Introduction
Astrocytes मस्तिष्क की सर्वव्यापी और प्रचुर मात्रा में glial कोशिकाओं हैं. यह अच्छी तरह से astrocytes महत्वपूर्ण समर्थन और बाह्य अंतरिक्ष में + K एकाग्रता की बफरिंग, तेज न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपलब्ध कराने के पोषक तत्वों सहित समस्थिति भूमिकाओं कि सेवा स्थापित है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से वे भी अनायास होते हैं और neuronal गतिविधि 1 से बढ़ रहे हैं जो [सीए 2 +] मैं संकेतों को प्रदर्शित करता है. astrocyte का अस्तित्व [सीए 2 +] मैं संकेतन तेजी न्यूरॉन्स के साथ अपने संचार को गति प्रदान करने के लिए लगा दिया गया है, और इस तरह के रूप astrocytes के भीतर "सीए 2 + excitability के" के रूप में व्याख्या की गई है. पिछले दो दशकों में उपलब्ध डेटा astrocytes और न्यूरॉन्स शायद एक द्विदिश ढंग से संवाद कर सकते हैं, जिसमें दो सेटिंग्स सुझाव है. सबसे पहले, astrocytes अक्सर मैं जब न्यूरोट्रांसमीटर और से सक्रिय [सीए 2 +] में वृद्धि के साथ प्रतिक्रियान्यूरॉन्स 2 से जारी neuromodulators. दूसरा, [सीए 2 +] astrocytes के भीतर मैं बढ़ जाती बारी में न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि astrocytes से संकेतन अणुओं की रिहाई के कारण. साक्ष्य astrocytes से जारी अणुओं astrocyte करने वाली न्यूरॉन संकेत के माध्यम से अन्तर्ग्रथन, सर्किट और अंततः व्यवहार 3-5 के कार्यों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कि पता चलता है. बहरहाल, यह एक तेजी से विकसित अनुसंधान क्षेत्र बना हुआ है, और यह astrocyte का एक बेहतर और विस्तृत समझ [सीए 2 +] मैं मौजूदा अनिश्चितताओं 6 में से कुछ को हल करने के लिए आवश्यक है कि तर्क दिया गया है.
पिछले काम में, यह astrocytes में जैविक सीए 2 + सूचक रंगों के थोक लोड हो रहा है मज़बूती का पता लगाने में विफल रहता है कि प्रदर्शन किया गया [सीए 2 +] संस्कृति में और सीटू 7-10 में पूरे astrocytes के भीतर मैं संकेत. इन निष्कर्षों को हमें और दूसरों 6,11,12 से चर्चा की गई है. में emerginजी चित्र [सीए 2 +] मैं न्यूरॉन्स और रक्त वाहिकाओं के साथ बातचीत के लिए प्राथमिक साइट्स हैं जो astrocyte प्रक्रियाओं (जैसे, शाखाओं और टहनियों), भीतर का संकेत है, शायद ही कभी विस्तार से पता लगाया गया है कि है. हाल ही में, इस तरह के साइटोसोलिक GCaMP3, GCaMP5G और GCaMP6 और प्लाज्मा झिल्ली के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग सीमित संस्करण (जैसे, Lck-GCaMP3) astrocytes इस तरह के छोटे डिब्बों में [सीए 2 +] मैं संकेतों के अध्ययन की अनुमति दी है के रूप में पतली प्रक्रियाओं, प्लाज्मा झिल्ली के पास और पूरे प्रदेशों 7,8 भीतर. हालांकि, GECIs जैविक सीए 2 + सूचक रंगों के ऊपर एक नुकसान है और GECIs उचित होना व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक तरीकों सप्ताह की अवधि के लिए विवो में astrocytes के लिए चुनिंदा एन्कोडिंग जीन देने के लिए कि आवश्यकता है. विवो में अभिव्यक्ति आमतौर पर दस्तक में चूहों या वायरस आधारित वितरण अनुप्रयोग के साथ, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर हासिल की हैroaches. वर्तमान जौव लेख में हम एडिनो से जुड़े वायरस का उपयोग striatal astrocytes को GECIs देने के लिए नियोजित तरीके और प्रक्रियाओं की रिपोर्ट. हम एक उदाहरण के रूप cyto-GCaMP3 पर ध्यान देते हैं, लेकिन एक ही मूल प्रक्रिया अन्य GECI या फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित रिपोर्टर किसी के लिए काम करता है.
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Protocol
सभी पशु प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार थे और यूसीएलए में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1.1) micropipette और AAV2 / 5 वायरस लोड हो रहा है तैयार
- वायरस के इंजेक्शन के लिए ठीक borosilicate ग्लास micropipettes का प्रयोग करें. एक ऊर्ध्वाधर खींचने के साथ एक दो कदम खींच प्रोग्राम का उपयोग micropipette खींचो. बेवल एक पिपेट चक्की का उपयोग कर 40 डिग्री के कोण पर विंदुक. 40 माइक्रोन और 6 की एक टांग की लंबाई - - 7 मिमी उपयोग के लिए आदर्श है कि पिपेट 20 के एक टिप व्यास होगा. पिपेट और सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव. ड्रिल 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा निष्फल है.
- 10 μl aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस AAV2 / 5 GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 एक्स 10 13 जीसी / एमएल), स्टोर. बस सर्जरी से पहले, फ्रीजर के बाहर aliquots के बाहर ले और वें भरने के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक बर्फ पर दुकानई micropipette.
- वायरस एक सिरिंज पंप का उपयोग कर के साथ micropipette भरें. कसकर एक प्रबलित सवार के साथ एक गिलास सिरिंज, फिटिंग एक उचित आकार ट्यूबिंग संपीड़न के माध्यम से ट्यूबिंग, के एक टुकड़े के एक छोर से कनेक्ट. फिटिंग एक उचित आकार हटाने योग्य सुई संपीड़न के माध्यम से ट्यूबिंग का टुकड़ा के दूसरे छोर से autoclaved micropipette संलग्न.
- वायरल वेक्टर लोड करने से पहले, एक सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में सूडान लाल चतुर्थ (~ 1 मिलीग्राम / 50 मिलीग्राम) के साथ रंग का खनिज तेल के साथ प्रणाली (27 जी भरकर ट्यूबिंग, सिरिंज और micropipette सहित पम्पिंग प्रणाली से हवाई बुलबुले को दूर ).
- कांच micropipette तहत parafilm का एक स्वच्छ टुकड़ा रखें, और 5 बांटना - parafilm पर वायरल वेक्टर के 10 μl.
- पिछड़े 0.5 μl / मिनट में सिरिंज के सवार ले जाकर वायरल वेक्टर चूसो, और कांच पिपेट पर वेक्टर और तेल के बीच सीमा चिह्न.
1.2) संज्ञाहरण, बाल काटने, एचcraniotomy के लिए EAD फिक्सेशन और तैयारी
- एन 2 हे और ओ 2, और 5 isoflurane% से भर चेंबर में एक माउस (P49-63, C57BL 6 /) रखो. उद्देश्यपूर्ण आंदोलन के नुकसान और एक धीमा श्वसन दर (- 90 / मिनट ~ 60) द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें. माउस anesthetized है जब सिर पर बाल काट दिया.
- उसके सिर एक संज्ञाहरण और वेंटिलेशन प्रणाली में रखा कुंद कान सलाखों और अपनी नाक के द्वारा सुरक्षित साथ, stereotaxic फ्रेम में माउस फ़िट. 3% - 2 में निरंतर isoflurane बनाए रखें. चूहों संज्ञाहरण के तहत उनके झपकी पलटा खो के बाद से दोनों आंखों को कृत्रिम आँसू मरहम लागू करें.
- दर्द से राहत के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा Buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) की 0.05 मिलीग्राम प्रशासन.
- 10% povidone आयोडीन और 70% शराब में तीन बार के साथ स्वच्छ शल्य चिकित्सा क्षेत्र, दो समाधान के बीच बारी और povidone आयोडीन की शुरुआत के साथ. सामने से शुरू करें और किसी भी पहले ही काट बाल हटाने के लिए पीछे की ओर पोंछे.
- शीर्ष ओ पर एक त्वचा चीराआंखों के बीच शुरू होता है और कान के बीच समाप्त हो जाती है जो सिर च.
1.3) craniotomy और microinjections
- एक कपास झाड़ू के साथ स्वाइप करके periosteum निकालें और फिर दंत कपास गेंदों के साथ खोपड़ी की सतह सूखी. इंजेक्शन स्थल के चारों ओर एक निशान बना है, और एक उच्च गति ड्रिल द्वारा संचालित एक छोटे से स्टील गड़गड़ाहट का उपयोग मार्क के किनारे के आसपास ड्रिल.
- हड्डी निकालें और नमक के साथ सतह को साफ.
- पूर्वकाल-पीछे 0.8, औसत दर्जे का पार्श्व: निम्नलिखित निर्देशांक (मिमी) के साथ स्ट्रिएटम पार्श्व छोड़ दिया पृष्ठीय में पिपेट जगह 2.0, पृष्ठीय उदर pial सतह से: -2.4 13. इन निर्देशांक microinjection सुई की नोक यह केवल थोड़ा इस नाभिक के भीतर प्रवेश जिसका अर्थ है कि सिर्फ dorsolateral स्ट्रिएटम (चित्रा 1 ए, बी) से ऊपर बैठता है कि इसका मतलब यह है कि ध्यान दें. हानिकारक रक्त वाहिकाओं से बचें. पिपेट एक रक्त वाहिका पर सही होना होता है, तो थोड़ा समायोजित0.2 मिमी - ~ 0.1 से समन्वय करता है.
- 0.2 μl / मिनट में सेट इंजेक्शन दर के साथ इंजेक्शन प्रारंभ करें, और आमतौर पर वायरस का 1 से 1.5 μl इंजेक्षन.
- 10 मिनट के लिए इंजेक्शन के बाद जगह में पिपेट छोड़ दें, और फिर धीरे धीरे पिपेट वापस ले लें.
- निरंतर सिवनी बाहरी नायलॉन सीवन के साथ शल्य घाव बंद करके खत्म करो.
1.4) रिकवरी
- 24 घंटे के लिए एक हीटिंग पैड पर एक साफ पिंजरे में माउस रखो. पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक माउस वापस नहीं करते. यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक माउस नायाब मत छोड़ो.
- Trimethoprim Sulfamethoxiazole जोड़ें एक सप्ताह के लिए पानी में (40 मिलीग्राम trimethoprim और 200 मिलीग्राम sulfamethoxiazole युक्त 500 मिलीलीटर पानी प्रति 5 एमएल). सर्जरी के बाद Buprenorphine अप करने के लिए 3 दिनों के लिए प्रति दिन दो बार प्रशासन.
- एक खिलाया एक 12 घंटा प्रकाश-अंधेरे चक्र, पर माउस बनाए रखें और दैनिक पानी पिलायाएन डी सर्जरी के बाद 3 दिन के लिए एक बार दिन प्रति भारित है. इन 3 दिनों में 10% से अधिक शरीर के वजन के नुकसान के साथ किसी भी माउस के साथ छेड़छाड़, और बजाय प्रयोग करने के लिए किए जा रहा है की euthanized किया जाएगा के रूप में माना जाता है.
- उधर, प्रति सप्ताह दो बार माउस पिंजरे बदलने के लिए, और कम से कम एक बार प्रति दिन सामान्य स्वास्थ्य के लिए निगरानी. Stereotaxic microinjections के बाद 3 सप्ताह - आमतौर पर, माउस 2 भीतर प्रयोग किया जाता है.
Confocal सीए 2 + इमेजिंग के लिए 2. तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
काटना और रिकॉर्डिंग समाधान के 2.1) तैयार करना.
- (मिमी) शामिल समाधान काटने की तैयारी: 194 सूक्रोज, 30 सोडियम क्लोराइड, 4.5 KCl, 10 ग्लूकोज़, 1 2 MgCl, 1.2 नाह 2 पीओ 4, और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ संतृप्त 26 3 NaHCO,.
- जिसमें रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी) तैयार: 124 सोडियम क्लोराइड, 4.5 KCl, 1 2 MgCl, 10 ग्लूकोज़, 2 2 CaCl, 1.2 नाह 2 पीओ 4 3 NaHCO; पीएच 7.3-7.4, 290 - 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ संतृप्त 295 mOsm,. रिकॉर्डिंग समाधान के साथ मस्तिष्क टुकड़ा पकड़े बीकर भरें, और 34 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं.
2.2) टुकड़ा करने की क्रिया
- दो से तीन सप्ताह stereotaxic microinjections के बाद, गहरा और टर्मिनली माउस anesthetize, और फिर इसे सिर काटना.
- मस्तिष्क निकालें, और uninjected सही गोलार्द्ध दूर करने के लिए एक ब्लेड का उपयोग, और सुपर गोंद का उपयोग vibratome ट्रे पर छोड़ दिया एक माउंट. बर्फ के ठंडे काटने बफर के साथ vibratome ट्रे भरें, और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ यह saturating रखना.
- 300 माइक्रोन मोटाई में राज्याभिषेक या बाण के समान striatal मस्तिष्क के स्लाइस काटें. आमतौर पर, 4-5 राज्याभिषेक, या 6-7 बाण के समान striatal स्लाइस एकत्र किया जा सकता है.
- 34 डिग्री सेल्सियस पर गरम टुकड़ा पकड़े बीकर को स्लाइस हस्तांतरण, और बाद में recordi के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें भंडारण से पहले 30 मिनट के लिए वहाँ उन्हें रखनाएनजी.
- [सीए 2 +] मैं इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऑक्सीजन रिकॉर्डिंग बफर में मस्तिष्क के स्लाइस सेते हैं.
3. Immunohistochemistry (आईएचसी)
- दो हफ्ते वायरस इंजेक्शन के बाद, transcardially पीबीएस के साथ माउस पीबीएस में 10% formalin द्वारा पीछा छिड़कना.
- , निकालें रातोंरात के बाद ठीक करने, और कम से कम 2 दिन के लिए बफर 30% sucrose में मस्तिष्क cryoprotect.
- एक cryostat सूक्ष्म का उपयोग कर 40 माइक्रोन वर्गों तैयार करें.
- 10 मिनट के अंतराल पर वर्गों पीबीएस के साथ 3 बार कुल्ला.
- 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ पीबीएस में 1 घंटे के लिए और 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ वर्गों सेते हैं.
- 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात वर्गों सेते हैं. इस तरह इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी थे: चिकन विरोधी GFP 1: 1,000, माउस विरोधी S100β 1: 400, माउस विरोधी NeuN 1: 600, माउस विरोधी glutamine synthetase 1: 300.
- 10 मीटर की ऊंचाई पर वर्गों पीबीएस के साथ 3 बार कुल्लाअंतराल में.
- कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ पीबीएस में तैयार माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं. निम्नानुसार दूसरा एंटीबॉडी थे: बकरी विरोधी माउस Alexa546 1: 500, बकरी विरोधी चिकन Alexa488 1: 500.
- फिर धीरे धीरे एक गिलास coverslip के साथ वर्गों को कवर, शुष्क कांच स्लाइड, पर वर्गों माउंट और antifade बढ़ते मध्यम की कई बूँदें लागू होते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स स्टोर.
- 1.3 की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x तेल विसर्जन लेंस के साथ एक confocal खुर्दबीन पर छवियों को ले लो.
4. Confocal [सीए 2 +] मैं इमेजिंग
नोट: [सीए 2 +] मैं 0.8 का एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग किया गया था इमेजिंग.
- 2 मिलीलीटर प्रति - घंटा 1 और 5 के बीच रिकॉर्डिंग कक्ष में, जगह टुकड़ा टुकड़ा करने की क्रिया और 1 के प्रवाह की दर के साथ कमरे के तापमान पर ऑक्सीजन रिकॉर्डिंग बफर के साथ Superfuse के बादमि. फिर प्रयोग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए टुकड़ा के शीर्ष पर नायलॉन तार के साथ एक प्लैटिनम वीणा जगह है.
- कल्पना और एक 10X पानी विसर्जन उद्देश्य के तहत उज्ज्वल क्षेत्र luminescence साथ पृष्ठीय स्ट्रिएटम खोजें.
- 40X पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस के लिए स्विच, और आर्गन लेजर के 488 एनएम लाइन पर बारी. फोकल हवाई जहाज़ से बदल रहा है, सोमा, शाखाओं और टहनियों में बेसल प्रतिदीप्ति प्रदर्शित, के बारे में 20 माइक्रोन टुकड़ा सतह के नीचे स्थित कोशिकाओं लगता है. ध्यान से, छेड़छाड़ की कोशिकाओं को आमतौर पर परहेज किया जाना चाहिए, जो औसत से ऊपर प्रतिदीप्ति स्तर, प्रदर्शन.
- स्कैनिंग शुरू करने के लिए 'फ्रेम स्कैन' मोड का प्रयोग करें. आमतौर पर, 0.5 करने के लिए समायोजित लेजर तीव्रता - अधिकतम उत्पादन का 5% [सीए 2 +] मैं cyto-GCaMP3 साथ छवि के लिए पर्याप्त है. Astrocytes के पूरे क्षेत्र में [सीए 2 +] मैं गतिशीलता की निगरानी के लिए, फ्रेम या तेज प्रति 1 सेकंड के स्कैन दर के साथ 'फ्रेम स्कैन' recomme हैnded, लेकिन इस प्रश्न में प्रयोग के आधार पर निर्णय लिया जाना चाहिए.
- देखने के पूरे क्षेत्र में 2 astrocytes - 1 की निगरानी के लिए 3 गुना - यदि आवश्यक हो, छवि को [सीए 2 +] मैं प्रक्रियाओं में, 2 की डिजिटल बढ़ाई उपयोग करें.
- रिकॉर्डिंग के दौरान संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए, कोशिकाओं pseudocolor को 'हिलो' देखने मोड का उपयोग करें. हमेशा लाल रंग संतृप्ति के संकेत के रूप में प्रकट होता है अगर परीक्षण करने के लिए, के बारे में 5 मिनट के लिए एक "पायलट रिकॉर्डिंग" के साथ शुरू करते हैं. यदि हां, लेजर बिजली उत्पादन कम, या पीएमटी कम / लाभ / मूल्यों ऑफसेट और पिक्सेल मूल्यों गैर संतृप्त रेंज में हैं परीक्षण करने के लिए एक और पायलट रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते हैं. - 5% (10 मेगावाट की), पी एम टी 550-650 वोल्ट, लाभ 2.0 - लेजर बिजली उत्पादन 0.5 3.5, और 0 ऑफसेट: आमतौर पर, संयुक्त मापदंडों इमेजिंग astrocyte के लिए इस्तेमाल [सीए 2 +] स्ट्रिएटम में मैं इस प्रकार हैं - 5%.
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Representative Results
स्ट्रिएटम में cyto-GCaMP3 की astrocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए, हम पहले से मजबूत GCaMP3 और पत्रकार जीन ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है जो एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) 5 सीरोटाइप की, और GFAP GfaABC 1 डी प्रमोटर (चित्रा 1 ए) का उपयोग किया था हिप्पोकैम्पस और cortical astrocytes 8,14 में अभिव्यक्ति. दो हफ्ते माउस स्ट्रिएटम में वायरस microinjection के बाद, माउस (~ 10 सप्ताह की उम्र) perfused किया गया था और आईएचसी स्ट्रिएटम (चित्रा 1 बी) में cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए पतली मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था. हम GFP एंटीबॉडी का उपयोग cyto-GCaMP3 का पता चला है और यह भी एक ज्ञात astrocyte मार्कर, S100β साथ स्लाइस दाग. Cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति ही S100β सकारात्मक कोशिकाओं में पाया गया था. कोई अभिव्यक्ति astrocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति, सुझाव NeuN (2A चित्रा और 2 बी) के साथ कल्पना न्यूरॉन्स में पाया गया था. महत्वपूर्ण बात है, cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति ~ S100β सकारात्मक कोशिकाओं का 60% (फाई में पाया गया थाgure -2 सी).
Astrocytes हल्के से गंभीर से 15 संभावित परिवर्तन का एक स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है जो astrocyte जेट, के रूप में जाना जाता हो गए कि परिवर्तन प्रदर्शित करके ऐसी चोट, ischemia और संक्रमण के रूप में मस्तिष्क अपमान का जवाब. हम वायरस microinjection प्रकट astrocyte जेट वजह से अगर मूल्यांकन करने की मांग की. यह पहले से Glutamine Synthetase (जीएस) का कम अभिव्यक्ति के स्तर प्रतिक्रियाशील astrocytes 16,17 के साथ जुड़े थे कि दिखाया गया था. इसलिए, गुम्मट और वायरस इंजेक्शन चूहों के स्ट्रिएटम में जी एस अभिव्यक्ति तुलना में था. एक मीट्रिक के रूप में जी एस के स्तर का उपयोग नहीं प्रकट astrocyte जेट का संकेत है - हम वायरस इंजेक्शन (सी चित्रा 3 ए) निम्नलिखित striatal astrocytes में जी एस अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन पाया. यह सामान्य दृष्टिकोण जेट के अन्य मार्कर का उपयोग astrocyte जेट का मूल्यांकन करने के लिए भविष्य के काम में विस्तार किया जा सकता है. हालांकि, GFAP स्तरों striat में जेट को मापने के लिए एक उपयुक्त तरीका नहीं हो सकता है कि ध्यान देंअल astrocytes, GFAP बेसल शर्तों 18 के तहत सबसे striatal astrocytes में detectable स्तर पर व्यक्त नहीं कर रहा है क्योंकि. संक्षेप में, आईएचसी का उपयोग करके हम cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति स्ट्रिएटम में astrocytes के लिए मजबूत और विशिष्ट था निष्कर्ष निकालना, और जी एस अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन द्वारा मूल्यांकन के रूप में है कि वायरस इंजेक्शन astrocyte जेट का कारण नहीं था.
हम अगले striatal astrocytes में [सीए 2 +] मैं छवि को वायरस इंजेक्शन चूहों से तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस तैयार. एक्यूट 300 माइक्रोन मोटी बाण के समान या राज्याभिषेक स्लाइस तैयार थे, और वसूली की अवधि के बाद स्लाइस [सीए 2 +] मैं एक आर्गन लेजर के 488 एनएम लाइन का उपयोग इमेजिंग के लिए एक confocal खुर्दबीन पर एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया था. (वे स्पष्ट रूप से जंगली आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं में दिखाई हरी प्रतिदीप्ति दिखाया, के रूप में चित्रा 4 - cyto-GCaMP3 व्यक्त striatal astrocytes आसानी से striatal स्लाइस (माउस प्रति 7 स्लाइस 6 ~) के (आमतौर पर सभी) सबसे में पहचाना जा सकता है चित्रा -4 ए में दिखाया गया है; cyto-GCaMP3 प्रदर्शित कम से कम 10 astrocytes imaged किया जा सकता है और ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में चित्रा -4 ए में प्लॉट किए जाते हैं. 2.0 की एक अतिरिक्त डिजिटल ज़ूम के साथ उच्च बढ़ाई इमेजिंग - 3.0 एकल astrocytes (चित्रा 4 बी) की पहचान करने के लिए आवश्यक था. चित्रा 4 बी में दिखाया गया है कि इन परिस्थितियों में, पूरे astrocyte प्रदेशों, cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति से पता चला रहे थे. उठना, सीए 2 + संकेतों आसानी somata में और साथ ही शाखाओं और astrocytes 6 की टहनियों में मापा गया.
चित्रा 1: वयस्क माउस स्ट्रिएटम में AAV2 / 5 से GECIs के वायरल वितरण (जैसे cyto-GCaMP3). ए योजनाबद्ध dorsolateral स्ट्रिएटम में AAV2 / 5 microinjections के लिए प्रोटोकॉल को दिखाता है.बी स्ट्रिएटम के संबंध में microinjection सुई और stereotaxic इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया निर्देशांक की अनुमानित स्थिति दिखाता है. पैनल बी में एक Nissl से सना हुआ टुकड़ा की छवि एलन ब्रेन एटलस से डाउनलोड किया गया था.
चित्रा 2: Cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति striatal astrocytes के लिए विशिष्ट था. . एक - cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति लेकिन नहीं दिखाया उन लोगों की तरह colocalization प्रयोगों के लिए एक न्यूरॉन्स के लिए मार्कर (NeuN) (ए) सी सारांश बार ग्राफ के साथ, astrocytes के लिए एक मार्कर (S100β) (बी) के साथ colocalizes दिखा रहा है कि बी प्रतिनिधि छवियों ए और बी में.
चित्रा 3: striatal astrocytes भीतर Cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति जी एस की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का कारण नहीं था.एक - GCaMP3 के लिए AAV2 / 5 प्राप्त किया था कि चूहों से GCaMP3 और जी एस आईएचसी के बी प्रतिनिधि छवियों. नियंत्रण गैर इंजेक्शन चूहों के लिए छवियां भी दिखाई जाती हैं. सी बार ग्राफ इस तरह के ए और बी में उन लोगों के रूप प्रयोगों से परिणाम का सार (एनएस एक unpaired छात्र के टी परीक्षण, पी <0.05 का उपयोग महत्वपूर्ण नहीं इंगित करता है).
चित्रा 4: cyto-GCaMP3 साथ striatal astrocytes से दर्ज [सीए 2 +] मैं संकेतों के प्रतिनिधि उदाहरण हैं. ए ए (1 गिने - 10) 10 astrocytes दिखा z ढेर छवि चपटा व्याप्ति शो नीचे निशान [सीए 2 +] मैं संकेतों चपटा ए बी ए में दिखाया गया 10 कोशिकाओं से 5 मिनट से अधिक दर्ज की गई है और तेजी से बढ़ी में जेड. एक भी astrocyte.The के लिए -stack छवि दिखाने के नीचे निशान [सीए 2 +] मैंसंकेतों बी में दिखाया एकल कक्ष के लिए 5 मिनट से अधिक दर्ज की गई.
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Discussion
इस के साथ साथ वर्णित विधि हमें बगल में बाद [सीए 2 +] मैं इमेजिंग के लिए vivo में striatal astrocytes में cyto-GCaMP3 व्यक्त करने की अनुमति दी है. इस विधि ट्रांसजेनिक या मजबूत लक्षित प्रोटीन, तेज़ी की अभिव्यक्ति और प्रायोगिक कार्यान्वयन और संरचनात्मक विशिष्टता का लचीलापन सहित तोड़े में चूहों का उपयोग कर अधिक लाभ है. AAV2 / 5 का उपयोग GCaMP3 की अभिव्यक्ति विशिष्ट और मजबूत हो पाया था. सीरोटाइप 5 की एएवी साथ GFAP GfaABC 1 डी प्रमोटर के संयोजन विशिष्टता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ वर्णित तकनीक की एक सीमा वायरस के संक्रमण और सर्जरी प्रक्रिया विशेष रूप से उच्च अनुमापांक वायरस 19 के साथ, astrocyte जेट का कारण बन सकता है. महत्वपूर्ण बात है, वर्तमान अध्ययन में, एक रिश्तेदार कम अनुमापांक साथ AAV2 / 5 microinjections astrocyte जेट 19 के साथ संबद्ध किया गया है कि जी एस में घटने का कारण नहीं था. इसी प्रकार नियंत्रण HIPP के लिए सूचित किया गया हैocampal astrocytes 8. हालांकि, यह astrocytes विषम 20 होते हैं, और वे संभावना मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में अलग अलग कार्य है क्योंकि कम से कम नहीं, अध्ययन किया जा करने के लिए प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए इन पर नियंत्रण की आवश्यकता पर जोर देना जरूरी है.
वायरस microinjection का उपयोग लक्षित जीन अभिव्यक्ति की मजबूती को प्रभावित कर सकता है कि महत्वपूर्ण कारकों में से एक अलग माउस उपभेदों और जानवरों के विकास में परिवर्तन के बीच बदलता है जो उपयोग में निर्देशांक, है. पुराने ~ 8 सप्ताह का केवल C57BL / 6 चूहों इस अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किया गया. 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन, और उसके बाद 9 महीनों के लिए स्थिर बने रहे इंजेक्शन 21 पोस्ट - यह भी चूहों में striatal न्यूरॉन्स और astrocytes में GFP के वायरल अभिव्यक्ति, 4 दिनों के बाद इंजेक्शन का पता चला 2 द्वारा एक पठार पहुंचा जा सकता है कि दिखाया गया है. cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम ठीक यहाँ निर्धारित नहीं किया गया है, लेकिन वायरस अभिव्यक्ति के लिए कम से कम दो सप्ताह हैंकी सिफारिश की.
striatal astrocytes में GECIs की AAV2 / 5 मध्यस्थता अभिव्यक्ति का उपयोग करने का दृष्टिकोण अब बेहतर [सीए 2 +] मैं स्ट्रिएटम में संकेत astrocyte समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, cyto-GCaMP3 अभिव्यक्ति स्तर astrocytes की छोटी सी आबादी में [सीए 2 +] मैं संकेतों (~ 10 कोशिकाओं) के और एक astrocytes की पूरी प्रदेशों के भीतर इमेजिंग की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से उच्च है. [सीए 2 +] मैं संकेतों के विस्तृत विश्लेषण अभी भी जारी है, लेकिन आज तक [सीए 2 +] मैं संकेत के रूप में दूर सोमा से 50 माइक्रोन (चित्रा 4) ~ के रूप में बाहर प्रक्रियाओं से खोजा गया है. Astrocyte [सीए 2 +] मैं संकेतों और स्ट्रिएटम के भीतर उनके correlative और प्रेरणा कार्यों पर विस्तृत प्रयोगों संभव हैं. भविष्य में, परिष्कृत दृष्टिकोण (प्रमोटरों आईई) astrocytes की आनुवंशिक रूप से परिभाषित आबादी को GECIs देने की जरूरत है एक कर सकते हैं कि इतनाastrocytes 20 के विविध आबादी के भीतर कैल्शियम संकेतन का पता लगाएं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
काम के बहुमत और शामिल कर्मियों एनआईएच अनुदान NS060677 से और आंशिक रूप से एनआईएच MH099559 और (BSK के लिए) MH104069 अनुदान द्वारा समर्थित थे. काम से कुछ भी CHDI फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
- Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
- Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
- Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
- Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
- Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).
