ההדמיה תאית Ca Published: November 19, 2014 doi: 10.3791/51972

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Ruotian Jiang¹, Martin D. Haustein¹, Michael V. Sofroniew², Baljit S. Khakh^1,2

¹Department of Physiology, University of California Los Angeles, ²Department of Neurobiology, University of California Los Angeles

Introduction

האסטרוציטים הם תאי גליה נמצאים בכל מקום ובשפע של המוח. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים לשמש תמיכה חיונית ותפקידים ההומיאוסטטית כוללים חציצה של K ⁺ ריכוז במרחב החוץ תאי, ספיגה של מוליכים עצביים כמו גם חומרים מזינים מתן. עם זאת, המחקרים אחרונים מראים שהם גם להציג _אני אותות [Ca ^{2 +],} אשר מתרחשים באופן ספונטני ועלו בפעילות עצבית ^1. קיומו של astrocyte [Ca ^{2 +]} איתות _אני כבר חשב יותר ויותר כדי לעורר את התקשורת שלהם עם תאי עצב, ולפיכך, היה להתפרש כסוג של "רגישות Ca ^{2 +"} בתוך האסטרוציטים. הנתונים הזמינים בשני העשורים האחרונים מצביעים על שתי הגדרות שבי האסטרוציטים ונוירונים רשאיות להתקשר, אולי באופן דו-כיווני. ראשית, האסטרוציטים מגיבים לעתים קרובות בעלייה ב[ Ca ^{2 +]} _i כאשר מופעלת על ידי נוירוטרנסמיטורים וneuromodulators שוחררה מתא העצב ^2. שנית, [Ca ^{2 +]} _אני עולה בתוך האסטרוציטים לגרום לשחרור של מולקולות איתות מהאסטרוציטים שבתורו יכול להשפיע נוירונים וכלי דם. ראיות עולה כי מולקולות שוחררו מהאסטרוציטים להביא לשינויים בפונקציות של סינפסות, מעגלים וסופו של דבר התנהגות ^3-5 באמצעות איתות astrocyte לנוירון. עם זאת, זה עדיין תחום מחקר המתפתח במהירות, וזה כבר טען שיש צורך בהבנה טובה יותר ומפורטת של astrocyte [Ca ^{2 +]} _i כדי לפתור חלק מאי הוודאות הנוכחי ^6.

בעבודה האחרונה, זה היה הראה כי טעינה בתפזורת של צבעי מחוון אורגניים Ca ^{2 +} לתוך האסטרוציטים לא מצליחה לזהות באופן אמין [Ca ^{2 +]} _i אותות בתוך האסטרוציטים כל בתרבות ובאתרו ^7-10. ממצאים אלה נדונו על ידינו ואחרים ^6,11,12. Emerginתמונת g היא ש[ Ca ^{2 +]} _i אותות בתוך תהליכי astrocyte (למשל, ענפים וbranchlets), המהווים את האתרים העיקריים לאינטראקציות עם תאי עצב וכלי דם, כמעט שלא נחקר בפירוט. לאחרונה, השימוש באינדיקטורים מקודד גנטי סידן (GECIs) כגון GCaMP3 cytosolic, GCaMP5G וGCaMP6 וקרום פלזמה גרסאות קשורות (למשל, LCK-GCaMP3) התיר למחקר _שלי אותות [Ca ^{2 +]} בתאים קטנים של האסטרוציטים כזה רזים כמו תהליכים, ליד קרום הפלזמה ובתוך טריטוריות שלמות ^7,8. עם זאת, יש לי GECIs חסרון אחד על פני צבעי מחוון אורגניים Ca ^{2 +} וזה הדרישה לשיטות גנטיות כדי לספק את הגנים מקודדות באופן סלקטיבי לתאים כוכביים in vivo לתקופות של שבועות לGECIs להיות כראוי הביע. ביטוי in vivo מושגת בדרך כלל באמצעות עכברים מהונדסים, לדפוק בעכברים או באפליקצית משלוח מבוסס וירוסמקקים. במאמר יופיטר הנוכחי אנו מדווחים שיטות ונהלים מועסקים כדי לספק GECIs להאסטרוציטים striatal באמצעות adeno הקשורים וירוסים. אנו מתמקדים בציטומגלווירוס-GCaMP3 כדוגמא, אבל באותו ההליך בסיסי עובד עבור כל Geci אחר או כתב חלבון פלואורסצנטי מבוסס.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים היו בהתאם למכוני בריאות הלאומי של ארה"ב מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש ב- UCLA.

1.1) הכן טוען Micropipette וAAV2 / 5 וירוס

1. השתמש micropipettes זכוכית בורוסיליקט קנס על הזריקה של הנגיף. משוך את micropipette באמצעות תכנית מושכת בשני שלבים עם חולץ אנכי. פוע פיפטה בזווית של 40 מעלות על ידי שימוש במטחנת פיפטה. פיפטה כי הוא אידיאלי לשימוש תהיה בקוטר טיפ של 20 - 40 מיקרומטר ואורך שוק של 6 - 7 מ"מ. החיטוי פיפטה ומכשירי ניתוח. התרגיל מעוקר על ידי מנגב עם 70% אתנול.
2. אחסן את הווירוס AAV2 / 5-GfaABC ₁ D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 ¹³ GC / ml), ב -80 מעלות צלזיוס ב 10 aliquots μl. רק לפני הניתוח, להוציא את aliquots מהמקפיא ולאחסן על קרח עד משמש למילוי הmicropipette דואר.
3. מלא את micropipette עם וירוס באמצעות משאבת מזרק. בחוזקה חבר קצה אחד של פיסת הצינור, דרך דחיסת צינורות בגודל מתאימה הולמת, למזרק זכוכית עם בוכנה מחוזקת. צרף micropipette autoclaved לקצה השני של פיסת הצינור דרך דחיסת מחט נשלף בגודל מתאים מתאימה.
4. לפני טעינת וקטור ויראלי, להסיר בועות אוויר ממערכת השאיבה כולל צינורות, מזרק וmicropipette על ידי מילוי המערכת עם שמן מינרלים צבעוניים עם IV סודאן האדום (~ 1 מ"ג / 50 מיליליטר) במזרק 1 מיליליטר עם מחט (27 G ).
5. מניחים חתיכה נקייה של parafilm תחת זכוכית micropipette, ולוותר על 5 - 10 μl של וקטור ויראלי על parafilm.
6. למצוץ וקטור ויראלי על ידי הזזת הבוכנה של המזרק לאחור על 0.5 μl / דקה, ולסמן את הגבול בין הווקטור והשמן על פיפטה הזכוכית.

1.2) הרדמה, חיתוך שיער, HEAD קיבוע והכנה לCraniotomy

1. שים עכבר (P49-63, C57BL / 6) לתוך התא מלא בN ₂ O ו- O _2, וisoflurane 5%. להעריך את עומק ההרדמה על ידי אובדן של תנועה תכליתית ושיעור האטת נשימה (~ 60-90 / min). לגזור את שיער על הראש כאשר העכבר הוא הרדים.
2. התאם את העכבר במסגרת stereotaxic, עם הראש שלה מובטח בארים בוטים אוזן ואפה להציב לתוך מערכת הרדמה והנשמה. לשמור isoflurane הרציף של 2 - 3%. החל משחה דמעות מלאכותיות לשתי העיניים מאז עכברים לאבד רפלקס המצמוץ שלהם תחת הרדמה.
3. נהל 0.05 מיליליטר של עצירות (0.1 מ"ג / מיליליטר) על ידי הזרקה תת עורית להקלה על כאב.
4. אזור נקי כירורגית עם 10% יוד povidone ושלוש פעמים אלכוהול 70%, לסירוגין בין שני הפתרונות ומתחיל עם יוד povidone. התחל מהחזית ולנגב לכיוון האחורי כדי להסיר את כל שערות כבר חתכו.
5. לעשות חתך בעור על o העליונהf הראש שמתחיל בין העיניים ומסתיים בין האוזניים.

1.3) Craniotomy וmicroinjections

1. הסר את קרום העצם על ידי והעביר עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לייבש את פני השטח של הגולגולת עם כדורי צמר גפן שיניים. להטביע את חותמו סביב אתר ההזרקה, ולקדוח מסביב לקצה של הסימן באמצעות Burr פלדה קטן מופעל על ידי תרגיל במהירות גבוהה.
2. הסר את העצם ולנקות את השטח עם מי מלח.
3. הנח את פיפטה לתוך הגב עזב לרוחב סטריאטום עם הקואורדינטות הבאות (מ"מ): 0.8 קדמי, אחורי, המדיאלי-צדדיות: 2.0, גב-הגחון מהשטח pial: -2.4 ^13. שים לב שהקואורדינטות אלה אומרת שקצה מחט microinjection יושב בדיוק מעל סטריאטום דורסולטרלי (איור 1 א, ב '), מה שאומר שרק מעט חודר בתוך גרעין זה. הימנע מכלי דם מזיקים. אם פיפטה קורה להיות ממש על כלי דם, מעט להתאיםקואורדינטות על ידי ~ 0.1-0.2 מ"מ.
4. התחל הזרקה עם שיעור הזרקה נקבע על 0.2 μl / דקה, ובדרך כלל להזריק 1 עד 1.5 μl של וירוס.
5. השאר את פיפטה במקום לאחר ההזרקה במשך 10 דקות, ולאחר מכן למשוך את פיפטה לאט.
6. סיים על ידי סגירת פצע הניתוח עם תפר ניילון חיצוני תפר מתמשך.

1.4 שחזור)

1. שים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום למשך 24 שעות. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאיר ללא השגחה העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal.
2. להוסיף Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 מ"ל לכל 500 מיליליטר מים, המכיל 40 trimethoprim מ"ג ו -200 sulfamethoxiazole מ"ג) במים במשך שבוע. לנהל עצירות שתי פעמים ביום לתקופה של עד 3 ימים לאחר ניתוח.
3. שמור את העכבר על מחזור אור-חושך 12 שעות, האכיל והשקה יומי,nd משוקלל פעם אחת ביום עד לעד 3 ימים לאחר ניתוח. ב 3 הימים האלה, כל עכבר להפסד של יותר מ -10% במשקל גוף נחשב כסכנה, ויהיה מורדמים במקום להיות נתון לניסויים.
4. בנפרד, לשנות את כלוב העכבר פעמיים בשבוע, ולפקח על בריאות כללית לפחות פעם ביום. בדרך כלל, העכבר משמש בתוך 2 - 3 שבועות לאחר microinjections stereotaxic.

2. חריף מוח Slice הכנת הדמיה ^{2 +} Confocal Ca

2.1) עריכת חיתוך ופתרונות הקלטה.

1. הכן חיתוך פתרון כולל (מ"מ): 194 סוכרוז, 30 NaCl, KCl 4.5, 10 D-גלוקוז, 1 MgCl _2, 1.2 לאא ₂ PO _4, ו -26 NaHCO _3, רווי עם 95% O _2, 5% CO _2.
2. הכן פתרון הקלטה הכולל (מ"מ): 124 NaCl, KCl 4.5, 1 MgCl _2, 10 D-גלוקוז, 2 CaCl _2, 1.2 לאא ₂ PO ₄ 3; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm, רווי עם 95% O _2, 5% CO _2. כשמלא את כוס פרוסת המוח מחזיקה ביחד עם פתרון הקלטה, ולשמור אותו על 34 מעלות צלזיוס.

2.2) חיתוך

1. שבועות עד שלושה שבועות לאחר microinjections stereotaxic, עמוק וסופנים להרדים את העכבר, ולאחר מכן לערוף אותו.
2. חלץ את המוח, ולהשתמש בלהב כדי להסיר את האונה הימנית uninjected, והר נותר אחד על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. מלא את מגש vibratome עם חיץ חיתוך קר כקרח, ולשמור להרוות אותו עם 95% O _2, 5% CO _2.
3. חותכים פרוסות מוח striatal העטרה או sagittal ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל, 4 - העטרה 5, או 6 - 7 פרוסות striatal sagittal ניתן לאסוף.
4. העבר את הפרוסות לכוס מחזיקה פרוסה חיממה על 34 מעלות צלזיוס, ולשמור אותם שם למשך 30 דקות לפני אחסונם בטמפרטורת חדר למשך recordi הבאng.
5. דגירה את פרוסות המוח במאגר הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה _i [Ca ^{2 +].}

3. אימונוהיסטוכימיה (IHC)

1. שבועיים לאחר הזרקת וירוס, תנקב את העכבר transcardially עם PBS ואחריו פורמלין 10% ב- PBS.
2. הסר, לאחר לתקן לילה, וcryoprotect המוח בסוכרוז 30% שנאגרו במשך לפחות 2 ימים.
3. הכן 40 מיקרומטר חלקים באמצעות microtome cryostat.
4. יש לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS ב -10 מרווח דקות.
5. דגירה סעיפים עבור שעה 1 ב- PBS עם סרום עיזים 10% נורמלים ועם 0.5% Triton X-100.
6. דגירה סעיפי הלילה ב 4 ° C בנוגדן ראשוני שהוכן ב- PBS עם 0.5% Triton X-100. הנוגדנים העיקריים בשימוש היו כדלקמן: עוף אנטי GFP 1: 1,000, העכבר אנטי S100β 1: 400, עכבר אנטי NeuN 1: 600, synthetase אנטי-גלוטמין עכבר 1: 300.
7. יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם PBS על 10 מ 'במרווחים.
8. דגירה סעיפים עם הנוגדנים משני שהוכנו ב- PBS עם 10% עזים בסרום נורמלי עבור שעה 2 בטמפרטורת חדר. הנוגדנים שני היו כדלקמן: עז אנטי עכבר Alexa546 1: 500, עז נגד עוף Alexa488 1: 500.
9. הר את הסעיפים על שקופיות זכוכית, יבשות ולהחיל כמה טיפות של antifade הרכבה בינוני, ואז לכסות באיטיות את החלקים עם coverslip זכוכית. אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס.
10. קח תמונות במיקרוסקופ confocal עם עדשת טבילת שמן 40X עם צמצם מספרי של 1.3.

4. Confocal הדמיה _i [Ca ^{2 +]}

הערה: [Ca ^{2 +]} _i הדמיה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשה אובייקטיבית 40X טבילה במים עם צמצם מספרי של 0.8.

1. בין 1 ל 5 שעות לאחר חיתוך, פרוסה מקום בחדר ההקלטה וSuperfuse עם חיץ הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר עם קצב זרימה של 1 - 2 מ"ל לדקות. ואז למקם את נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי.
2. דמיינו ולאתר את סטריאטום הגב עם הארה שדה בהירה תחת מטרת טבילה במי 10X.
3. לעבור לעדשה האובייקטיבית 40X טבילה במים, ולהפעיל את קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. על ידי שינוי מישור המוקד, למצוא תאים הממוקמים כ -20 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסה, בו מוצגות הקרינה בסיסית בסומה, סניפים וbranchlets. שימו לב, תאים שנפגעו בדרך כלל להציג רמת הקרינה מעל הממוצע, אשר יש להימנע.
4. השתמש במצב 'סריקת מסגרת "כדי להתחיל בסריקה. בדרך כלל, את עוצמת הלייזר המותאמת ל0.5-5% מהתפוקה המקסימלית די תמונה [Ca ^{2 +]} _i עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. לניטור _אני דינמיקה [Ca ^{2 +]} בשטח של האסטרוציטים כל, 'סריקת המסגרת' עם קצב סריקה של 1 שניות לכל מסגרת או מהיר יותר היא recommended, אבל זה צריך להיות החליט בהתאם לניסוי בשאלה.
5. במידת צורך, לתמונה [Ca ^{2 +]} _אני בתהליכים, להשתמש בהגדלה דיגיטלית של 2 - 3 פי לפקח 1 - 2 האסטרוציטים בכל שדה הראייה.
6. כדי להימנע מפיקסלים רוויים במהלך הקלטה, להשתמש במצב בדיקת 'חילו' לPseudocolor התאים. תמיד להתחיל עם "הקלטת פיילוט" למשך כ -5 דקות, כדי לבדוק אם צבע אדום מופיע כאינדיקציה לרוויה. אם כך, להפחית את תפוקת לייזר הכח, או להקטין את PMT / רווח / קיזוז ערכים ולבצע הקלטת טייס אחרת על מנת לבחון את ערכי פיקסל הם בטווח בלתי רווי. בדרך כלל, בשילוב הפרמטרים המשמשים לastrocyte הדמיה [Ca ^{2 +]} _i בסטריאטום היא כדלקמן: פלט כוח לייזר 0.5-5% (10 mW), PMT 550-650 וולט, רווח 2.0 - 3.5x, ולקזז 0 - 5%.

Representative Results

לביטוי ספציפי astrocyte של ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום, היינו וירוס adeno הקשורים (AAV) של סרוטיפ 5, ואמרגן D ₁ GFAP GfaABC (איור 1 א), שהוכח בעבר לנהוג GCaMP3 חזק וגן הכתב ביטוי בהיפוקמפוס והאסטרוציטים בקליפת המוח ^8,14. שבועיים לאחר microinjection הווירוס לסטריאטום העכבר, העכבר (~ 10 שבועות) היה perfused וIHC בוצע על חלקים במוח דקים להעריך ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום (איור 1). אנחנו הבחנו ציטומגלווירוס-GCaMP3 באמצעות נוגדני GFP וגם הכתימו את הפרוסות עם סמן astrocyte ידוע, S100β. ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 נמצא רק בתאים חיוביים S100β. אין ביטוי נמצא בתאי עצב דמיינו עם NeuN (איור 2 א ו -2 ב), המצביע על ביטוי ספציפי astrocyte. חשוב לציין, ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 זוהה ב~ 60% מתאים חיוביים S100β (Figure 2C).

האסטרוציטים להגיב לעלבונות מוח כגון פגיעה, איסכמיה וזיהום על ידי הצגת שינויים שהפכו המכונה תגובתיות astrocyte, המייצגת את ספקטרום של שינויים אפשריים בין מתון עד ¹⁵ חמורים. אנו ביקשנו להעריך אם microinjection הנגיף גרם תגובתיות astrocyte גלויה. זה היה הראה בעבר כי רמות ביטוי מופחתות של גלוטמין synthetase (GS) היו קשורות עם האסטרוציטים תגובת ^16,17. לכן, ביטוי GS בסטריאטום של WT ועכברים וירוס שהוחדר הושווה. לא מצאנו שינויים משמעותיים בביטוי GS בהאסטרוציטים striatal לאחר הזרקת וירוס (איור 3 א - ג), המציין אין תגובתיות astrocyte גלויה באמצעות רמות GS כמדד. זו גישה כללית יכולה להיות מורחבת בעבודה בעתיד כדי להעריך תגובתיות astrocyte באמצעות סמנים אחרים של תגובתיות. עם זאת, שימו לב כי רמות GFAP לא יכולות להיות דרך מתאימה למדידת תגובתיות בstriatהאסטרוציטים אל, כי GFAP לא בא לידי ביטוי ברמות לגילוי ברוב האסטרוציטים striatal בתנאים בסיסיים ^18. לסיכום, על ידי שימוש בIHC אנו מסיקים ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 היה חזק וספציפי להאסטרוציטים בסטריאטום, וכי הזרקת הווירוס לא גרמה לתגובתיות astrocyte כפי שהוערכה על ידי שינויים ברמת ביטוי GS.

אנחנו הבאים הכנו פרוסות מוח חריפות מעכברים שהוזרקו וירוס לתמונה [Ca ^{2 +]} _i בהאסטרוציטים striatal. 300 מיקרומטר פרוסות sagittal או העטרה עבות חריפות הוכנו, ולאחר תקופת ההחלמה את הפרוסות הונחו בתא הקלטה על מיקרוסקופ confocal ל[ Ca ^{2 +]} _i הדמיה באמצעות קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. האסטרוציטים striatal להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בקלות יכולים להיות מזוהים ברוב (בדרך כלל כולם) של פרוסות striatal (~ 6 - 7 פרוסות לכל עכבר), כפי שהם הראו הקרינה ירוקה נראית לעין בתאים עם מורפולוגיה בבירור עבה (איור 4 באיור 4 א; לפחות 10 האסטרוציטים בו מוצגות ציטומגלווירוס-GCaMP3 יכולים להיות צילמו והם זממו באיור 4 א כאזורים של העניין (ROI). הדמיה בהגדלה גבוהה יותר עם ​​זום דיגיטלי נוסף של 2.0-3.0 הייתה צורך לזהות האסטרוציטים יחידים (איור 4). בנסיבות אלה, שטחי astrocyte כל נחשפו על ידי ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3, כפי שמוצגים באיור 4. Ca ^{2 +} אותות ספונטניים נמדדו בקלות בsomata כמו גם בסניפים ובbranchlets של האסטרוציטים ^6.

איור 1: משלוח ויראלי של GECIs (למשל ציטומגלווירוס-GCaMP3) על ידי AAV2 / 5 לסטריאטום העכבר המבוגר. א סכמטי ממחיש את הפרוטוקול לAAV2 / 5 microinjections לסטריאטום דורסולטרלי.ב 'מציג את המיקום המשוער של מחט microinjection ביחס לסטריאטום ואת הקואורדינטות המשמשות לזריקות stereotaxic. התמונה של פרוסה צבעונית Nissl בלוח ב 'הורדה מALLEN מוח האטלס.

איור 2: ביטוי Cyto-GCaMP3 היה ספציפי להאסטרוציטים striatal. - תמונות ב נציג מראים כי ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 colocalizes עם סמן להאסטרוציטים (S100β) (ב), אך לא עם סמן לתאי עצב (NeuN) (א) גרף עמודות סיכום ג לניסויי colocalization כמו אלה שמוצגים. A ו- B.

איור 3: ביטוי Cyto-GCaMP3 בתוך האסטרוציטים striatal לא לגרום לשינויים בביטוי של GS.- תמונות ב נציג GCaMP3 וGS IHC מעכברים שקיבלו AAV2 / 5 לGCaMP3. תמונות לעכברים שהוזרקו ללא שליטה גם מוצגות. גרף בר ג מסכם תוצאות מניסויים כגון אלו בA ו- B (NS מציין לא משמעותי באמצעות הבדיקה של סטודנטים מזווגים t, p <0.05).

איור 4: דוגמאות מייצגות של _i אותות [Ca ^{2 +]} שנרשמו מהאסטרוציטים striatal עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. א שטוח תמונת Z- מחסנית מראה 10 האסטרוציטים (ממוספרים 1 - 10) .the עקבות להלן תכנית [Ca ^{2 +]} _i אותות שנרשמו ב -5 דקות מ-10 התאים שמוצגים בב 'שטוחה וzoomed- בz. תמונת -stack לastrocyte.The יחיד עקבות להלן תכנית [Ca ^{2 +]} _iאותות שנרשמו ב -5 דקות לתא הבודד שמוצג בB.

Discussion

השיטות שתוארו במסמך זה אפשרו לנו להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בהאסטרוציטים striatal in vivo להדמיה הבאה [Ca ^{2 +]} _i באתר. לשיטה זו יתרונות על פני שימוש במהונדס או עכברים לדפוק ב, כוללים ביטוי חזק של החלבון, המהירות ממוקדת וגמישות של יישום ניסיוני וספציפיות אנטומיים. הביטוי של GCaMP3 באמצעות AAV2 / 5 נמצא להיות ספציפי וחזק. השילוב של אמרגן ₁ D GFAP GfaABC עם AAV של סרוטיפ 5 הוא קריטי כדי להשיג את הספציפיות. מגבלה אחת של הטכניקה המתוארת כאן היא שזיהום בנגיף והליך ניתוח עלול לגרום לתגובתיות astrocyte, במיוחד עם וירוסים גבוה כייל ^19. חשוב לציין, במחקר הנוכחי, AAV2 / 5 microinjections עם כייל נמוך יחסי לא גרם לירידה בGS שהיה קשור בתגובתיות astrocyte ^19. בקרות דומות דווחו לhippהאסטרוציטים ocampal ^8. עם זאת, חשוב להדגיש את הצורך בבקרות אלה עבור כל אזור במוח כדי להיחקר, לא מעט בגלל האסטרוציטים הם ²⁰ הטרוגנית, וכי הם צפויים לבצע פעולות שונות באזורים שונים של המוח.

אחד הגורמים החשובים שעשויים להשפיע על חוסנו של ביטוי גנים הממוקד באמצעות microinjection וירוס הוא הקואורדינטות בשימוש, אשר משתנה בין זנים שונים עכבר ושינויים לאורך ההתפתחות של בעלי החיים. רק C57BL / 6 עכברים של ~ 8 שבועות היו בשימוש לאורך מחקר זה. זה כבר הראה גם כי ביטוי הנגיפי של ה- GFP בתאי עצב ותאים הכוכביים striatal בחולדות ניתן היה לזהות לאחר הזרקה 4 ימים, הגיע לרמה של 2 - 4 שבועות לאחר הזרקה, ולאחר מכן נשאר יציב במשך 9 חודשי ההזרקה ההודעה ^21. כמובן ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 הזמן עדיין לא נקבעו בדיוק כאן, אבל לפחות שבועיים לביטוי וירוסמומלץ.

הגישה של שימוש AAV2 / 5 ביטוי בתיווך של GECIs בהאסטרוציטים striatal כעת ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר astrocyte [Ca ^{2 +]} _i איתות בסטריאטום. באופן ספציפי, רמת ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 היא גבוהה מספיק כדי לאפשר הדמיה של _i אותות [Ca ^{2 +]} באוכלוסיות קטנות של האסטרוציטים (~ 10 תאים) ובתוך כל השטחים של האסטרוציטים יחידים. הניתוח מפורט של _i אותות [Ca ^{2 +]} עדיין נמשך, אך עד כה [Ca ^{2 +]} _i אותות זוהו מתהליכי דיסטלי ככל ~ 50 מיקרומטר מסומה (איור 4). ניסויים מפורטים על astrocyte _אני אותות [Ca ^{2 +]} ופונקציות הגומלות וסבתם בתוך סטריאטום הם ריאלי. בעתיד, גישות מעודנות (כלומר, יזמים) יש צורך לספק GECIs לאוכלוסיות מוגדרות גנטי של האסטרוציטים, כך שאחד יכוללחקור איתות סידן בתוך אוכלוסיות מגוונות של האסטרוציטים ^20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
1 ml syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000