Abstract
생리 전기장은 배아 발달, 신경 가지 상피 상처 치유에 세포의 이동을 지시하는 등 특정 생물학적 기능을 제공합니다. 시험 관내에서 배양 된 세포에 직류 전계를인가하여 세포의 이동 방향, 또는 galvanotaxis을 유도한다. 여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 주문 제작 된 폴리 (비닐 클로라이드) (PVC) 챔버, 유리 표면에, 백금 전극과 셀 묘화되는 동력 스테이지를 이용하여 수정된다. PVC 챔버 및 백금 전극은 낮은 세포 독성을 전시하고 저렴하고 다시 사용 가능한입니다. 유리 표면과 전동 현미경 스테이지는 이미지의 품질을 개선하고 세포에 유리 표면과 치료 가능한 수정을 허용한다. 우리는 두 가지 비 - 종양 형성, SV40-전립선 무한 증식 세포주, PRNS-1-1의 PNT2 galvanotaxis을 촬영. 이들 두 세포주는 유사한 이동 속도를 보여 모두를 향해 이동음극,하지만 그들은 galvanotaxis의 방향성의 다른 정도를 보여 않습니다. 이 프로토콜을 통해 얻어진 결과 PRNS-1-1 PNT2 세포주들은 지향성 응답 이동성을 관리 다른 고유 특성을 가질 수 있음을 시사한다.
Introduction
내인성 전기장 피부 1, 32, 33, 2와 같은 다양한 뇌 조직에서 검출된다. 생리 전계 신경 공정 5, 6의 생장을 유도하고 상피 각막 상처 봉합 1,7 촉진 지향, 배 발달 3,4- 포함한 특정 생물학적 기능을 제공. 시험관 내 배양 된 세포에 직류 전계인가 모방 생리 전기장을하고 방향 세포의 이동, 또는 galvanotaxis를 유도한다. Galvanotaxis는 neuroblasts 2, 신경 전구 세포 (14), 섬유 아세포 8, 물고기 각질 9, 인간 상피와 각막 각질 10-12 연구 13 림프구되었습니다. (-) 극인가 필드에 노출되는 경우, 세포 연구의 대부분은 방향성 cathodal 향해 이동한다. 그러나, 고도 등 여러 전이성 암세포인간의 유방암 세포와 인간 전립선 암 세포주 PC-3M이 anodal (+) 극 (15, 16)로 이동한다. 여러 메커니즘 galvanotaxis을 중재 또는 활성화를 포함하는 전기장을 감지하는 세포의 능력을 설명하기 위해 제안 EGF 12 수용체, 상피 나트륨 채널 (17)는 PI3K 및 PTEN (18), 및 칼슘의 방출이기구는 아직 완전히 이해되지. 15 (19) 이온 및 그것은 여러 신호 전달 경로가 galvanotaxis에 참여하는 것이 가능하다.
여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 점착성, 운동성 세포의 방향 이동을 특성화하기 위해, 하나 (18), (20).이 기법에서 수정 된 융합 세포의 시트를 개개의 세포 이동을 10, 12, 17 또는 이동을 모니터링하는 데 유용 펭과 제피 (21), 그리고 니시무라 등. 주문 제작, 명확한 PVC 챔버 10, 이동식 coversl와IPS와 같은 면역 형광 이미징 차 분석을위한 galvanotaxis, 후 쉽게 셀 검색을 허용. galvanotaxis 챔버의 유리 표면은 고배율과 형광 표지 된 세포와 촬영을 허용하는 광학 호환이다. 그것은 또한 표면 코팅 또는 전하 변경과 같은, 유리의 표면 개질과 실험 설계를 허용한다. 제 1 커버 글라스로 이루어지는 스페이서 위에 셀 전류 흐름을 최소화하기 위해 챔버에 사용된다; 따라서, 전류 흐름의 제곱에 비례 주울 가열, 실험 기간 동안 세포를 과열 않을 것이다. 한천 연결 교량 셀 전극의 직접 접촉을 방지하고 galvanotaxis 동안 매체의 pH 나 이온 농도의 변화를 방지한다.
두 개의 비 - 인간 종 양성 전립선 세포주는이 연구에서 galvanotaxis 그들의 응답을 조사 하였다. PRNS-1-1 22 PNT2 (23)는 모두 SV4 있습니다성장 인자 의존적 세포주는 전립선 특이 항원 (PSA)의 낮은 또는 전혀 식 5, 8, 18, 19 아세포 상피 마커를 발현하는, 0 - 불멸화. 두 세포주 정상 상피 세포의 다각형 형태를 유지하지만, 염색체 이상은 핵형 (22, 24)에서 관찰되었다. PRNS-1-1과 PNT2 대부분의 실험에서 유사한 행동을 공유하지만, 그들이 선포 구조의 형성과의 차이를 표시 할 galvanotaxis. 3-D 행렬에, 마트 리겔은 PRNS-1-1 세포는 정상적인 전립선 조직 (25)을 닮은 루멘 선포의 중공 구조를 형성한다. 그러나 PNT2 세포 내강 상피 (26) 또는 편광없이 고체 스페 로이드를 형성한다. PRNS-1-1 세포는 또한 현재 연구 PNT2보다 높은 galvanotactic 응답을 보여준다. 선포의 구조의 형성 및 galvanotaxis 간의 상관 관계는 PRNS-1-1 galvanotactic 신호 (PR)를 조직에서 역할을 할 수 있음을 시사ostate 선 조직 내생 전기장에 대응 움직임, 그리고이 두 세포주를 구별하기 위해 추가 특성을 제공한다.
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Protocol
1. 배양 전립선 세포
- 문화 PRNS-1-1 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % FBS와 항생제 - 안티 곰팡이로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 100mm 배양 접시에 PNT2 및 전립선 세포. 세포 galvanotaxis 실험에 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 배양 배지를 새로.
2. 조립 Galvanotaxis 챔버
- 하단 챔버 조립
- 2- 프로판올와 플라스틱 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 주사기와 챔버의 하부 측에 원형의 개구 주변 해양 급 실리콘 실러를 적용하고 큰 커브 글라스 (도 1)에 부착. 커버 글라스를 아래로 밀어 면봉으로 초과 접착제를 닦아면 주걱의 뒷면을 사용합니다. 원형 개구부는 중간 전류는 두 매질 내부 저장소 사이에 위치 된 세포 흐르게.
- 6mm × 2를 만들기 위해 작은 커버 글라스를 잘라다이아몬드 포인트 마커 5mm 스페이서.
- 챔버를 뒤집습니다. 주사기 및 / 또는 하단 유리에 2 원형 구멍 사이의 세포 부착을위한 10mm X 25mm 채널 표면을 만들 수있는 금속 주걱 실리콘 접착제의 2 줄무늬를 적용합니다. 이 원형 구멍 사이에 유리 스페이서 2 개를 붙인다. 스페이서를 아래로 밀어 면봉 및 / 또는 이쑤시개와 초과 접착제를 닦아면 어플리케이터의 뒷면을 사용합니다.
- 실리콘 접착제가 경화 될 때까지 24 시간 동안 챔버를 건조. 접착제에서 아세트산 잔기를 제거 증류수에 밤새 챔버를 담근다. 즉시 사용 가능한 챔버를 건조, 또는 깨끗한 용기에 나중에 사용하기 위해 챔버를 저장합니다.
그림 1 : 하단 galvanotaxis 챔버의 조립. A)가 큰 커브 글라스) T 세정 챔버. B의 하단에 부착된다유리 스페이서의 조각이 원형 구멍 사이에 접착되어 하시다 세포 부착을위한 10mm X 25mm 채널을 만들 수 있습니다.
- galvanotaxis 챔버에 세포를 심는
- 실험에 필요한 galvanotaxis 챔버의 필요 수를 준비합니다. 각 세포주 또는 치료는 하나의 galvanotaxis 챔버가 필요합니다. 2- 프로판올과 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 멸균 PBS의 3 배에 실을 세척하고 챔버에서 2 원형 구멍 사이의 액체 흐름을 확인합니다.
- 무균 세포 배양 접시에있는 챔버를 동봉하고 15 분 동안 37 ℃에서 평형 수 있습니다. 5 분 동안 37 ° C에서 5 ml의 0.25 % 트립신 EDTA를 사용하여 배양 접시에서 전립선 세포를 분리. PBS에 5 ㎖의 10 % FBS와 트립신 EDTA를 중화.
- 15 ㎖의 튜브에 세포를 옮기고 200 XG, 37 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포. 상등액을 대기음 배지 1 ㎖에 세포를 다시 일시.
- 20 μ를 타고셀 L의 용액은 카운팅 챔버에로드하고 세포 수를 산출한다. 문화 매체와 8 × 104 세포 / ㎖로 세포 농도를 조정합니다.
- 37 ° C 배양기에서 galvanotaxis 챔버를 가져 가라. 각 챔버에 세포 현탁액 350 μl를 시드.
- 킴 와이프 또는 습윤 5 % CO 2, 37 ℃에서 습도 인큐베이터 챔버에서 배양 접시에서 밤새 챔버에서 세포를 배양한다.
그림 2. 챔버에 세포를 시드 하부 측실을 건조 세정 A) 전립선 세포를 트립신 카운트 챔버로 이송하고, 밤새 인큐베이션 B) 상단 커버 글라스는 촬영 전에 챔버를 밀봉하도록 부착된다...
- 상단 챔버 ssembling
- 촬영하기 전에 상단 챔버를 조립합니다. 현미경은 한 번에 하나의 챔버 galvanotaxis 촬상 수용 할 수있다. 각 galvanotaxis 챔버, 37 ° C에서 배양 배지 10 ㎖ 워밍업. 37 ° C 온난화 판에 인큐베이터에서 galvanotaxis 챔버를 전송합니다.
- 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 문화 매체와 세포를 씻어. 챔버 내에서 매체의 400 μl를 남겨주세요. 모두 유리 스페이서의 상단에 높은 진공 그리스를 적용 할 주사기를 사용합니다.
- 챔버를 밀봉하는 작은 커버 글라스를 추가합니다. 부드럽게면 주걱의 뒷면에 커버 글라스를 누르십시오. 면봉과 초과 매체를 닦아냅니다.
- 유리 표면을 건조하고, 커버 글라스와 챔버 사이의 간격을 밀봉 높은 진공 그리스를 적용합니다. 그리스를 확산 금속 주걱을 사용합니다. 내부 저수지에 배지 4 ML을 추가하고 저수지 사이의 액체 흐름을 확인합니다.
- 한천 만들기다리
- 2 인치 길이의 PVC 튜브의 한 쌍을 잘라 (16분의 503 (내경) x 5/16 (외경) x 1/16 월), 플립과 100 비이커에 삽입합니다.
- 200mg의 박토 - 한천을 측정하고 2 % 한천 겔을 10 ml의 배지와 함께 50 ml의 플라스크에 추가한다. 30 초 동안 전자 레인지. 전송 피펫과 플라스틱 튜브에 한천 겔을로드합니다. 고형화 한천을 10 분 동안 실온에서 한천 교량 남기기.
- galvanotaxis 챔버의 외부 저수지에 2 ml의 배지를 추가합니다. 전류를 전도하기 위해 내부 및 외부 매체 저수지에 한천 다리를 삽입합니다.
그림 3 :. 챔버에 세포를 얇은 껍질이 그림은 galvanotaxis 챔버의 최종 조립을 보여합니다. 챔버는 완전히 고 진공 그리스로 밀봉된다. 중간 t을 추가오 저수지를 작성하고 두 한천 교량 챔버에 삽입됩니다. 이어서 galvanotaxis 챔버는 현미경 스테이지에 전달되고, 전극은 전기장을 적용하도록 부착된다. 조립 galvanotaxis 챔버의 측면도는 전류가 한천 교량과 커버 유리 사이의 공간을 통해 흐르고 셀 위에 함을 입증하기에 도시된다.
3. 시간 경과 영상
- 이전 영상에 공기 순환 2 시간에서 5 % CO 2와 37 ° C에 환경 챔버에 전환합니다.
- 현미경에 전환하고 이미지 획득 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 스테이지를 보정하고, 10 배 목표를 선택합니다.
- 현미경 무대에 galvanotaxis 챔버를 전송 테이프로 실을 확보하고 세포에 초점을 맞 춥니 다. 오른쪽에 음극과 외부 저수지에 galvanotaxis 전극을 삽입합니다. 와이어와 테이프로 전극을 고정합니다.
- 전력 보에 스위치X는 챔버에 전계를 적용한다. 25mm 긴 챔버 (100 MV / mm) 2.5 볼트에 도달 할 수 챔버에서 전압계와 출력 전압을 측정합니다. 출력 전류를 조절하여 실험 기간 동안 전계 강도를 유지한다.
- 열 시간 경과 영화를 생성하는 소프트웨어의 필름과 챔버에서 10 점을 선택합니다. 2 시간 동안 10 분 간격으로 인수 조건을 설정합니다.
- 촬영을 시작하고, 필요에 따라 출력 전류를 조정한다.
- 실험의 마지막 단계에서 챔버를 제거하고 95 % 알코올로 세포를 고정한다. 청소 면도날 열린 챔버 휴식하고 다시 사용하기.
Galvanotaxis 4. 정량화
- 시간 경과 영화와 다시의 방향 이미지의 상단에 음극을 돌립니다. 셀 추적 소프트웨어에 영화를 내 보냅니다.
- 수동으로 각 동영상 (도 4 A, B)에서 각각의 시간 지점에서 10-20 세포 (x, y)의 위치를 추적.남북 방향에 대하여 이주 거리 및 각도는, 전기장의 방향은 동일한, 셀 추적 소프트웨어 (도 4c)에서 산출한다.
주 : 평균 이동 속도가 총 이동 거리와 총 촬영 시간으로 변환됩니다. 방향성은 코사인 값 각도에서 변환된다. 세포가 임의의 방향성으로 마이그레이션하는 경우, 순 코사인의 평균은 제로에 가까운 것입니다. 세포가 음극쪽으로 이동하는 경우 직접, 코사인 값은 1이 될 것이다. 세포를 직접 애노드 측으로 이동하는 경우, 코사인 값은 -1이 될 것이다.
도 4 : 셀 추적 방향성을 측정하기 위해 세포 추적 이미지 라인) 오버레이.. 셀 (X, Y) 위치는 manua 아르에서야 시간 경과 영화에서 추적. . 세포는 임의로 이동하면 평균 코사인 제로에 가까운 B) 그러나, 세포가 음극 또는 양극을 향해 이동하는 경우, 평균 코사인 값 + (음극) 또는 부근 -. (양극) 1.0 C ) 방향성은 마이그레이션 각도 (θ)에서 변환 된 코사인 값에 의해 제공됩니다. 코사인 (θ)은 거리 B (전계의 방향에 투영 거리)까지의 거리 (이동 거리)의 비율과 같다.
- 측정 값을 저장합니다. 조합 된 결과를 계산하는 데이터베이스 어플리케이션에 데이터를 가져.
- 막대 그래프 (그림 5) 음모 스프레드 시트에 평균 이동 속도와 평균 코사인 값의 결합 된 데이터를 보냅니다.
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Representative Results
전립선 세포 (PRNS-1-1과 PNT2)의 두 라인은이 방법으로 조사 하였다. 두 줄의 셀은 2 시간 (도 5a)에 걸쳐 1.0 +/- 0.3 미크론 / 분의 속도로 이동 유사한. 그러나, 전계 지향성 PRNS-1-1 선 0.7 +/- 0.3 및 PNT2 라인 (도 5B) 0.2 +/- 0.8이다. 결과들은 상이한 위치 단서 지향성 응답이 발생할 다른 세포 시그널링 메커니즘을 가지고 있음을 시사 (100 세포 추적 하였다 p <0.01)이 두 세포주 galvanotaxis에서 상당한 차이를 나타낸다.
그림 5 : Galvanotaxis 전립선 세포의. 셀이 전기장에 노출 될 때, A) PRNS-1-1과 PNT2 라인 이주 속도와 유사하다.PNT2 라인 전계 낮은 방향성 (코사인 = 0.2)를 보였다 B)는 그러나 PRNS-1-1 선은 캐소드 (코사인 = 0.7)을 향해 높은 지향성을 나타내었다.
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Discussion
셀의 galvanotaxis 응답의 분석은 많은 셀룰러 이동성 또는 성장을위한 중요한 기능 표시기 (27), (28)를 처리했다. 여기서 우리는 두 전립선 세포주 영화를 유리 표면에 특별 주문품 실을 사용한다. 이들 세포주 galvanotaxis 상이한 정도를 보여, 우리는 세포 내 위치 파악 또는 galvanotaxis - 매개 단백질의 활성화는 galvanotaxis 응답의 관측 차이의 결과로, 불멸 세포주를 생성하는 과정을 방해 할 수 있음을 추측.
배양 접시 (27), (28)에서 만들어진 다른 galvanotaxis 챔버 설계에 비해 현재 디자인에 여러 가지 이점이있다. 먼저, 유리 표면은 이미징에 적합하며 세포 면역 염색 용 커버 글라스 galvanotaxis 후 검색 될 수있다. 본 연구에서 우리는 셀들의 그룹을 모니터링 10X 대물 렌즈의 사용을 저배율. 그러나, 살전와E 향상된 유리 광학, 그것을 형광 단백질 표지 세포를 셀 (17)의 리딩 에지에서 lamellipodial의 빠른 신축 추적하거나 추적, 60X 오일 목적으로 높은 배율에서 단일 셀 영화 할 수있다. 둘째, 유리 표면은 매트릭스 단백질 코팅 (10), (12) 또는 개질 된 미세 통로와 패터닝 될 수있다. 화학 치료도 29를 촬영하기 전에 세포를 치료이지 않도록 가능합니다. 매트릭스 코팅 여기서 사용 전립선 세포주에 필요하지 않고, 매트릭스 코팅은 세포 유형에 의존. 예를 들어, I 콜라겐 코팅은 인간 각질 세포 (30)의 galvanotaxis 필요하지만 라미닌 코팅은 인간의 신경 줄기 세포 (31)의 galvanotaxis 요구된다. 우리는 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌에 인간의 각질 세포 galvanotaxis을 테스트했다. 다른 기질 단백질은 세포의 이동 속도를 변경하지만 cathodal의 migrati를 변경하지 않은 galvanotaxis 29에. 셋째, 변성 백금 전극 전계에서 불활성이다. galvanotaxis 다른 방법 (27)에 사용 된 실버 전극에 비교하면, 그들은 분해하지 않거나 galvanotaxis에서 세포 독성을 감소 매체에 금속 이온을 방출. 넷째, 우리는 우리가 빠르게 또는 느리게하거나 세포의 이동을 모니터링하는 데 도움이 프레임 캡처의 간격을 변경할 수 있습니다. 전동 현미경은 하나의 챔버 내에서 서로 다른 영역에서 여러 영화를 취득 할 수있는 기회를 제공한다. 인가 전계가없는 대조 실험은 전계 세포의 이동성 속도를 변경할지 여부를 결정하는 것이 중요하다.
그러나, 현재 galvanotaxis 챔버 인해 저수지 매체의 작은 부피까지 4 시간 동안 촬영 세포 이동에 한정된다. 챔버 설계의 확대 버전으로, 시간의 긴 기간 동안 세포를 필름으로 가능할 것이다.
ve_content ">에있어서의 일부 잠재적 인 문제가 같습니다.들이 건조 된이되면 챔버 (400 μL) 중간의 매우 작은 부피가 있으므로 1) 세포를 챔버 조립체 동안 죽더라도, 그것은 공기 포착 방지하는 것이 중요 그 전에 기포 챔버 및 세포 세척 단계 동안 세포를 덮고 일부 액체로 유지한다. 2) 챔버는 챔버를 통과하는 전류를 감소시킬 것이다, 촬상 중에 누출 할 수있다. 상기 챔버 내의 액체 유동은주의 깊게 검사되어야 인가 현미경 스테이지보다 높은 진공 그리스로 전송했습니다. 3) 높은 진공 그리스가 촬영을 방해 할 수 얼룩이 경우. 유리 표면이 제거 그리스 95 % 알콜로 세정 할 수있다. 4) 스테이지 드리프트거나 재판부 변위 전동 현미경 스테이지 바이어스 수 방향성 이동의 측정. 따라서, 적절한 스테이지 홀더 및 라벨 테이프 galvanotaxis 챔버를 확보하는 것이 중요하다. ntent은 "> 전반적으로, galvanotaxis 방법은 우리가 더 유기체의 방향 마이그레이션을 이해하는 데 도움이 될 것입니다인가 전기장에 운동성 세포의 고유 방향성을 나타 내기 위해 유용합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
전립선 세포주 친절 암 센터, UC 데이비스 박사 링 - 유 왕 박사 싱 - 지엔 쿵에 의해 제공됩니다. 이 프로젝트는 NIH의 galvanotaxis 부여 4R33AI080604에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| pRNS-1-1 prostate cells | Lee, et al. (1994) | ||
| PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon, et al. (1995) |
| Medium and solutions | |||
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37 °C before use |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5 ml to 500 ml medium |
| 2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
| PBS | - | - | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C |
| Galvanotaxis device | |||
| Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs. | |
| Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
| Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
| Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
| Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
| Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
| Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| 6 ml syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
| Nichiryo Syringe, 1.5 ml | Nichiryo | SG-M | |
| Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
| Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
| Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
| Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Equipments and Software | |||
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
| Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
| Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20 μl cell solutions to count |
| Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C |
| Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
| Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
| Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
| Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
| Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
| Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
| FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
| Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft | ||
References
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