Introduction
星形胶质细胞是脑的无处不在的和丰富的神经胶质细胞。它是公认的星形胶质细胞起到重要的支持和内环境稳定的作用，包括钾离子浓度在细胞外空间缓冲，摄取神经递质以及提供营养素。然而，最近的研究表明，它们也显示的[Ca 2+] i的信号，自发，并且增加了神经元的活动1。星形胶质细胞的存在的[Ca 2+] i的信令已被越来越多地认为是触发它们与神经元的通信，并因此被解释为“ 钙离子兴奋”星形胶质细胞内的形式。在过去的二十年里，现有数据表明两个设置在其中的星形胶质细胞和神经元可能通信，也许以双向方式。首先，星形胶质细胞经常与我当神经递质和激活增加的[Ca 2+]回应从神经元释放2神经调节。第二，内[Ca 2+]的星形胶质细胞中的我的增加导致从该反过来可影响神经元和血管的星形胶质细胞的信号分子的释放。有证据表明，由星形胶质细胞释放的分子，导致经由星形细胞向神经细胞信号传导的改变突触，电路和最终行为3-5的功能。然而，这仍然是一个快速发展的研究领域，它已经认为更好，详细了解星形胶质细胞的[Ca 2+] i的需要，以解决目前的一些不确定因素6。
在过去的工作中，已证明该批量加载的有机的Ca 2+指示剂染料为星形胶质细胞不能可靠地检测的[Ca 2+]在培养和原位 7-10整个星形胶质细胞内的I信号。这些研究结果已经被美国和其他6,11,12讨论。该emergin克图象是内[Ca 2+] i的星形胶质细胞过程（ 例如，分支和小枝），这是在主站点与神经元和血管内的相互作用的信号，很少被详细探讨。最近，利用基因编码的钙指标（GECIs），如胞浆GCaMP3，GCaMP5G和GCaMP6和质膜拴版本（ 例如 ，lck的-GCaMP3）已批准的[Ca 2+] i的信号的研究星形胶质细胞等的小隔间薄工艺，近质膜和整个领土7,8内。然而，GECIs有超过有机钙指示剂染料有一个缺点，那就是要求遗传方式有选择地提供编码基因的星形胶质细胞在体内数周的时间来完成的GECIs要适当地表达出来。表达在体内通常实现使用转基因小鼠，基因敲除小鼠或基于病毒递送的应用程序蟑螂。在本朱庇特的文章，我们报告来输送GECIs使用腺相关病毒纹状体星形胶质细胞的方法和程序。我们专注于CYTO-GCaMP3作为一个例子，但是相同的基本过程适用于任何其他GECI或荧光蛋白的基于报告。
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Protocol
所有的动物都是协议符合卫生指南的美国国家研究院实验动物的护理和使用，并经实验动物管理和使用委员会在加州大学洛杉矶分校。
1.1）编写微管和AAV2 / 5加载病毒
- 用细硼硅玻璃为微量注射的病毒。使用两步骤拉方案具有垂直拉出拉微量。斜角移液器在40℃通过使用移液管磨机的角度。这是理想的利用吸移管将具有20的前端直径为 - 40微米，6的柄长度 - 7mm左右。高压釜的吸管和手术器械。钻头是通过用70％乙醇擦拭消毒。
- 存储该病毒的AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40（1.5×10 13 GC /毫升）中，在-80℃下在10微升等分试样。刚好手术前，取出等分试样进行冷冻机的和在冰上储存直至用于填充第Ë微量。
- 填充用病毒注射泵微量。紧紧一个管件，的一端连接，通过一个适当尺寸的管道压力接头，以在玻璃注射器用钢筋柱塞。通过一个适当尺寸的可移动针压缩接头连接的高压灭菌微量到管件的另一端。
- 前加载的病毒载体，通过填充系统与矿物油着色苏丹红IV（〜1毫克/ 50毫升）的1毫升注射器针头（27G的除去从所述泵送系统包括管道，注射器和微量气泡）。
- 将一块干净的封口膜在玻璃微吸管，并免除5 - 10微升的病毒载体上的封口膜。
- 吸病毒载体通过使注射器的柱塞向后以0.5微升/分钟，并标记上的玻璃移液管将载体和油之间的边界。
1.2）麻醉，剪发，HEAD固定，准备开颅
- 把鼠标（P49-63，C57BL / 6）放入盛有N 2 O和O 2和5％异氟醚室。由损耗有目的的运动和减缓呼吸速率（ - 90 /分钟〜60）评估麻醉深度。剪下的头发在头上当鼠标麻醉。
- 适合鼠标在立体框架，其头部被钝器耳棒和鼻子放入麻醉和通风系统安全。保持持续的异氟醚在2 - 3％。应用人工泪液软膏双眼，因为老鼠失去了在麻醉状态下的眨眼反射。
- 通过皮下注射来缓解疼痛管理0.05毫升丁丙诺啡（0.1毫克/毫升）的。
- 用10％聚维酮碘和70％乙醇3次清洁手术区域，这两种溶液之间交替并开始与聚维酮碘。开始从正面和擦拭朝向背面以除去任何已切断毛发。
- 做一个皮肤切口上顶OF的眼睛之间开始和耳朵之间结束了头。
1.3）开颅手术和显微注射
- 用棉签刷去除骨膜，然后用干的牙科棉球头骨的表面。使注射部位周围的标记，并钻周围用小钢毛刺搭载了高速钻头的标记的边缘。
- 除去骨和清洁表面用生理盐水。
- 将吸管插入左背外侧具有以下坐标（毫米）纹状体：前后0.8，内侧，外侧：2.0，背腹的软脑膜表面：-2.4 13。需要注意的是这些坐标表示的显微注射针的尖端位于正上方的背外侧纹状体（ 图1A，B）中 ，这意味着它只能略微这个核内贯通。避免损坏血管。如果吸移管恰好是正确的血管上，稍微调整通过坐标〜0.1 - 0.2毫米。
- 开始注射用喷射率设定为0.2微升/分钟，并且通常注入1〜1.5微升病毒。
- 留在原地的移液管注入10分钟后，再抽出吸管缓慢。
- 通过闭合手术切口连续缝合外的尼龙缝合完成。
1.4）恢复
- 把鼠标在干净的笼子上的一个加热垫24小时。不返回鼠标已经动过手术，以其他动物的公司，直到完全康复。不要让无人看管的鼠标，直到它已经恢复了足够的意识，保持胸骨斜卧。
- 添加苄啶Sulfamethoxiazole（每500毫升的水5毫升，含有40mg的甲氧苄啶和200毫克sulfamethoxiazole）在水中一周。手术后给予丁丙诺啡，每天2次，3天。
- 维持小鼠在12小时明暗周期，进料并每日浇水，一次被加权每天一次至3天手术后。在这3天，所有鼠标具有大于10％的体重损失被认为是受到损害，并会被安乐死，而不是进行实验。
- 另外，每周两次更换鼠笼，并至少一次，每天监测总体健康状况。 3周立体显微注射后 - 通常情况下，鼠标在2使用。
2.急性脑切片准备共聚焦钙成像
2.1）准备切割和记录解决方案。
- 准备切割溶液包含（mM 计）：194蔗糖，30的NaCl，4.5的KCl，10个D-葡萄糖，1的MgCl 2，1.2的NaH 2 PO 4和26的NaHCO 3中，用95％O 2和5％CO 2饱和的。
- 准备记录溶液含有（mM计）：124氯化钠，氯化钾4.5，1的MgCl 2，10 D-葡萄糖，2的CaCl 2，1.2的NaH 2 PO 4的碳酸氢钠 ; pH为7.3 - 7.4 290 - 295毫渗透摩尔浓度，用95％ 的 O 2和5％CO 2饱和的。充满录音解决方案的脑切片拿着烧杯中，并保持在34℃。
2.2）切片
- 经过两到三周立体显微注射，深入，晚期麻醉鼠标，然后斩首了。
- 提取大脑，并使用叶片以除去未注射的右半球，和左1安装到使用超级胶水的vibratome托盘。填充的vibratome托盘用冰冷的切割缓冲液中，并保持在95％O 2和5％CO 2饱和的。
- 切冠状或矢状纹状体脑片在300微米的厚度。通常情况下，4 - 5冠状或6 - 7矢状纹状体片可以收集。
- 转移的切片的切片保持烧杯加热至34℃，并且将它们存储在室温下用于随后recordi之前保持它们有30分钟NG。
- 的[Ca 2+] i的成像前孵育在含氧记录缓冲器的脑切片在室温下放置至少30分钟。
3.免疫组织化学（IHC）
- 病毒注射后两周内，灌注小鼠transcardially用PBS随后在PBS中的10％福尔马林中。
- 除去，后固定过夜，并cryoprotect大脑中缓冲的30％蔗糖，至少2天。
- 准备用冷冻切片机切片机40微米的部分。
- 冲洗切片3次，用PBS在10分钟的时间间隔。
- 孵育切片1小时，在PBS中，用10％正常山羊血清和0.5％的Triton X-100。
- 在制备在PBS中，用0.5％的Triton X-100的第一抗体过夜孵育切片在4℃下。分别用第一抗体如下：鸡抗GFP 1：1000，小鼠抗S100β1：400，小鼠抗神经元核抗原1：600，小鼠抗谷氨酰胺合成酶1：300。
- 冲洗切片3次，用PBS以10米在时间间隔。
- 孵育制备在PBS中，用10％正常山羊血清进行2小时，在室温下的二级抗体的部分。所述第二抗体分别为：山羊抗小鼠Alexa546 1:500，山羊抗鸡Alexa488 1：500。
- 安装在载玻片上，干燥的部分并应用抗褪色封固剂的数滴，然后慢慢盖上玻璃盖玻片的部分。存放载玻片在4℃下。
- 拍摄图像上的一个共焦显微镜用40X油浸镜头具有1.3的数值孔径。
4.共焦的[Ca 2+] i的成像
注：内[Ca 2+] i的成像使用共聚焦显微镜用40X水浸物镜透镜用0.8的数值孔径已完成。
- 2毫升每 - 在1至5小时的切片，切片位置在记录室中，用含氧记录缓冲器superfuse在室温下用1流量后分钟。然后放置在片的顶部的铂竖琴用尼龙绳的实验过程中最小化的运动。
- 可视化和找到下一个10倍的水浸泡的目的背侧纹状体与明场致发光。
- 切换到40X水浸物镜透镜，并打开氩激光器的488纳米线。通过改变焦平面，发现细胞位于大约20微米的薄片表面的下方，显示基础荧光的细胞体，树枝和小枝。值得注意的是，受损细胞通常会显示高于平均荧光水平，这应该被避免。
- 使用“帧扫描”模式，开始扫描。通常，激光强度调节到0.5 -最大输出的5％是足够的，以图像的[Ca 2+] i的与CYTO-GCaMP3。对于监控的[Ca 2+] i的动态星形胶质细胞的全境，“帧扫描”，每帧或更快的1秒的扫描率recommended，但这需要取决于实验中的问题来决定。
- 如果有必要，图像的[Ca 2+] i的过程中，使用了2个数字放大- 3倍，监视1 - 2星形胶质细胞在整个视场。
- 为了避免拍摄过程中饱和像素，使用“高住低训'的查找模式，伪细胞。始终以“试点记录”约5分钟开始，如果显示为红色，饱和度指标进行测试。如果是这样，降低激光的输出功率，或降低PMT /增益/偏移值，并执行另一个导频记录到测试中的像素值处于非饱和的范围内。典型地，用于成像的星形胶质细胞的组合参数的[Ca 2+] i的纹状体如下：激光输出功率0.5 - 5％（10毫瓦），光电倍增管550 - 650伏，增益2.0 - 3.5X，和偏移0 - 5％。
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Representative Results
为CYTO-GCaMP3的纹状体中的星形胶质细胞特异性表达，我们使用腺相关病毒（AAV）的5血清型，并且GFAP GfaABC 1（D）的启动子（ 图1A），已被先前显示驱动健壮GCaMP3和报告基因在海马和皮层星形胶质细胞8,14表达。两个星期后，病毒注射到小鼠纹状体中，小鼠（〜10周龄）中的灌注和免疫组化物上薄的大脑切片进行评估纹状体中（ 图1B）CYTO-GCaMP3表达。我们发现CYTO-GCaMP3用GFP抗体，也沾上了一个已知的星形胶质细胞的标记，S100β切片。 CYTO-GCaMP3表达，只有在S100β阳性细胞中发现的。没有表达被发现在神经元可视化处理的NeuN（ 图2A和图2B），提示星形胶质细胞特异性表达。重要的是，CYTO-GCaMP3表达在〜S100β阳性细胞的60％（ 连接检测gure 2C）。
星形胶质细胞对脑损伤如外伤，缺血，感染通过显示已成为众所周知的星形胶质细胞的反应性，其表示从轻度到重度15的电位变化的频谱的变化作出响应。我们试图评估如果病毒注射引起明显的星形胶质细胞反应性。它以前曾表明，谷氨酰胺合成酶（GS）的降低的表达水平与反应性星形胶质细胞16,17相关联。因此，在WT和病毒注射的小鼠的纹状体的GS表达进行了比较。我们发现在以下病毒注射液（ 图3A - C）纹状体星形胶质细胞GS表达无显著变化，说明使用GS水平作为指标没有明显的星形胶质细胞反应性。这是一般的做法可能会在今后的工作中使用反应性等指标进行扩展，以评估星形胶质细胞反应性。但是，请注意，GFAP水平可能不是一个合适的方法来测量反应中striat人星形胶质细胞，胶质纤维酸性蛋白，因为在被检测水平的基础条件18岁以下不表达最纹状体星形胶质细胞。总之，通过使用免疫组化，我们得出结论：CYTO-GCaMP3表达健壮和特定于纹状体星形胶质细胞，并且该病毒注射没有引起星形胶质细胞的反应性的评估，GS表达水平的变化。
接下来，我们在纹状体星形胶质细胞从编写病毒注入小鼠急性脑切片图像的[Ca 2+] i的。急性300微米厚的矢状或冠状切片制备，并且一段时间的恢复后的切片置于记录室中的一个共焦显微镜的[Ca 2+] i的成像用氩激光器的488nm的线。 ，因为他们表现出明显的绿色荧光的细胞清晰浓密的形态（ 图4 -纹状体星形胶质细胞表达CYTO-GCaMP3可以很容易地在大多数的纹状体片（每只小鼠7片〜6）的（通常都是）标识图4A中;至少10的星形胶质细胞显示CYTO-GCaMP3可以被成像和标绘在图4A中的感兴趣区域（ROI）的区域。高倍率影像与2.0的附加 数码变焦- 3.0有必要确定一个星形胶质细胞（ 图4B）。在这些情况下，整个星形胶质土被CYTO-GCaMP3表达显示， 如图4B所示。自发性的Ca 2+信号分别在胞体以及在枝条和星形胶质细胞6的小枝容易测量。
图1：病毒交付GECIs（ 如 CYTO-GCaMP3）由AAV2 / 5到成年小鼠纹状体。 A原理图说明了协议AAV2 / 5显微注射到背外侧纹状体。B.显示显微注射针相对于纹状体和用于立体定位注射坐标的近似位置。在B组一尼氏染色切片的图像，从艾伦脑图谱下载。
图2：CYTO-GCaMP3表达特定于纹状体星形胶质细胞。 A -显示CYTO-GCaMP3表达的共定位与星形胶质细胞的标记（S100β）（B），而与神经元标记（神经元核抗原）（A）C.摘要条形图共定位实验，像那些显示B.代表图像在A和 B。
图3：纹状体星形胶质细胞内的Cyto-GCaMP3表达没有引起变化的GS的表达。A - GCaMP3和GS免疫组化B.代表从收到AAV2 / 5 GCaMP3小鼠的图像。也显示了控制非注射的小鼠的影像。C.条形图总结了实验结果，如在A和B（NS表示不显著采用非配对t检验，P <0.05）。
图4：记录从纹状体星形胶质细胞CYTO-GCaMP3的[Ca 2+] i的信号的代表性实例。答：扁平显示10星形胶质细胞（编号为1 - 10）Z堆栈的图像.The跟踪下图显示的[Ca 2+] i的信号记录在从A和B A中所示的10个细胞5分钟夷为平地，放大Z轴。对于单个astrocyte.The -stack图像跟踪下图显示的[Ca 2+] i的信号记录，在5分钟内为在B中所示的单个细胞。
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Discussion
本文描述的方法，使我们能够表达CYTO-GCaMP3纹状体星形胶质细胞在体内原位后续的[Ca 2+] i的成像。这种方法比使用转基因或基因敲除小鼠，其中包括有针对性的蛋白质，快速稳健的表达和实施实验和解剖特异性的灵活性优势。用AAV2 / 5 GCaMP3的表达被认为是特定的和健壮。的GFAP GfaABC 1（D）的启动子与血清型5的腺相关病毒的结合是至关重要的，实现了特异性。此处所描述的技术的一个限制是，病毒感染和手术过程可能会导致星形胶质细胞的反应性，特别是与高滴度病毒19。重要的是，在目前的研究中，AAV2 / 5显微注射用相对低的滴度没有引起GS下降已与星形胶质细胞的反应性19相关联。类似的控制已被报道用于HIPPocampal星形胶质细胞8。然而，必须强调这些控制每个脑区的必要性是重要的待研究，尤其是因为星形细胞是异质的20，并且由于它们可能在脑的不同区域执行不同的功能。
一个可能影响使用病毒注射靶基因表达的鲁棒性的重要因素是在使用中的坐标，而变化不同的小鼠品系，并通过动物的发展变化之中。的〜8周龄只C57BL / 6小鼠被用于整个研究。它也已表明，病毒表达GFP在纹状体神经元和星形胶质细胞的大鼠可检测后4天注射，通过2达到平台-后4周注射，然后保持稳定持续9个月后注射21。 CYTO-GCaMP3表达的时程尚未精确确定在这里，但至少有两个星期的病毒表达的推荐使用。
使用在纹状体星形胶质细胞GECIs的AAV2 / 5介导的表达的方法，现在可以用于更好地了解星形胶质细胞的[Ca 2+] i的信令在纹状体中。具体来说，CYTO-GCaMP3表达水平足够高，允许的[Ca 2+] i的信号，星形胶质细胞的小种群（〜10细胞）和单星形胶质细胞的整个领土内成像。的[Ca 2+] i的信号的详细分析仍在进行中，但迄今为止的[Ca 2+] i的信号被检测到远端过程尽可能〜50微米的距离索玛（ 图4）。在星形胶质细胞的[Ca 2+] i的信号和纹状体内的相关性和因果功能的详细实验是可行的。在未来，精制的方法（ 即，启动子），需要提供GECIs到星形胶质细胞的基因定义种群，使得人能星形胶质细胞20的不同人群中的研究钙信号。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
大部分的工作和所涉及的人员由美国国立卫生研究院拨款NS060677，部分由美国国立卫生研究院授予MH099559和MH104069（以BSK）的支持。有些工作也是由CHDI基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
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