصورة [كا 2+] أنا مع خلوي GCaMP3. لرصد [كا 2+] ط ديناميكية في كامل أراضي النجمية، و "مسح إطار 'مع معدل المسح من 1 ثانية لكل إطار أو أسرع هو recommended، ولكن هذا يحتاج إلى أن قرر اعتمادا على التجربة في السؤال.
- إذا لزم الأمر، إلى صورة [كا 2+] i في العمليات، واستخدام التكبير الرقمي من 2 - 3 أضعاف لمراقبة 1 - 2 الخلايا النجمية في مجال كامل من الرأي.
- لتجنب بكسل المشبعة أثناء التسجيل، واستخدام وضع البحث "حلو" لpseudocolor الخلايا. تبدأ دائما مع "تسجيل طيار" لمدة 5 دقائق، لاختبار إذا ظهر اللون الأحمر كما يدل على التشبع. إذا كان الأمر كذلك، خفض انتاج الليزر السلطة، أو خفض PMT / كسب / موازنة القيم وإجراء تسجيل تجريبي آخر لاختبار القيم بكسل هي في حدود غير المشبعة. عادة، المعلمات مجتمعة استخدمت لتصوير نجمية [كا 2+] i في المخطط هي كما يلي: الليزر انتاج الطاقة 0،5-5٪ (10 ميغاواط)، PMT 550-650 فولت، وزيادة 2.0 - 3.5X، وتعويض 0 - 5٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتعبير محدد نجمية من خلوي GCaMP3 في المخطط، استخدمنا الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) من 5 المصلي، وGFAP GfaABC 1 D المروج (الشكل 1A)، وهو ما ثبت سابقا أن يقود GCaMP3 قوية ومراسل الجين التعبير في قرن آمون والقشرية الخلايا النجمية 8،14. بعد أسبوعين من حقن مكروي الفيروس في الجسم المخطط الماوس، تم perfused لالماوس (~ 10 أسابيع من العمر) وأجريت IHC على أقسام الدماغ رقيقة لتقييم التعبير خلوي GCaMP3 في المخطط (الشكل 1B). اكتشفنا خلوي GCaMP3 باستخدام الأجسام المضادة GFP والملون أيضا شرائح مع علامة نجمية معروفة، S100β. تم العثور خلوي GCaMP3 التعبير فقط في الخلايا إيجابية S100β. لم يتم العثور على التعبير في الخلايا العصبية تصور مع NeuN (الشكل 2A و 2B)، مما يشير تعبير معين نجمية. الأهم من ذلك، تم الكشف خلوي GCaMP3 التعبير في ~ 60٪ من خلايا إيجابية S100β (فايجوري 2C).
الخلايا النجمية تستجيب لإهانات الدماغ مثل الإصابات ونقص التروية والعدوى عن طريق عرض التغييرات التي أصبحت تعرف باسم التفاعل نجمية، التي تمثل طيفا من التغييرات المحتملة بين معتدلة وحادة 15. سعينا لتقييم ما إذا تسبب حقن مكروي فيروس العلني نجمية التفاعل. وقد تبين سابقا أن انخفاض مستويات التعبير عن مخلقة الجلوتامين (ع) وارتبطت مع الخلايا النجمية على رد الفعل 16،17. وبالتالي، تم مقارنة GS التعبير في المخطط من WT وفيروس حقن الفئران. لم نعثر على أي تغييرات كبيرة في قطاع غزة التعبير في الخلايا النجمية الجسم المخطط التالية حقن فيروس (الشكل 3A - C)، مما يدل على عدم التفاعل نجمية العلني باستخدام مستويات GS كمقياس. ويمكن توسيع نطاق هذا النهج العام في العمل المستقبلي لتقييم نجمية التفاعل باستخدام علامات أخرى من التفاعل. ومع ذلك، لاحظ أن مستويات GFAP قد لا يكون وسيلة مناسبة لقياس التفاعل في striatالخلايا النجمية الله، لأنه لم يتم أعرب GFAP في المستويات التي يمكن اكتشافها في معظم الخلايا النجمية الجسم المخطط في ظل الظروف القاعدية 18. باختصار، باستخدام IHC نستنتج كان خلوي GCaMP3 تعبير قوي ومحدد لالنجمية في المخطط، والتي لم حقن الفيروس لا يسبب نجمية التفاعل وفقا لتقييم GS التغييرات مستوى التعبير.
نحن على استعداد بجوار شرائح الدماغ الحادة من فيروس الفئران المحقونة لصورة [كا 2+] i في الخلايا النجمية الجسم المخطط. تم إعداد 300 ميكرومتر شرائح السهمي أو الاكليلية الحادة سميكة، وبعد فترة من الانتعاش وضعت الشرائح في غرفة تسجيل على المجهر متحد البؤر ل[كا 2+] ط التصوير باستخدام خط 488 نانومتر ليزر الأرجون. يمكن بسهولة التعرف الخلايا النجمية الجسم المخطط التعبير خلوي GCaMP3 في معظم (عادة كل) من شرائح الجسم المخطط (~ 6-7 شرائح في الماوس)، كما أظهرت مخضر وضوحا في الخلايا مع التشكل كثيف بشكل واضح (الشكل 4 الشكل 4A. لا يقل عن 10 النجمية التي تظهر خلوي GCaMP3 يمكن تصوير ويتم رسم الشكل 4A كما في المناطق ذات الاهتمام (ROI). كان 3.0 الضروري تحديد الخلايا النجمية واحدة (الشكل 4B) - أعلى التكبير التصوير مع تقريب رقمي إضافي من 2.0. في ظل هذه الظروف، تم الكشف عن الاراضي نجمية بأكملها خلوي GCaMP3 التعبير، كما هو مبين في الشكل 4B. تم قياس عفوية الكالسيوم 2+ إشارات بسهولة في somata وكذلك في الفروع والأفرع 6 من الخلايا النجمية.
الشكل 1: تسليم الفيروسي من GECIs (على سبيل المثال خلوي GCaMP3) من خلال AAV2 / 5 في المخطط الماوس الكبار. A. تخطيطي يوضح بروتوكول لAAV2 / 5 إبر دقيقة جدا في المخطط ظهراني.B. يبين موقف التقريبي للإبرة حقن مكروي فيما يتعلق المخطط والإحداثيات المستخدمة في الحقن التجسيمي. تم تحميل صورة لشريحة نيسل الملطخة في لوحة ب ألين من الدماغ ATLAS.
كان خلوي-GCaMP3 تعبير محدد لالنجمية الجسم المخطط: الرقم 2. A - B. صور الممثل تبين أن خلوي GCaMP3 التعبير colocalizes مع علامة للحصول على الخلايا النجمية (S100β) (B)، ولكن ليس مع علامة للحصول على الخلايا العصبية (NeuN) (A) C. شريط ملخص بياني للتجارب colocalization مثل تلك التي تظهر. في ألف وباء.
الرقم 3: لم خلوي-GCaMP3 التعبير داخل الخلايا النجمية الجسم المخطط لا تسبب تغيرات في التعبير عن GS.A - B. صور ممثل GCaMP3 وGS IHC من الفئران التي تلقت AAV2 / 5 لGCaMP3. يتم عرض الصور للسيطرة على الفئران غير المحقونة أيضا. C. بار الرسم البياني يلخص النتائج من تجارب مثل تلك الموجودة في A و B (NS تشير يست كبيرة باستخدام اختبار (ت) طالب أونبايريد وP <0.05).
الشكل 4: أمثلة التمثيلية لل[كا 2+] أنا سجلت إشارات من الخلايا النجمية الجسم المخطط مع خلوي GCaMP3. A. وبالارض ض المكدس صورة تظهر 10 النجمية (مرقمة من 1 - 10). ويتتبع المعرض أدناه [كا 2+] ط إشارات سجلت أكثر من 5 دقائق من 10 خلايا يظهر في B. وبالارض والتكبير في ض. صورة -stack لastrocyte.The احد يتتبع المعرض أدناه [كا 2+] طإشارات سجلت أكثر من 5 دقائق لخلية واحدة هو مبين في (ب).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أتاحت الطرق الموصوفة هنا لنا للتعبير عن خلوي GCaMP3 الخلايا النجمية في الجسم المخطط في الجسم الحي لاحق [كا 2+] ط التصوير في الموقع. هذا الأسلوب له مزايا أكثر باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في، بما في ذلك التعبير القوي للاستهداف البروتين، وسرعة ومرونة التنفيذ التجريبي وخصوصية التشريحية. تم العثور على التعبير عن GCaMP3 باستخدام AAV2 / 5 أن تكون محددة وقوية. مزيج من GFAP GfaABC 1 D المروج مع AAV من 5 المصلي أمر بالغ الأهمية لتحقيق الخصوصية. الحد من تقنية الموضحة هنا هو أن عدوى الفيروس وإجراء جراحة قد يسبب نجمية التفاعل، خاصة مع فيروسات عالية عيار 19. الأهم من ذلك، في الدراسة الحالية، AAV2 / 5 إبر دقيقة مع عيار منخفض نسبيا لا يسبب انخفاضا في قطاع غزة التي ارتبطت مع نجمية التفاعل 19. وقد تم الإبلاغ عن ضوابط مشابهة لهيبالخلايا النجمية ocampal 8. ومع ذلك، فمن المهم التأكيد على ضرورة هذه الضوابط لكل منطقة الدماغ التي يتعين دراستها، لأسباب ليس أقلها النجمية هي غير متجانسة 20، ولأنها على الأرجح أداء وظائف مختلفة في مناطق مختلفة من الدماغ.
أحد العوامل الهامة التي قد تؤثر على متانة التعبير الجيني المستهدفة باستخدام حقن مكروي الفيروس هو الإحداثيات في الاستخدام، والتي تختلف بين سلالات مختلفة الماوس والتغيرات على مدى تطور الحيوانات. واستخدمت فقط C57BL / 6 الفئران من ~ 8 أسابيع من العمر طوال هذه الدراسة. وقد تبين أيضا أن التعبير الفيروسي من GFP الخلايا العصبية في الجسم المخطط والخلايا النجمية في الفئران يمكن أن يتم الكشف عن 4 أيام بعد الحقن، وصلت إلى هضبة من قبل 2-4 أسابيع بعد الحقن، ومن ثم ظلت مستقرة لمدة 9 أشهر بعد الحقن 21. وبالطبع وقت خلوي GCaMP3 التعبير لم يحدد بالضبط هنا، ولمدة أسبوعين على الأقل للتعبير عن الفيروسات والموصى بها.
يمكن الآن استخدام نهج AAV2 / 5 التعبير بوساطة من GECIs الخلايا النجمية في الجسم المخطط أن تستخدم من أجل فهم أفضل نجمية [كا 2+] ط يشير في المخطط. على وجه التحديد، خلوي GCaMP3 مستوى التعبير مرتفع بما فيه الكفاية للسماح التصوير من [كا 2+] ط إشارات في المجموعات الصغيرة من الخلايا النجمية (~ 10 خلايا) وداخل الأراضي كاملة من الخلايا النجمية واحدة. تحليل مفصل ل[كا 2+] ط إشارات لا تزال جارية، ولكن حتى الآن [كا 2+] تم الكشف عن ط إشارات من العمليات البعيدة بقدر ~ 50 ميكرون بعيدا عن سوما (الشكل 4). تجارب تفصيلية عن نجمية [كا 2+] ط إشارات وظائف المترابطة والمسبب لها ضمن المخطط ممكنة. في المستقبل، والنهج المكررة (أي المروجين) هناك حاجة لتقديم GECIs إلى السكان المحددة وراثيا من الخلايا النجمية بحيث يمكن للمرءاستكشاف إشارات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية متنوعة من السكان 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد أيد غالبية العمل والموظفين المشاركين من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS060677 وجزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MH099559 وMH104069 (لBSK). وأيد بعض الأعمال أيضا من قبل مؤسسة CHDI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
- Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
- Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
- Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
- Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
- Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).
