Introduction
Os astrócitos são células gliais ubíquas e abundantes do cérebro. Está bem estabelecido que os astrócitos servir de suporte vital e papéis homeostáticos incluindo buffer de K + concentração no espaço extracelular, a captação de neurotransmissores, bem como o fornecimento de nutrientes. No entanto, estudos recentes mostram que eles também exibem [Ca 2+] i sinais, que ocorrem espontaneamente e são aumentados pela atividade neuronal 1. A existência de astrócitos [Ca 2+] i sinalização tem sido cada vez mais pensado para provocar a sua comunicação com os neurônios, e, como tal, tem sido interpretada como uma forma de "Ca 2+ excitabilidade" dentro de astrócitos. Os dados disponíveis sobre as últimas duas décadas sugerem duas configurações em que os astrócitos e neurônios podem se comunicar, talvez, de forma bidirecional. Em primeiro lugar, os astrócitos, muitas vezes respondem com um aumento na [Ca 2+] i, quando activado pelos neurotransmissores eneuromoduladores liberados de neurônios 2. Em segundo lugar, [Ca 2+] i aumenta em astrócitos causam a liberação de moléculas de sinalização de astrócitos, que por sua vez podem afetar os neurônios e vasos sanguíneos. As evidências sugerem que as moléculas liberadas a partir de astrócitos levar a alterações nas funções de sinapses, circuitos e, em última instância comportamento 3-5 via de sinalização astrócitos-a-neurônio. No entanto, esta continua a ser uma área de pesquisa em rápido desenvolvimento, e tem-se argumentado que uma compreensão melhor e detalhada de astrócitos [Ca 2+] i é necessário para resolver algumas das incertezas atuais 6.
Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que o carregamento em massa de orgânicos Ca 2+ corantes indicador em astrócitos não consegue detectar com fiabilidade [Ca 2+] i sinais dentro astrócitos inteiras em cultura e in situ 10/07. Estes resultados foram discutidos por nós e outros 6,11,12. A Emerging imagem é que [Ca 2+] i sinais dentro dos processos de astrócitos (por exemplo, ramos e raminhos), que são os principais sítios de interação com neurônios e vasos sanguíneos, raramente têm sido explorados em detalhe. Recentemente, a utilização de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis), tais como GCaMP3 citosólica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana de plasma (por exemplo, versões tethered, Lck-GCaMP3) permitiu o estudo da [Ca 2+] i sinais em pequenos compartimentos de astrócitos tais processos como finas, perto da membrana do plasma e dentro territórios inteiros 7,8. No entanto, Gecis têm uma desvantagem sobre orgânicos Ca 2+ corantes indicadores e que é a exigência de métodos genéticos para entregar os genes que codificam para selectivamente astrócitos in vivo por períodos de semanas para a Gecis a ser apropriadamente expressa. Expressão in vivo é tipicamente alcançado utilizando camundongos transgênicos, bater-nos ratos ou com app entrega vírus baseadosbaratas. No presente artigo, relatamos JoVE métodos e procedimentos empregados para entregar Gecis para astrócitos do estriado usando vírus adeno-associados. Nós concentrar em cito-GCaMP3 como um exemplo, mas o mesmo procedimento básico funciona para qualquer outro GECI ou fluorescente repórter base de proteína.
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Protocol
Todos os protocolos de animais estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional na UCLA.
1.1) Prepare Micropipeta e AAV2 / 5 Vírus Carregando
- Use micropipetas de vidro de borosilicato finas para a injecção do vírus. Puxe a micropipeta usando um programa puxando de duas etapas com um puxador vertical. Bisel da pipeta com um ângulo de 40 °, utilizando um moinho de pipeta. A pipeta que é ideal para uso terão um diâmetro de ponta de 20 - 40 mm e um comprimento da haste de 6-7 mm. Autoclave a pipeta e instrumentos cirúrgicos. A broca é esterilizada por limpeza com etanol a 70%.
- Armazenar o vírus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), a -80 ° C em alíquotas de 10 ul. Pouco antes da cirurgia, tire as alíquotas do congelador e guarde no gelo até ser usado para o preenchimento de the micropipeta.
- Encher a micropipeta com vírus, utilizando uma bomba de seringa. Firmemente ligar uma extremidade de um pedaço de tubo, através de uma tubagem de compressão de tamanho adequado encaixe, para uma seringa de vidro com um êmbolo reforçado. Encaixe a micropipeta autoclavado para a outra extremidade do pedaço de tubo através de uma agulha de tamanho apropriado compressão encaixe removível.
- Antes de carregar o vector viral, remover bolhas de ar do sistema de bombagem, incluindo tubos, seringas e micropipeta enchendo o sistema com óleo mineral colorida com Sudan IV vermelha (~ 1 mg / 50 ml) numa seringa de 1 ml com uma agulha (27 L ).
- Coloque um pedaço de parafilm limpo sob a micropipeta de vidro, e dispensar 5-10 ul de o vector viral para o parafilme.
- Sugam o vector viral, movendo o êmbolo da seringa para trás a 0,5 ul / min, e marcam o limite entre o vector e o óleo sobre a pipeta de vidro.
1.2) A anestesia, corte de cabelo, Head Fixação e Preparação para Craniotomia
- Coloque um rato (P49-63, C57BL / 6) para a câmara cheia com N 2 O e O 2 e 5% de isoflurano. Avaliar a profundidade da anestesia, pela perda de movimento intencional e uma taxa respiratória lento (~ 60-90 / min). Cortar cabelo na cabeça quando o mouse é anestesiado.
- Montar o mouse no quadro estereotáxico, com a cabeça protegida por barras de ouvido sem corte e seu nariz colocados em um sistema de anestesia e ventilação. Manter contínua isoflurano a 2 - 3%. Aplicar pomada lágrimas artificiais para ambos os olhos desde que os ratos perdem o reflexo de piscar sob anestesia.
- Administrar 0,05 ml de buprenorfina (0,1 mg / ml) por injecção subcutânea para o alívio da dor.
- Limpo área cirúrgica com 10% de iodo de povidona e 70% de álcool três vezes, alternando entre as duas soluções e começando com povidona iodo. Comece pela frente e limpe para trás para remover todos os cabelos já cortados.
- Faça uma incisão na pele em cima of a cabeça, que se inicia entre os olhos e termina entre as orelhas.
1.3) Craniotomia e Microinjeções
- Retire o periósteo passando com um cotonete e depois secar a superfície do crânio com bolas de algodão dental. Fazer uma marca em torno do local da injecção, e perfurar em torno da borda da marca usando uma pequena rebarba de aço alimentado por uma broca de alta velocidade.
- Remover o osso e limpar a superfície com solução salina.
- Coloque a pipeta no dorsal e lateral esquerda da striatum com as seguintes coordenadas (mm): 0,8 ântero-posterior, médio-lateral: 2,0, dorsal-ventral da superfície pial: -2,4 13. Note-se que estas coordenadas significa que a ponta da agulha de microinjecção fica logo acima do estriado dorsolateral (Figura 1A, B), o que significa que só penetra ligeiramente dentro deste núcleo. Evite vasos sanguíneos prejudiciais. Se a pipeta passa a ser direito em um vaso sanguíneo, um pequeno ajuste nacoordenadas por ~ 0,1-0,2 mm.
- Iniciar a injecção com uma taxa de injecção ajustado a 0,2 ul / min, e injectar tipicamente de 1 a 1,5 ul de vírus.
- Deixar a pipeta no local após a injecção durante 10 min, e em seguida, retirar a pipeta lentamente.
- Finalize fechando a ferida cirúrgica com sutura contínua de nylon externo sutura.
1.4) Recuperação
- Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento, durante 24 horas. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe o mouse sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Adicionar Sulfamethoxiazole Trimetoprim (5 ml por 500 ml de água, contendo 40 mg de trimetoprim e 200 mg sulfamethoxiazole) na água durante uma semana. Administrar Buprenorfina duas vezes por dia durante 3 dias após a cirurgia.
- Manter o mouse em um ciclo claro-escuro de 12 horas, alimentados e regada diariamente, umnd é ponderada uma vez por dia até 3 dias após a cirurgia. Nestes três dias, todo o rato com uma perda de mais de 10% do peso corporal é considerado como comprometida, e serão sacrificados em vez de ser submetido a experimentação.
- Separadamente, mudar a gaiola do mouse duas vezes por semana, e monitor para a saúde em geral, pelo menos uma vez por dia. Normalmente, o mouse é usado dentro de 2-3 semanas após as microinjeções estereotáxica.
2. aguda do cérebro Slice Preparação para confocal Ca 2+ imagem
2.1) Preparação de Corte e Soluções de gravação.
- Preparar solução compreendendo (mM) de corte: 194 de sacarose, 30 NaCl, 4,5 de KCl, 10 D-glucose, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4, 26 e NaHCO 3, saturado com 95% O2 e 5% de CO 2.
- Preparar a solução de gravação compreendendo (mM): NaCl 124, KCl 4,5, MgCl 2 1, 10 D-glicose, 2 de CaCl2, 1,2 de NaH 2 PO 4 NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 290-295 mOsm, saturado com 95% O2 e 5% de CO 2. Encha o copo fatia do cérebro segurando com solução de gravação, e mantê-lo a 34 ° C.
2.2) O fatiamento
- Duas a três semanas após microinjeções estereotáxica, profunda e terminal anestesiar o mouse, e depois decapitá-lo.
- Extraia o cérebro, e usar uma lâmina para remover o hemisfério direito não injectada, e montar a esquerda na bandeja vibratome usando super-cola. Encher o tabuleiro de vibratome com tampão de corte a frio de gelo, e manter saturando-a com 95% de O2 e 5% de CO 2.
- Cortar fatias de cérebro do estriado coronais ou sagitais a 300 mm de espessura. Normalmente, 4-5 coronal, ou 6-7 fatias estriatais sagital podem ser coletadas.
- Transfira as fatias para o copo fatia segurando aquecido a 34 ° C, e mantê-los lá por 30 min antes de armazená-los em temperatura ambiente por recordi posteriorng.
- Incubar as fatias de cérebro de gravação em tampão oxigenado à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes de [Ca 2+] i imagiologia.
3. Imuno-histoquímica (IHQ)
- Duas semanas após a injecção de vírus, perfundir o rato transcardialmente com PBS, seguido por 10% de formalina em PBS.
- Retirar, pós-fixar durante a noite, e cryoprotect o cérebro em tamponada 30% de sacarose por pelo menos dois dias.
- Prepare 40 mm seções usando um micrótomo criostato.
- Enxágüe seções 3 vezes com PBS a 10 min de intervalo.
- Incubar secções durante 1 h em PBS com 10% de soro de cabra normal e com 0,5% de Triton X-100.
- Incubar secções durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário preparadas em PBS com 0,5% de Triton X-100. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: galinha anti-GFP 1: 1.000, de ratinho anti-S100β 1: 400, de ratinho anti-NeuN 1: 600, de rato anti-glutamina sintetase 1: 300.
- Enxágüe seções 3 vezes com PBS a 10 mem intervalos.
- Incubar as secções com anticorpos secundários preparadas em PBS com 10% de soro de cabra normal durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos secundários foram os seguintes: anticorpos de cabra anti-murganho Alexa546 1: 500, de cabra anti-galinha Alexa488 1: 500.
- Monte as secções em lâminas de vidro, seco e aplique algumas gotas de antifade meio de montagem, em seguida, cubra lentamente as seções com uma lamela de vidro. Armazenar as lâminas a 4 ° C.
- Tome imagens num microscópio confocal com uma lente de imersão em óleo de 40X com uma abertura numérica de 1,3.
4. confocal [Ca 2+] i Imagem
NOTA: [Ca 2+] i de imagem foi feita usando um microscópio confocal com uma lente objetiva de 40X de imersão em água com uma abertura numérica de 0,8.
- Entre 1 e 5 h após o corte, fatia lugar na câmara de gravação e gravação superfuse com tampão oxigenado à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 1-2 ml pormin. Em seguida, coloque uma harpa de platina com cordas de nylon em cima da fatia para minimizar o movimento durante o experimento.
- Visualizar e localizar o striatum dorsal com brilhante luminescência campo sob uma objectiva de imersão em água 10X.
- Alterne para a lente objetiva de 40X de imersão em água, e ligue a linha 488 nm do laser de argônio. Ao alterar o plano focal, encontrar células localizadas cerca de 20 mm abaixo da superfície da fatia, exibindo fluorescência basal em Soma, ramos e raminhos. De nota, as células comprometidas normalmente apresentar nível de fluorescência acima da média, o que deve ser evitado.
- Use o modo "quadro varredura 'para iniciar a digitalização. Normalmente, a intensidade do laser ajustado para 0,5 - 5% da potência máxima é suficiente para a imagem [Ca 2+] i com o cito-GCaMP3. Para monitorar [Ca 2+] i dinâmica em todo o território dos astrócitos, a "varredura frame 'com uma velocidade de varredura de 1 segundo por quadro ou mais rápido é recomeNDED, mas isso tem de ser decidido de acordo com o experimento em questão.
- Se necessário, a imagem [Ca2 +] i em processos, utilize ampliação digital de 2-3 vezes para monitorar 1-2 astrócitos em todo o campo de visão.
- Para evitar pixels saturados durante a gravação, utilize o modo de pesquisa "HiLo" a pseudo as células. Sempre comece com uma "gravação piloto" por cerca de 5 minutos, para testar se a cor vermelha aparece como indicação de saturação. Se for assim, diminuir a potência do laser, ou diminuir a PMT / Gain / compensar os valores e realizar uma outra gravação piloto para testar os valores de pixel estão na faixa não-saturada. Tipicamente, os parâmetros combinados utilizados para imagiologia de astrócitos [Ca 2+] i no corpo estriado são as seguintes: potência de laser de saída 0,5-5% (de 10 mW), PMT 550-650 volts, Ganho de 2,0 - 3,5 vezes maior, e deslocamento 0 - 5%.
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Representative Results
Para a expressão especifica de astrócitos de cito-GCaMP3 no striatum, utilizou-se vírus adeno-associado (AAV), do serotipo 5, e a PGFA GfaABC 1 D promotor (Figura 1A), que tem sido mostrado previamente para dirigir GCaMP3 robusta e o gene repórter expressão no hipocampo e astrócitos corticais 8,14. Duas semanas após a micro-injecção de vírus para o corpo estriado do rato, o rato (~ 10 semanas de idade) foi perfundido e IHC foi realizada em secções de cérebro finas para avaliar a expressão de cito-GCaMP3 no corpo estriado (Figura 1B). Detectamos cito-GCaMP3 utilizando anticorpos para GFP e também as fatias coradas com um marcador de astrócitos conhecido, S100β. Expressão cito-GCaMP3 foi encontrada apenas em células positivas S100β. Nenhuma expressão foi encontrada em neurónios visualizadas com NeuN (Figura 2A e 2B), sugerindo a expressão específica de astrócitos. É importante notar que a expressão cito-GCaMP3 foi detectada em ~ 60% de células positivas S100β (Fifigura 2C).
Os astrócitos responder a insultos cerebrais, como a lesão, isquemia e infecção por exibir mudanças que se tornaram conhecidas como astrócitos reatividade, o que representa um espectro de potenciais alterações de leve a grave 15. Buscou-se avaliar se a microinjeção vírus causou evidente reatividade dos astrócitos. Foi previamente mostrado que a redução dos níveis de glutamina sintetase (GS) de expressão foram associados com os astrócitos reactivos 16,17. Portanto, a expressão GS no estriado de WT e os ratinhos injectados foi comparada vírus. Não foram encontradas alterações significativas na expressão de GS em astrócitos do estriado após a injeção do vírus (Figura 3A - C), indicando que não há reatividade dos astrócitos ostensiva usando níveis GS como uma métrica. Esta abordagem geral pode ser expandida em trabalhos futuros para avaliar a reatividade dos astrócitos utilizando outros marcadores de reatividade. No entanto, note que os níveis de GFAP pode não ser uma forma adequada para medir a reatividade em striatastrócitos al, porque GFAP não é expresso a níveis detectáveis na maior parte dos astrócitos em condições basais do estriado 18. Em resumo, usando o IHC concluímos expressão cito-GCaMP3 era robusta e específica para astrócitos no striatum, e que a injecção de vírus não causam reactividade dos astrócitos, tal como avaliado por GS mudanças do nível de expressão.
Nós próxima preparado fatias de cérebro de camundongos injetados agudas virais a imagem [Ca2 +] i em astrócitos do estriado. Agudos 300 mm fatias coronais ou sagitais de espessura foram preparadas e, após um período de recuperação as fatias foram colocadas numa câmara de registo de um microscópio confocal de [Ca2 +] i usando imagiologia da linha 488 nm de um laser de Árgon. Astrócitos do estriado que expressam cito-GCaMP3 poderia ser facilmente identificado em mais (geralmente todas) das fatias do corpo estriado (~ 6-7 fatias por rato), como eles mostraram fluorescência verde visível nas células com a morfologia claramente espesso (Figura 4 Figura 4A; pelo menos 10 astrócitos exibindo cito-GCaMP3 poderia ser representada por imagem e são representados graficamente na Figura 4A como regiões de interesse (ROI). Maior ampliação de imagem com zoom digital adicional de 2,0-3,0 foi necessário identificar os astrócitos individuais (Figura 4B). Sob estas circunstâncias, territórios astrócitos inteiras foram revelados pela expressão cito-GCaMP3, como mostrado na Figura 4B. Espontâneos de Ca2 + sinais foram facilmente medida no somata bem como nos ramos e raminhos de astrócitos 6.
Figura 1: entrega Viral de GECIS (por exemplo, cito-GCaMP3) por AAV2 / 5 para o corpo estriado do rato adulto. A. esquemático ilustra o protocolo para AAV2 / 5 microinjections para o estriado dorsolateral.B. Mostra a posição aproximada da agulha de microinjecção em relação ao estriado e as coordenadas estereotáxicas utilizadas para injecções. A imagem de uma fatia Nissl manchada no painel B foi baixado Atlas Cerebral Allen.
Figura 2: Cyto-GCaMP3 expressão era específica para os astrócitos do estriado. A - B. imagens representativas que mostram que a expressão de cito-GCaMP3 colocalizes com um marcador para astrócitos (S100β) (B), mas não com um marcador para neurónios (NeuN) (A) C. gráfico de barras Resumo de experiências co-localização, como as mostradas. em A e B.
Figura 3: expressão Cyto-GCaMP3 dentro do estriado, os astrócitos não causou alterações na expressão de GS.A - B. imagens representativas de GCaMP3 e GS IHC de camundongos que receberam AAV2 / 5 para GCaMP3. Imagens para controle de camundongos não injetados são também mostrados. C. gráfico Bar resume os resultados de experimentos como os de A e B (ns indica não significativo pelo teste t de Student não pareado um, p <0,05).
Figura 4: Exemplos representativos de [Ca 2+] i sinais gravados a partir de astrócitos do estriado com cito-GCaMP3. Imagem z-stack mostrando 10 astrócitos (numeradas 1-10) A. A achatada .A traça abaixo mostram [Ca 2+] i sinais gravou mais de 5 min a partir das 10 células mostrado em um B. A achatado e zoom-in z. imagem -stack para um único astrocyte.The traça abaixo mostram [Ca 2+] isinais registada ao longo de 5 min para a célula única mostrado em B.
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Discussion
Os métodos aqui descritos nos permitiram expressar cito-GCaMP3 em astrócitos do estriado in vivo para posterior [Ca 2+] i imaging in situ. Este método apresenta vantagens em relação ao uso transgénica ou knock-em ratinhos, incluindo expressão robusta da proteína, rapidez e flexibilidade orientada de aplicação experimental e especificidade anatómica. A expressão de GCaMP3 usando AAV2 / 5, foi encontrada para ser mais específico e robusto. A combinação de GFAP GfaABC 1 D com promotor de AAV do serotipo 5 é crítica para conseguir a especificidade. Uma limitação da técnica aqui descrita é a infecção pelo vírus e procedimento de cirurgia pode causar reactividade dos astrócitos, especialmente com vírus de título elevado 19. É importante ressaltar que no estudo atual, AAV2 / 5 microinjeções com um baixo título relativo não causou decréscimos em GS que têm sido associados com astrócitos reatividade 19. Controles semelhantes foram relatados por Hippastrócitos ocampal 8. No entanto, é importante ressaltar a necessidade de esses controles para cada área do cérebro a ser estudado, até porque os astrócitos são heterogêneos 20, e porque eles provavelmente desempenham funções diferentes em regiões distintas do cérebro.
Um dos factores importantes que podem afectar a robustez da expressão do gene alvejado usando microinjecção vírus é as coordenadas em uso, que varia entre diferentes estirpes de murganhos e as mudanças ao longo do desenvolvimento dos animais. Apenas os ratinhos C57BL / 6 de ~ 8 semanas de idade foram utilizados ao longo deste estudo. Tem sido também mostrado que a expressão viral de GFP em neurónios do estriado e astrócitos em ratos podia ser detectada 4 dias após injecção, atingiu um patamar por 2 - 4 semanas após a injecção, e depois manteve-se estável durante 9 meses após a injecção 21. O curso do tempo da expressão cito-GCaMP3 não foi determinada com precisão aqui, mas pelo menos duas semanas para a expressão do vírus sãorecomendado.
A abordagem de utilizar AAV2 / 5 de expressão mediada Gecis em astrócitos do estriado, podem agora ser utilizados para compreender melhor astrócitos [Ca 2+] i sinalização do corpo estriado. Especificamente, o nível de expressão cito-GCaMP3 é suficientemente alta para permitir a imagem de [Ca 2+] i sinais em pequenas populações de astrócitos (~ 10 células) e dentro de todo o território dos astrócitos individuais. A análise detalhada de [Ca 2+] i sinais ainda está em curso, mas até à data [Ca 2+] i sinais de ter sido detectada a partir de processos distais, tanto quanto ~ 50 mm de distância da soma (Figura 4). Experimentos detalhados sobre astrócitos [Ca 2+] i sinais e suas funções correlatas e causais dentro do corpo estriado são viáveis. No futuro, as abordagens refinados (isto é, promotores) são necessários para entregar Gecis para populações definidas de astrócitos geneticamente de modo que se podeexplorar a sinalização de cálcio dentro de diversas populações de astrócitos 20.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A maior parte do trabalho e do pessoal envolvido foram apoiados pelo NIH conceder NS060677 e em parte pelo NIH concede MH099559 e MH104069 (a BSK). Alguns dos trabalhos também foi apoiado pela Fundação CHDI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
| pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | |
| syringe needle | BD | 305109 | |
| AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
| Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
| Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
| Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
| Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
| Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
| Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
| chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
| mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
| goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
| goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
| Mounting Medium | Vector | H-1000 |
References
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