Introduction
Astrositler beynin her yerde ve bol miktarda glial hücreler bulunmaktadır. İyi astrocytes hayati destek ve hücre dışı boşlukta K + konsantrasyon tamponlama, alımı nörotransmitterlerin sağlamanın yanı sıra besinlerin de dahil olmak üzere homeostatik rolleri hizmet ettiğini kurulmuştur. Ancak son çalışmalar onlar da kendiliğinden ortaya çıkar ve nöronal aktivitenin 1 artmıştır [Ca 2+] i sinyallerini görüntülemeye olduğunu göstermektedir. Astrosit varlığı [Ca 2 +] i sinyal giderek nöronlar ile iletişimi tetiklemek için düşünülmüş, ve gibi astrositlerden içinde "Ca 2+ uyarılabilirliğinin" bir formu olarak yorumlanmıştır. Son iki yılda mevcut veriler astrocytes ve nöronlar belki iki yönlü bir tarzda, iletişim kurabileceğini iki ayarları öneririz. İlk olarak, astrositlerin sıklıkla nörotransmiterler ve aktive [Ca2 +] artışa yanıtnöronlar 2 serbest nöromodülatörler. İkinci olarak, [Ca2 +] astrositler içine dahil artışlar da nöronlar ve kan damarlarını etkileyen astrositlerden sinyal molekülleri salınımına neden olur. Kanıt astrositlerden salınan moleküllerin astrosit-to-nöronun sinyalizasyonu ile sinaps, devreler ve sonuçta davranış 3-5 işlevlerinde değişikliklere yol açtığını göstermektedir. Ancak, bu hızla gelişmekte olan bir araştırma alanı kalır ve astrosit daha iyi ve ayrıntılı bir anlayış [Ca 2 +] i mevcut belirsizliklerin 6 bazı çözmek için gerekli olduğu ileri sürülmüştür.
Geçmiş çalışmalarında, astrositlerde içine organik Ca 2+ gösterge boyaların toplu yükleme güvenilir algılamak için başarısız olduğu gösterilmiştir [Ca 2+] kültür ve yerinde 7-10 tüm astrositlerde içinde i sinyaller. Bu bulgular bize ve diğerleri 6,11,12 tarafından tartışılmıştır. Emerging resim [Ca 2 +] i nöronlar ve kan damarları ile etkileşimleri için birincil siteleri astrocyte süreçler (örneğin, şube ve ağızları), içinde sinyaller, nadiren ayrıntılı olarak incelenmiştir olmasıdır. Son zamanlarda, örneğin sitosolik GCaMP3, GCaMP5G ve GCaMP6 ve plazma zar olarak bulunan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) 'nin kullanımı, bağlı versiyonlar (örneğin Lck-GCaMP3) astrositlerin bu küçük bölümlerinde [Ca2 +] sinyalleri çalışma izin vermiştir gibi ince süreçler, plazma zarı yakın ve tüm toprakları 7,8 içinde. Bununla birlikte, Geçiş organik Ca 2 + göstergesi boyalar üzerinde bir dezavantajı vardır ve Geçiş uygun olarak ifade etmek için genetik yöntemler haftalık dönemler için in vivo olarak astrositleri seçici kodlayan genlerin sunmak için bu gerekliliktir. In vivo ifadesi tipik knock-fareler veya virüs bazlı teslimat uygulaması ile, transgenik fareler kullanılarak elde edilirHamam böcekleri. Mevcut jove makalede, adeno-bağlantılı virüsler kullanarak çizgili astrositlere Geçiş sunmak için kullanılan yöntem ve prosedürler rapor etmektedir. Biz örnek olarak cyto-GCaMP3 odaklanmak, ancak aynı temel prosedürü diğer Geci veya floresan protein bazlı muhabiri herhangi için çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri göre ve UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
1.1) Mikropipet, AAV2 / 5 Virüs Yükleme hazırlayın
- Virüsün enjeksiyon için iyi borosilikat cam mikropipetler kullanın. Dikey bir çekici ile iki aşamalı bir çekme programı kullanılarak mikropipet çekin. Konik bir pipet öğütücü kullanılarak 40 ° 'lik bir açı ile pipet. 40 um ve 6 bir şaft uzunluğu - - 7 mm kullanım için ideal olan pipet 20 bir uç çapına sahip olacaktır. Pipet ve cerrahi aletler otoklav. Tatbikatta,% 70 etanol ile silinerek sterilize edilir.
- 10 ul alikolar içinde -80 ° C virüsü AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 ila 13 GC / ml) depolayın. Cerrahi öncesinde, dondurucu üzerinden hacimde çıkar ve th doldurmak için kullanılan kadar buz üzerinde saklayıne mikropipet.
- Virüs, bir şırınga pompası kullanılarak mikropipet doldurun. Sıkıca takviye edilmiş bir pistonu olan bir cam şırıngaya, uygun uygun büyüklükte bir hortum sıkıştırma yoluyla hortumun bir parçasının bir ucunu. Montaj için uygun boyutta bir çıkarılabilir bir iğne sıkıştırma yoluyla boru parçasının diğer ucuna otoklavlanmış mikropipet takın.
- Viral vektör yüklemeden önce, bir iğne ile 1 ml şırınga içinde Sudan Kırmızı IV (~ 1 mg / 50 mi) ile boyanmış, mineral yağ ile sistemin (27 g doldurarak boru, şırınga ve mikropipet de dahil olmak üzere pompa sisteminin hava kabarcıklarını çıkarmak ).
- Cam mikropipet altında parafilm temiz bir parça yerleştirin ve 5 dağıtmak - parafilm üzerine viral vektörün 10 ul.
- Geri 0.5 ml / dk'da, enjektörün pistonu hareket ettirerek viral vektör Suck ve cam pipet ile ilgili vektör ve yağ arasındaki sınırı.
1.2) Anestezi, Saç Kesme, HKraniotomi için ead Tespit ve Hazırlık
- N2 O ve O 2, ve% 5 izofluran ile dolu odacık içine bir fare (P49-63, C57BL / 6) koyun. Maksatlı hareket kaybı ve yavaşlatılmış solunum hızı (- 90 / dk ~ 60) tarafından anestezi derinliğini değerlendirin. Fare anestezi sırasında kafasına saçlarını kesti.
- Başını bir anestezi ve havalandırma sisteminin içine yerleştirilen künt kulak çubukları ve burun tarafından güvenli ile, stereotaktik çerçeve içinde fareyi takın. % 3 - 2 sürekli izofluran koruyun. Fareler anestezi altında göz kırpma refleksi kaybetmek beri her iki göze yapay gözyaşı merhem sürün.
- Ağrı tedavisi için bir deri altından enjeksiyon ile Buprenorfin (0.1 mg / ml), 0.05 ml uygulayın.
- % 10 povidon iyot ve% 70 alkol ile üç kez temiz bir cerrahi alan, iki çözümleri arasında değişen ve povidon iyot ile başlayan. Önden başlar ve herhangi bir önceden kesilmiş tüyleri çıkarmak için arkaya doğru silin.
- Üst o bir cilt kesi yapmakgözler arasında başlar ve kulakları arasındaki biter kafa f.
1.3) Kraniyotomi ve Microinjections
- Bir pamuklu çubukla kaydırarak periost çıkarın ve sonra diş pamuk topları ile kafatası yüzeyini kurulayın. Enjeksiyon yeri çevresinde bir işareti yapmak, ve bir yüksek devirli tarafından desteklenmektedir küçük bir çelik çapak kullanarak işaretinin kenarına etrafında matkap.
- Kemik çıkarın ve tuzlu su ile yüzeyi temizleyin.
- Ön-arka 0,8, medial-lateral: şu koordinatlara (mm) striatumdaki yanal sol dorsal içine pipet yerleştirin 2,0, dorsal-ventral pial yüzeyinden: -2,4 13. Bu koordinatlar mikroenjeksiyon iğne ucu sadece biraz bu çekirdeğin içinde nüfuz anlamı sadece dorsolateral striatum (Şekil 1A, B) Yukarıda oturur anlamına unutmayın. Zararlı kan damarları kaçının. Pipet bir kan damarına doğru olması için olursa, hafifçe ayarlayın0.2 mm - 0.1 ile koordine eder.
- 0.2 ml / dk'da ayarlanmış enjeksiyon oranı ile enjeksiyon başlayın ve tipik olarak virüs 1-1,5 ul enjekte edilir.
- 10 dakika boyunca, enjeksiyondan sonra yerinde pipet bırakın ve daha sonra yavaş yavaş pipet çıkarın.
- Sürekli dikiş dış naylon sütür ile cerrahi yara kapatarak bitirin.
1.4) Kurtarma
- 24 saat için bir ısıtma pedi üzerine temiz bir kafes içinde fare koyun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyatı geçirmiş fare iade etmeyin. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar fare gözetimsiz bırakmayın.
- Trimetoprim Sulfamethoxiazole ekleme, bir hafta boyunca su içinde (40 mg trimetoprim 200 mg sulfamethoxiazole ihtiva eden 500 ml su başına 5 mi). Ameliyat sonrası Buprenorfin kadar 3 gün boyunca günde iki kez uygulayın.
- , A beslenen bir 12 saat ışık-karanlık döngüsü üzerinde fareyi korumak ve günlük sulanannd ameliyattan sonra 3 gün sonra günde başına düşen ağırlıklı. Bu 3 gün içinde,% 10'dan daha fazla bir vücut ağırlığı kaybı ile herhangi bir fare tehlikeye, ve bunun yerine bir deneye tabi kalma ötenazi olacaktır olarak kabul edilir.
- Ayrı, haftada iki kez fare kafes değiştirmek ve en az günde bir kez genel sağlık izlemek. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrası 3 hafta - Tipik olarak, fare 2 içinde kullanılır.
Konfokal Ca 2+ Görüntüleme 2. Akut Beyin Dilim Hazırlık
Kesme ve Kayıt Çözümleri 2.1) hazırlanması.
- (MM) ihtiva eden çözelti, kesme hazırlayın: 194 sukroz, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-glikoz, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 26 NaHCO 3.
- Içeren kayıt solüsyonu (mM olarak) hazırlayın: 124 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glikoz, 2 CaCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 3; pH 7,3-7,4, 290 -% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 295 mOsm. Kayıt çözümü ile beyin dilim tutarak beher doldurun ve 34 ° C'de tutmak.
2.2) Dilimleme
- İki üç hafta stereotaksik mikroenjeksiyon sonra, derin ve ölümcül fare uyutmak, ve sonra başını kesmek.
- Beyin ayıklayın ve uninjected sağ yarımkürede kaldırmak için bir bıçak kullanın ve süper yapıştırıcı kullanarak Vibratome tepsiye bıraktı birini monte edin. Buz gibi soğuk kesim tamponu ile Vibratome tepsiyi doldurun, ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile doyurarak tutun.
- 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal striyatal beyin dilimleri kesin. Genellikle, 4-5 koronal veya 6-7 sagital striyatal dilim alınabilir.
- 34 ° C'de ısıtıldı dilim tutarak behere dilimleri transferi ve daha sonra recordi oda sıcaklığında depolamadan önce, 30 dakika boyunca orada tutmakng.
- [Ca2 +] görüntüleme önce en az 30 dakika oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu içinde beyin dilimleri inkübe edin.
3. İmmünohistokimya (İHK)
- İki hafta virüsünün, enjeksiyondan sonra, transkardiyal PBS ile fare PBS içinde% 10 formalin ve ardından serpmek.
- Kaldır gecede sonrası düzeltmek ve en az 2 gün tamponlu% 30 sakaroz beyin cryoprotect.
- Bir kriyostat mikrotom kullanılarak 40 um bölümler hazırlayın.
- 10 dakika aralıkla kesitler, PBS ile 3 kez yıkayın.
- % 10 normal keçi serumu ile PBS içinde 1 saat süre ile ve% 0.5 Triton X-100 ile bölümleri inkübe edin.
- % 0.5 Triton X-100 içeren PBS içinde hazırlanan primer antikor içinde 4 ° C'de bir gece boyunca bölümleri inkübe edin. Bu kapsamda kullanılan primer antikorlar: tavuk anti-GFP, 1: 1000 fare anti-S100β 1: 400, fare anti-neun 1: 600, fare anti-glutamin sentetaz 1: 300 arasındadır.
- 10 m bölümlerinin PBS ile 3 kez durulayınaralıklarla.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca,% 10 normal keçi serumu ile PBS içinde hazırlanan ikincil antikorlarla bölümleri inkübe edin. Aşağıdaki gibi, ikinci antikorlar: keçi anti-fare Alexa546 1: 500, keçi anti-tavuk Alexa488 1: 500.
- Daha sonra yavaş yavaş, bir cam lamel bölümleri kapsayacak, kuru bir cam slaytlar üzerinde bölümleri monte ve antifade montaj orta birkaç damla uygulanır. 4 ° C'de slaytlar saklayın.
- 1.3 sayısal diyafram ile 40X yağ daldırma lens ile bir konfokal mikroskop görüntüleri almak.
4. Konfokal [Ca 2 +] i Görüntüleme
NOT: [Ca 2+] i 0.8 sayısal diyafram ile 40X su daldırma objektif lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı görüntülenmesi.
- 2 ml başına - sa 1 ila 5 kayıt bölümü içinde, bir yer dilim dilimleme ve 1 akış hızında oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu superfuse sonraMin. Sonra deney sırasında hareketini en aza indirmek için dilimin üstüne naylon dizeleri ile bir platin arp yerleştirin.
- Görselleştirmek ve 10X suya daldırma hedefi altında parlak bir alan luminesansın ile dorsal striatum bulun.
- 40X suya daldırma objektif lens geçmek ve Argon lazer 488 nm hattı açın. Odak düzlemi değiştirerek, soma, şube ve ağızları bazal floresan görüntüleme, yaklaşık 20 mikron dilim yüzeyinin altında bulunan hücreleri bulmak. Notun tehlikeye hücreler genellikle kaçınılmalıdır ortalamanın üzerinde floresan seviyesi, gösterir.
- Taramayı başlatmak için 'çerçeve tarama' modunu kullanın. Genellikle, 0.5 ayarlanmış lazer yoğunluk - maksimum çıkış% 5 [Ca2 +] sito-GCaMP3 ile görüntü yeterlidir. Astositlerin bütün topraklarında [Ca 2 +] i dinamiklerini izlemek için, çerçeve ya da daha hızlı başına 1 sn tarama hızı ile 'Çerçeve Tarama' recomme olduğunuNDED, ancak bu durum, sözkonusu deneye bağlı olarak karar verilmesi gereklidir.
- Görüş tüm alanında 2 astrositler - 1 izlemek için 3 kat - Gerekirse, görüntü için [Ca 2 +] i süreçlerinde, 2 dijital büyütme kullanmak.
- Kayıt sırasında doymuş piksel önlemek için, hücreleri PseudoColor için 'Hilo' arama modunu kullanın. Her zaman kırmızı renk doygunluğu göstergesi olarak görünür olmadığını test etmek için, yaklaşık 5 dakika boyunca bir "pilot kayıt" ile başlar. Eğer öyleyse, lazer çıkış gücünü düşürecek, ya da PMT alt / Kazanç / ofset değerleri ve piksel değerleri olmayan doymuş aralıkta test etmek için bir başka pilot kayıt yapmak. - 5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Kazanç 2.0 - lazer gücü 0,5 3.5x ve ofset 0: Tipik haliyle, bir araya getirilen parametrelerin görüntüleme astrosit için kullanılan [Ca2 +] striatumda I aşağıdaki gibidir -% 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Striatumda sito-GCaMP3 arasında astrosit spesifik ekspresyonu sağlamak için, daha önce, sağlam GCaMP3 ve raportör geni tahrik etmek için gösterilmiştir, adeno-bağlantılı virüs (AAV) 5 serotip ve GFAP GfaABC 1 D yükseltici (Şekil 1A), kullanılan hipokampal ve kortikal astrositlerde 8,14 anlatım. İki hafta fare striatumu içine, virüs mikroenjeksiyon sonra fare (~ 10 haftalık), perfüze edilmiş ve IHC striatum (Şekil 1B) sito-GCaMP3 ekspresyonunu değerlendirmek için, ince beyin bölümlerinde gerçekleştirilmiştir. Biz GFP antikorları kullanarak cyto-GCaMP3 tespit ve aynı zamanda bilinen bir astrocyte işaretleyici, S100β ile dilimleri lekeli. Sito-GCaMP3 ifadesi, sadece S100β pozitif hücrelerde bulunmuştur. Resim sentezleme astrosit özel dışavurumunu göstermektedir, neuN (Şekil 2A ve 2B) ile görselleştirilmiştir nöronlarda bulunmuştur. Önemli olarak, sito-GCaMP3 sentezleme ~ S100β pozitif hücrelerin% 60, (Fi saptandıGüre gösterir 2C).
Astrositler hafif şiddetli 15 potansiyel değişikliklerin bir spektrumunu temsil astrocyte reaktivitesi olarak bilinir hale gelmiş değişiklikler göstererek bu yaralanma, iskemi ve enfeksiyon gibi beyin hakarete cevap. Biz virüs mikroenjeksiyon açık astrocyte reaktivitesi olduysam değerlendirmek için aradı. Daha önce, glutamin sentetaz (GS) düşük ekspresyon düzeyi reaktif astrositler 16,17 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, WT ve virüs enjekte edilen farelerin striatum GS sentezleme karşılaştırılmıştır. Metrik olarak GS seviyelerini kullanarak hiçbir açık astrocyte reaktivite gösteren, - Biz virüs enjeksiyonundan (C Şekil 3A) aşağıdaki striatal astrositlerde GS ifadede anlamlı bir değişiklik bulunamadı. Bu genel yaklaşım reaktivitesi diğer işaretlerini kullanarak astrocyte reaktivite değerlendirilmesi gelecekteki çalışmalarında genişletilmiş olabilir. Ancak, GFAP düzeyleri striat reaktivitesi ölçmek için uygun bir yol olmayabilir unutmayınal Astrositler, GFAP bazal koşullarda 18 altında en striyatal astrositlerde saptanabilir seviyelerde ifade edilir çünkü. Özetle, IHC ile, biz sito-GCaMP3 sentezleme striatumda astrositlere güçlü ve spesifik olduğu sonucuna, ve GS sentezleme seviyesi değişim ile değerlendirilen virüsten enjeksiyon astrosit reaktiviteye sebep yoktu.
Önümüzdeki striatal astrositlerde [Ca2 +] Görüntünün virüs enjekte edilen farelerde akut beyin dilimleri hazırlandı. Akut 300 mikron kalınlığında bir sagital ve koronal kesitler hazırlandı ve bir iyileşme süresinden sonra, dilimler [Ca2 +], bir argon lazer 488 nm hattı kullanarak görüntülenmesi için bir konfokal mikroskop, bir kayıt bölümü içine yerleştirilmiştir. (Açıkça çalı morfolojiye sahip hücrelerde de görünür yeşil floresan gösterdi, Şekil 4 - sito-GCaMP3 sentezleyen striatal astrositler kolayca striatal dilimleri (sıçan başına 7 dilimleri 6 ~) (genellikle tümü) çoğunda tespit edilebilir Şekil 4A'da gösterilmektedir; cyto-GCaMP3 göstererek en az 10 astrocytes görüntülü olabilir ve İlgi (ROI) Bölgeler Şekil 4A çizilmiştir. 2.0 ek bir dijital zoom ile yüksek büyütme görüntüleme - 3.0 Tek astrositler (Şekil 4B) tanımlamak için gerekli oldu. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bu durumda, bütün astrosit bölgeler, sito-GCaMP3 ekspresyonu ile açığa çıkarılmıştır. Spontan Ca 2 + sinyalleri kolayca somata hem de dalları ve astrositler 6 ağızları ölçüldü.
Şekil 1: yetişkin fare striatumu içine AAV2'nin / 5 ile GeCIS Viral teslim (örn cyto-GCaMP3). A. şematik Dorsolateral striatuma AAV2 / 5 mikroenjeksiyon için protokolü göstermektedir.B. striatum göre mikroenjeksiyon iğne ve stereotaksik enjeksiyonu için kullanılan koordinat yaklaşık konumunu gösterir. Panel B bir Nissl-lekeli dilim görüntü ALLEN BEYİN ATLAS indirildi.
Şekil 2: Cytoplasma GCaMP3 ifade striatal astrositlere özgü oldu. . A - sito-GCaMP3 sentezleme ancak gösterilenler gibi ko deneyler için bir nöronların belirteci (NeuN) (A), C Özet çubuk grafik ile, astrositler için bir marker (S100β) (B) colocalizes gösteren B. Örnek çizimin A ve B.
Şekil 3: striyatal astrositlerde içinde Cytoplasma GCaMP3 ifade GS ifadesinde değişikliğe sebep olmamıştır.A - GCaMP3 için AAV2 / 5 almış farelerden GCaMP3 ve GS IHC B. Örnek görüntüler. Kontrol dışı enjekte edılen fareler için görüntüleri de gösterilmiştir. C'de bar grafiktir A ve B gibi deneylerin sonuçları özetlemektedir (ns bir Student t-testi, p <0.05 ile anlamlı olmadığını gösterir).
Şekil 4: sito-GCaMP3 olan striatal astrositlerden kaydedildi [Ca2 +] sinyalleri temsil eden örnekler. A. A (1 numaralı - 10) 10 astrositler gösteren z-yığın düzleştirilmiş görüntü .The göstermek aşağıda izleri [Ca 2 +] i sinyaller basık A ve B A'da gösterilen 10 hücrelerden 5 dakika boyunca kaydedildi ve yakınlaştırılmış z. Tek bir astrocyte.The için -stack görüntü göstermek aşağıda izleri [Ca 2+] isinyalleri B'de gösterilen tek bir hücre için 5 dakika boyunca kaydedildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen yöntemler, US yerinde daha sonra [Ca2 +] görüntüleme için in vivo striatal astrositlerde sito-GCaMP3 ifade etmek için izin vermektedir. Bu yöntem transgenik veya sağlam hedeflenen protein, hızlılık ifade ve deneysel uygulama ve anatomik özgüllük esnekliği dahil knock-fareler kullanılarak üzerinde avantajlara sahiptir. AAV2 / 5 ile GCaMP3 ekspresyonu spesifik ve güçlü olduğu bulundu. Serotip 5 AAV ile GFAP GfaABC 1 D ilerleticinin birleşimi, özgünlüğünü elde etmek için kritiktir. Burada tarif edilen tekniğin bir sınırlama virüs enfeksiyonu ve cerrahi prosedür, özellikle yüksek-titreli virüs 19, astrosit reaktiviteye sebep olmasıdır. Önemli bir şekilde, bu çalışmada, nispeten düşük bir titreye sahip, AAV2 / 5 microinjections astrosit reaktivitesi 19 ile ilişkilendirilmiştir GS azalmalara neden olmamıştır. Benzer kontrolleri Hipp bildirilmiştirocampal astrositler 8. Ancak, astrocytes heterojen 20 çünkü, ve büyük olasılıkla beynin farklı bölgelerinde farklı işlevleri yerine çünkü az değil, çalışılacak her bir beyin bölgesinden bu kontrollerin gerekliliğini vurgulamak önemlidir.
Virüs: mikro-enjeksiyon ile hedef gen ekspresyonunun sağlamlığını etkileyebilecek önemli faktörlerden biri, farklı fare türüne ve hayvan gelişimi üzerinde değişiklikler arasında değişir kullanımda koordinatları vardır. Eski ~ 8 haftalık sadece C57BL / 6 fareleri bu inceleme boyunca kullanıldı. 4 hafta sonrası enjeksiyon, sonra 9 ay boyunca stabil kaldı enjeksiyon 21 sonrası - Ayrıca sıçanlarda striatal nöronlar ve astrositlerde GFP viral ifadesi, 4 gün sonrası enjeksiyon tespit 2 tarafından bir platoya ulaşmış olabileceğini gösterilmiştir. Cyto-GCaMP3 ifade zaman ders tam da burada tespit edilmemiştir, ancak virüs ifade için en az iki haftadırönerilir.
Striatal astrositlerde GeCIS arasında AAV2 / 5 aracılı ifadesini kullanarak yaklaşımı şimdi daha iyi [Ca 2 +] i striatumunda sinyal astrocyte anlamak için kullanılabilir. Spesifik olarak, sito-GCaMP3 ifade seviyesi astrositlerin küçük popülasyonlarında [Ca2 +] sinyallerinin (~ 10 hücre) ve tek astrositlerin bütün bölgeleri içinde görüntüleme olanak sağlamak üzere yeterince yüksektir. [Ca 2+] i sinyallerin detaylı analiz halen devam etmektedir, ancak bugüne kadar [Ca 2 +] i sinyaller olarak uzak soma 50 um (Şekil 4) ~ olarak distal süreçlerden tespit edilmiştir. Astrosit [Ca 2 +] i sinyalleri ve striatum içindeki karşılıklı ve nedensel işlevleri hakkında ayrıntılı deneyler mümkün bulunmaktadır. Gelecekte, rafine yaklaşımlar (destekçiler yani) astrositlerde tanımlı genetik nüfusa GeCIS sağlamak için gerekli olan tek can, böyleceastrositlerde 20 farklı popülasyonları içinde kalsiyum sinyalizasyonu keşfetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Işin çoğunluğu ve ilgili personel NIH hibe NS060677 ve kısmen NIH MH099559 ve (BSK kadar) MH104069 verir tarafından desteklenmiştir. Eserin de CHDI Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
- Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Khakh, B. S., North, R. A. Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS. Neuron. 76, 51-69 (2012).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice. J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).
- Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release. J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).
- Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains. Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).
- Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).
- Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes. J Vis Exp. 26, (2009).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).
- Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).
- Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo. Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo. Nat Commun. 5, 3262 (2014).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).
- Eid, T., et al. Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy. Lancet. 363, 28-37 (2004).
- Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).
- Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat. Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).
