Introduction
Gli astrociti sono cellule gliali onnipresenti e abbondanti del cervello. E 'ben noto che gli astrociti servono di sostegno vitale e ruoli omeostatici, tra cui il buffering di K + concentrazione nello spazio extracellulare, l'assorbimento di neurotrasmettitori oltre a fornire le sostanze nutritive. Tuttavia, studi recenti dimostrano che anche la visualizzazione [Ca 2+] i segnali, che si verificano spontaneamente e sono aumentate di attività neuronale 1. L'esistenza di astrociti [Ca 2+] i segnalazione è stata sempre più pensato per innescare la loro comunicazione con i neuroni, e come tale è stato interpretato come una forma di "Ca 2+ eccitabilità" all'interno di astrociti. I dati disponibili nel corso degli ultimi due decenni suggeriscono due ambienti in cui gli astrociti e neuroni possono comunicare, forse in maniera bidirezionale. In primo luogo, gli astrociti spesso rispondono con un aumento della [Ca2 +] i, quando attivato da neurotrasmettitori eneuromodulatori rilasciati dai neuroni 2. In secondo luogo, [Ca 2+] i accresce in astrociti causare il rilascio di molecole di segnalazione da astrociti, che a loro volta possono influenzare i neuroni e vasi sanguigni. L'evidenza suggerisce che molecole rilasciate dagli astrociti portano a cambiamenti nelle funzioni delle sinapsi, circuiti e in ultima analisi il comportamento 3-5 tramite segnalazione astrociti-to-neurone. Tuttavia, questo rimane un settore di ricerca in rapido sviluppo, e si è sostenuto che una migliore e dettagliata comprensione di astrociti [Ca 2+] i è necessaria per risolvere alcune delle attuali incertezze 6.
Nel lavoro passato, è stato dimostrato che grosso carico di organici Ca 2 + indicatore coloranti in astrociti non riesce a rilevare in modo affidabile [Ca 2+] i segnali all'interno intere astrociti in coltura e in situ 7-10. Questi risultati sono stati discussi da noi e altri 6,11,12. Il Emerging quadro è che [Ca 2+] i segnali all'interno dei processi di astrociti (ad esempio, rami e ramoscelli), che sono i siti principali per le interazioni con i neuroni e vasi sanguigni, sono stati raramente esplorato in dettaglio. Recentemente, l'uso di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) come GCaMP3 citosolica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana plasmatica versioni tethered (ad esempio, Lck-GCaMP3) ha permesso lo studio di [Ca 2+] i segnali in piccoli scomparti di astrociti tali processi sottili, vicino alla membrana plasmatica ed entro interi territori 7,8. Tuttavia, GECIS hanno uno svantaggio negli organici Ca 2+ indicatore coloranti e che è il requisito per i metodi genetici per fornire i geni che codificano selettivamente ai astrociti in vivo per periodi di settimane per il GECIS di essere adeguatamente espresso. Espressione in vivo è tipicamente realizzato utilizzando topi transgenici, knock-in topi o con virus a base di consegna appscarafaggi. Nel presente articolo Giove riportiamo i metodi e le procedure utilizzate per fornire GECIS di astrociti striatali che utilizzano virus adeno-associati. Facciamo il cito-GCaMP3 come esempio, ma la stessa procedura di base funziona per qualsiasi altra GECI o fluorescenti giornalista base di proteine.
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Protocol
Tutti i protocolli di animali erano in accordo con la US National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la UCLA.
1.1) Preparare Micropipette e AAV2 / 5 Virus Loading
- Utilizzare sottili micropipette di vetro borosilicato per l'iniezione del virus. Tirare la micropipetta utilizzando un programma che tira in due fasi con un estrattore verticale. Smusso la pipetta con un angolo di 40 ° utilizzando una smerigliatrice pipetta. La pipetta che è ideale per uso avrà un diametro di punta di 20 - 40 micron e una lunghezza gambo 6 - 7 mm. Autoclave la pipetta e strumenti chirurgici. Il trapano è sterilizzato strofinando con etanolo al 70%.
- Conservare il virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), a -80 ° C in 10 aliquote microlitri. Poco prima di un intervento chirurgico, prendere le aliquote fuori dal freezer e conservare in ghiaccio fino usato per il riempimento the micropipetta.
- Riempire la micropipetta con il virus utilizzando una pompa a siringa. Collegare strettamente una estremità di un pezzo di tubo, attraverso una compressione tubo di dimensioni appropriate raccordo, ad una siringa di vetro con uno stantuffo rinforzato. Fissare la micropipetta autoclavato all'altra estremità del pezzo di tubo attraverso una dimensione appropriata compressione ago asportabile raccordo.
- Prima di caricare il vettore virale, rimuovere le bolle d'aria dal sistema di pompaggio compresa tubazione, siringa e micropipetta dal riempimento del circuito con olio minerale colorato con Sudan IV rosso (~ 1 mg / 50 ml) in una siringa da 1 ml con un ago (27 G ).
- Posizionare un pezzo di parafilm pulita sotto la micropipetta di vetro, e dispensare 5-10 ml di vettore virale sul parafilm.
- Aspirare il vettore virale spostando lo stantuffo della siringa all'indietro a 0.5 ml / min, e marcare il confine tra il vettore e l'olio sulla pipetta di vetro.
1.2) Anestesia, taglio dei capelli, Head fissaggio e preparazione per craniotomia
- Mettere un mouse (P49-63, C57BL / 6) nella camera riempita con N 2 O e O 2 e 5% isoflurano. Valutare la profondità dell'anestesia dalla perdita di movimento intenzionale e una frequenza respiratoria rallentato (~ 60-90 / min). Tagli capelli sulla testa quando il mouse è anestetizzato.
- Montare il mouse nel telaio stereotassico, con la testa protetta da orecchio bar smussati e il naso inseriti in un sistema di anestesia e ventilazione. Mantenere isoflurano continuo a 2 - 3%. Applicare lacrime artificiali unguento per entrambi gli occhi in quanto i topi perdono la loro istintiva chiusura delle palpebre in anestesia.
- Somministrare 0,05 ml di buprenorfina (0,1 mg / ml) per via sottocutanea per alleviare il dolore.
- Area chirurgica pulita con il 10% di iodio povidone e il 70% di alcol tre volte, alternando tra le due soluzioni e iniziando con iodio povidone. Inizia dal fronte e pulire verso il retro per rimuovere i peli già tagliati.
- Fare un incisione cutanea sulla parte superiore of testa che inizia tra gli occhi e termina tra le orecchie.
1.3) Craniotomia e microiniezioni
- Rimuovere il periostio facendo scorrere con un batuffolo di cotone e poi asciugare la superficie del cranio con batuffoli di cotone dentale. Fare un segno intorno al sito di iniezione, e forare intorno al bordo del segno usando una piccola bava acciaio alimentato da un trapano ad alta velocità.
- Rimuovere l'osso e pulire la superficie con soluzione salina.
- Posizionare la pipetta nel dorsale laterale sinistro striatum con le seguenti coordinate (mm): antero-posteriore 0,8, mediale-laterale: +2.0, dorso-ventrale dalla superficie piale: -2.4 13. Si noti che queste coordinate significano che la punta dell'ago microiniezione si trova appena sopra striato dorsolaterale (Figura 1A, B), nel senso che penetra leggermente all'interno di questo nucleo. Evitare di danneggiare i vasi sanguigni. Se la pipetta sembra essere proprio su un vaso sanguigno, leggermente regolare lacoordinate da ~ 0,1 - 0,2 mm.
- Inizia iniezione con velocità di iniezione fissato a 0,2 ml / min, e in genere iniettare 1 a 1,5 ml di virus.
- Lasciare la pipetta in posizione dopo l'iniezione per 10 minuti, e quindi estrarre la pipetta lentamente.
- Termina con la chiusura della ferita chirurgica con sutura continua in nylon esterna sutura.
1.4) Recupero
- Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra elettrica per 24 ore. Non restituire un mouse che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare incustodito il mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
- Aggiungere Trimetoprim Sulfamethoxiazole (5 ml per acqua 500 ml, contenenti 40 mg di trimetoprim e 200 mg sulfamethoxiazole) in acqua per una settimana. Somministrare Buprenorfina due volte al giorno per un massimo di 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Mantenere il mouse su una luce-buio ciclo di 12 ore, nutriti e abbeverati ogni giorno, unND è ponderato una volta al giorno fino a 3 giorni dopo l'intervento chirurgico. In questi 3 giorni, qualsiasi mouse con una perdita di oltre il 10% del peso corporeo è considerato compromessa, e sarà eutanasia invece di essere sottoposto a sperimentazione.
- Separatamente, cambiare la gabbia del mouse due volte alla settimana, e il monitoraggio per la salute generale, almeno una volta al giorno. In genere, il mouse viene utilizzato entro 2 - 3 settimane dopo le microiniezioni stereotassica.
2. acuta del cervello Fetta Preparazione per confocale Ca 2+ Imaging
2.1) Preparazione di Taglio e Soluzioni di registrazione.
- Preparare soluzione comprendente (mM) di taglio: 194 saccarosio, 30 NaCl, KCl 4,5, 10 D-glucosio, 1 MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4, e 26 NaHCO3, saturata con 95% O 2 e 5% di CO 2.
- Preparare la soluzione di registrazione che comprende (mm): 124 NaCl, KCl 4,5, 1 MgCl 2, 10 D-glucosio, 2 CaCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4 3; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm, saturata con 95% O 2 e 5% di CO 2. Riempire il bicchiere fetta cervello che tiene con soluzione di registrazione, e la tiene a 34 ° C.
2.2) Affettare
- Due o tre settimane dopo microiniezioni stereotassica, profondamente e terminali anestetizzare il mouse, e poi decapitarlo.
- Estrarre il cervello, e usare una lama per rimuovere il uninjected emisfero destro, e montare il sinistro sul vassoio vibratome con colla super. Riempire il vassoio vibratome con tampone di ghiaccio taglio a freddo, e continuare a saturare con il 95% O 2 e il 5% di CO 2.
- Tagliare fettine di cervello striatali coronali o sagittali a 300 micron di spessore. Di solito, 4-5 coronale, o 6-7 fette striatali sagittali possono essere raccolti.
- Trasferire le fette al bicchiere con fetta riscaldato a 34 ° C, e tenerli lì per 30 minuti prima di riporli a temperatura ambiente per la successiva recording.
- Incubare le sezioni di cervello di buffer di registrazione ossigenata a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima del [Ca 2+] i di imaging.
3. L'immunoistochimica (IHC)
- Due settimane dopo l'iniezione del virus, defluire in mouse transcardially con PBS seguita da 10% di formalina in PBS.
- Rimuovere, post-correzione durante la notte, e cryoprotect il cervello in tamponata 30% di saccarosio per almeno 2 giorni.
- Preparare 40 micron sezioni utilizzando un microtomo criostato.
- Lavare le sezioni 3 volte con PBS a 10 min di intervallo.
- Incubare le sezioni per 1 ora in PBS con siero normale di capra 10% e 0,5% Triton X-100.
- Incubare sezioni notte a 4 ° C in anticorpo primario preparato in PBS con 0,5% Triton X-100. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: pollo anti-GFP 1: 1.000, topo anti-S100β 1: 400, topo anti-NeuN 1: 600, topo anti-glutammina sintetasi 1: 300.
- Lavare le sezioni 3 volte con PBS a 10 min intervalli.
- Incubare le sezioni con anticorpi secondari preparati in PBS con siero normale di capra 10% per 2 ore a temperatura ambiente. Il secondo anticorpi sono stati i seguenti: capra anti-topo Alexa546 1: 500, capra anti-pollo Alexa488 1: 500.
- Montare le sezioni su vetrini, asciutto ed applicare alcune gocce di mezzo di montaggio antifade, quindi coprire lentamente le sezioni con un coprioggetto di vetro. Conservare i vetrini a 4 ° C.
- Prendete le immagini su un microscopio confocale con un obiettivo ad immersione in olio 40X con una apertura numerica di 1,3.
4. confocale [Ca 2+] i Imaging
NOTA: [Ca 2+] i di imaging è stato fatto utilizzando un microscopio confocale con un 40X acqua ad immersione lente dell'obiettivo con una apertura numerica di 0,8.
- Tra 1 e 5 ore dopo il taglio, fetta posto nella camera di registrazione e superfuse con buffer di registrazione ossigenata a temperatura ambiente con una portata di 1 - 2 ml permin. Poi posto un'arpa platino con corde di nylon sulla parte superiore della fetta di ridurre al minimo il movimento durante l'esperimento.
- Visualizza e individuare striato dorsale con campo chiaro luminescenza con un obiettivo 10X immersione in acqua.
- Passare alla lente obiettivo 40X immersione in acqua, e accendere la linea 488 nm del laser Argon. Modificando il piano focale, trovare cellule situate a circa 20 micron sotto la superficie fetta, la visualizzazione di fluorescenza basale a Soma, rami e ramoscelli. Da segnalare, le cellule compromesse solito mostrano il livello di fluorescenza di sopra della media, che dovrebbe essere evitato.
- Utilizzare la modalità di 'scansione intermittente' per avviare la scansione. Generalmente, l'intensità del laser regolata a 0,5 - 5% della potenza massima è sufficiente image [Ca 2+] i con cito-GCaMP3. Per il monitoraggio [Ca 2+] i dinamiche in tutto il territorio degli astrociti, la 'scansione intermittente', con una velocità di scansione di 1 secondo per fotogramma o più veloce è raccnded, ma questo deve essere deciso a seconda dell'esperimento in questione.
- Se necessario, per l'immagine [Ca 2+] i nei processi, usare lo zoom digitale di 2 - 3 volte a monitorare 1 - 2 astrociti in tutto il campo visivo.
- Per evitare i pixel saturi durante la registrazione, utilizzare la modalità di ricerca 'HiLo' per PseudoColor le cellule. Iniziare sempre con una "registrazione pilota" per circa 5 minuti, per verificare se il colore rosso appare come l'indicazione di saturazione. In tal caso, abbassare la potenza di uscita del laser, o abbassare il PMT / guadagno / valori di offset e di effettuare un'altra registrazione pilota per testare i valori dei pixel sono nell'intervallo non saturo. In genere, i parametri utilizzati per l'imaging combinate astrociti [Ca 2+] i nello striato sono i seguenti: potenza del laser in uscita 0,5-5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Guadagno 2.0 - 3.5X, e offset 0 - 5%.
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Representative Results
Per astrociti espressione specifica del cito-GCaMP3 nello striato, abbiamo usato il virus adeno-associato (AAV) del sierotipo 5, e la GFAP GfaABC 1 D promotore (Figura 1A), che è stato precedentemente dimostrato da guidare robusta GCaMP3 e gene reporter espressione in ippocampo e astrociti corticali 8,14. Due settimane dopo microiniezione virus nello striato del mouse, il mouse (~ 10 settimane) è stato perfuso e IHC è stata eseguita su sezioni di cervello sottili per valutare l'espressione cito-GCaMP3 nello striato (Figura 1B). Abbiamo rilevato cito-GCaMP3 utilizzando anticorpi GFP e anche macchiato le fette con un marcatore astrociti nota, S100β. Espressione cito-GCaMP3 è stato trovato solo in cellule positive S100β. Nessuna espressione è stata trovata nei neuroni visualizzati con NeuN (Figura 2A e 2B), suggerendo astrociti specifica espressione. È importante sottolineare che l'espressione cito-GCaMP3 è stata rilevata in circa il 60% di cellule positive S100β (Fifigura 2C).
Gli astrociti rispondono agli insulti cerebrali come lesioni, ischemia e di infezione visualizzando i cambiamenti che sono diventati noti come astrociti reattività, che rappresenta uno spettro di possibili modifiche da lieve a grave 15. Abbiamo cercato di valutare se microiniezione virus ha causato palese astrociti reattività. E 'stato precedentemente dimostrato che i livelli di espressione ridotti di glutammina sintetasi (GS) sono stati associati con gli astrociti reattivi 16,17. Pertanto, l'espressione GS nello striato di WT e virus iniettato topi è stato confrontato. Abbiamo trovato cambiamenti significativi nell'espressione GS negli astrociti striatali dopo l'iniezione del virus (Figura 3A - C), indica l'assenza di reattività astrociti manifesta con livelli di GS come una metrica. Questo approccio generale potrebbe essere ampliata in futuro lavoro per valutare astrociti reattività con altri marcatori di reattività. Si noti tuttavia che i livelli di GFAP non possono essere un modo adatto per misurare la reattività in striatAL astrociti, perché GFAP non si esprime a livelli rilevabili nella maggior parte degli astrociti striatali in condizioni basali 18. In sintesi, utilizzando IHC concludiamo espressione cito-GCaMP3 era robusto e specifico per astrociti nello striato, e che l'iniezione del virus non ha causato astrociti reattività come valutato dal GS modifiche a livello di espressione.
Abbiamo poi preparato fettine di cervello acute da virus topi iniettati di immagine [Ca 2+] i in astrociti striatali. Acute 300 micron fette sagittali o coronali sono stati preparati, e dopo un periodo di ripresa fette sono stati collocati in una camera di registrazione su un microscopio confocale di [Ca 2+] i di imaging utilizzando la linea 488 nm di un laser ad Argon. Astrociti striatali che esprimono cito-GCaMP3 potrebbero essere presentati chiaramente in più (di solito tutti) delle fette striatali (~ 6 - 7 fette per il mouse), come mostrato visibile fluorescenza verde nelle cellule con morfologia chiaramente cespuglioso (Figura 4 Figura 4A; almeno 10 astrociti visualizzazione cito-GCaMP3 potrebbero essere esposte e sono riportati nella Figura 4A come regioni di interesse (ROI). Maggiore di imaging di ingrandimento con zoom digitale aggiuntiva di 2,0 - 3.0 è stato necessario individuare astrociti singoli (Figura 4B). In queste circostanze, interi territori astrociti sono stati rivelati mediante espressione cito-GCaMP3, come mostrato nella Figura 4B. Spontanei Ca 2+ segnali erano facilmente misurate nel somata nonché nei rami e ramoscelli di astrociti 6.
Figura 1: la consegna virale di GECIS (ad esempio cito-GCaMP3) da AAV2 / 5 nello striato topo adulto. A. Schema illustra il protocollo per AAV2 / 5 microiniezioni nello striato dorsolaterale.B. Mostra la posizione approssimativa dell'ago microiniezione in relazione alla striato e le coordinate per le iniezioni stereotassica. L'immagine di una fetta di Nissl-tinto in pannello B è stato scaricato da ALLEN BRAIN ATLAS.
Figura 2: Cito-GCaMP3 espressione era specifico per astrociti striatali. A - B. immagini rappresentative che mostrano che l'espressione cito-GCaMP3 colocalizza con un pennarello per astrociti (S100β) (B), ma non con un marcatore per i neuroni (NeuN) (A) C. Riepilogo grafico a barre per gli esperimenti di colocalizzazione come quelle mostrate. in A e B.
Figura 3: espressione Cito-GCaMP3 entro astrociti striatali non ha causato cambiamenti nell'espressione di GS.A - B. immagini rappresentative della GCaMP3 e GS IHC da topi che avevano ricevuto AAV2 / 5 per GCaMP3. Sono indicate anche le immagini per il controllo topi non iniettati. C. Grafico a barre riassume i risultati di esperimenti come quelli di A e B (ns non significativo indica utilizzando il test t di Student per dati non appaiati un, p <0,05).
Figura 4: Esempi rappresentativi di [Ca 2+] i segnali registrati dagli astrociti striatali con cito-GCaMP3. A. Un'immagine z-stack che mostra 10 astrociti (numerati 1 - 10) appiattito .La traccia sotto mostra [Ca 2+] i segnali registrati oltre 5 min dai 10 celle mostrate in A B. A appiattita e zoom-in z. immagine -stack per un singolo astrocyte.The traccia sotto mostra [Ca 2+] isegnali registrati oltre 5 min per la cella singola mostrato in B.
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Discussion
I metodi qui descritti hanno permesso di esprimere cito-GCaMP3 negli astrociti striatali in vivo per la successiva [Ca 2+] i di imaging in situ. Questo metodo presenta vantaggi rispetto utilizzando transgenici o topi knock-in, compreso robusta espressione della proteina bersaglio, rapidità e flessibilità di implementazione sperimentale e specificità anatomica. L'espressione di GCaMP3 utilizzando AAV2 / 5 è risultato essere specifico e robusto. La combinazione di GFAP GfaABC 1 D promotore con AAV del sierotipo 5 è critica per ottenere la specificità. Un limite della tecnica qui descritta è che l'infezione da virus e procedura di chirurgia possono causare astrociti reattività, in particolare con i virus ad alto titolo 19. È importante sottolineare che, in questo studio, AAV2 / 5 microiniezioni con basso titolo relativo non ha causato diminuzioni di GS che sono stati associati con astrociti reattività 19. Controlli simili sono stati riportati per Hippastrociti ocampal 8. Tuttavia, è importante sottolineare la necessità di tali controlli per ogni area del cervello da studiare, anche perché astrociti sono eterogenei 20, e poiché è probabile che svolgono funzioni diverse nelle diverse regioni del cervello.
Uno dei fattori importanti che possono influenzare la robustezza dell'espressione genica mirata con microiniezione virus sono le coordinate in uso, che varia tra i diversi ceppi di topi e cambiamenti nel corso dello sviluppo degli animali. Solo topi C57BL / 6 di ~ 8 settimane di età sono stati usati in questo studio. E 'stato inoltre dimostrato che l'espressione virale di GFP in neuroni striatali e astrociti nei ratti è stato possibile rilevare quattro giorni dopo l'iniezione, ha raggiunto un plateau di 2 - 4 settimane dopo l'iniezione, e poi è rimasto stabile per 9 mesi dopo l'iniezione 21. La durata di espressione cito-GCaMP3 non è stata determinata proprio qui, ma almeno due settimane per l'espressione del virus sonoraccomandato.
L'approccio di utilizzare AAV2 / 5 espressione mediata di GECIS negli astrociti striatali può ora essere utilizzato per comprendere meglio astrociti [Ca 2+] i di segnalazione nello striato. In particolare, il livello di espressione cito-GCaMP3 è sufficientemente elevato da consentire l'imaging di [Ca 2+] i segnali in piccole popolazioni di astrociti (~ 10 celle) e nei interi territori dei singoli astrociti. L'analisi dettagliata del [Ca 2+] i segnali è ancora in corso, ma finora [Ca 2+] i segnali sono stati rilevati da processi distali fino a ~ 50 micron di distanza dal soma (Figura 4). Esperimenti dettagliate su astrociti [Ca 2+] i segnali e le loro funzioni correlative e causali all'interno del corpo striato sono fattibili. In futuro, gli approcci raffinati (cioè, promotori) sono necessari per fornire GECIS alle popolazioni geneticamente definite di astrociti in modo che si puòesplorare segnalazione calcio all'interno diverse popolazioni di astrociti 20.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La maggior parte del lavoro e del personale coinvolto sono stati sostenuti dal NIH concedere NS060677 e in parte dal NIH concede MH099559 e MH104069 (a BSK). Una parte del lavoro è stato anche sostenuto dalla Fondazione CHDI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
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