Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ved hjælp af brugerdefinerede designet Galvanotaxis Chambers at studere Directional Migration af prostata celler

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

Den fysiologiske elektriske felt tjener specifikke biologiske funktioner, såsom at lede cellemigration fosters udvikling neuronal udvækst og epithelial sårheling. Anvendelse af en jævnstrøm elektrisk felt til dyrkede celler in vitro inducerer retningsbestemt cellemigration eller galvanotaxis. Den 2-dimensional galvanotaxis metode viser vi her er modificeret med skræddersyede poly (vinylchlorid) (PVC) kamre, glasoverflade, platinelektroder og anvendelse af et motoriseret trin, hvor cellerne afbildes. PVC kamre og platin elektroder udviser lav cytotoksicitet og er overkommelige og re-brugbare. Glasset overflade og den motoriserede mikroskop stadium forbedre kvaliteten af ​​billeder og tillade eventuelle ændringer glasoverfladen og behandlinger til cellerne. Vi filmede galvanotaxis af to ikke-tumorigene, SV40-immortaliserede prostata cellelinjer, PRN-1-1 og PNT2. Disse to cellelinjer viser lignende hastigheder migration og begge migrere modkatoden, men de viser en anden grad af direktionalitet i galvanotaxis. Resultaterne opnået via denne protokol tyder på, at PRN-1-1 og PNT2 cellelinjer kan have forskellige iboende egenskaber, der styrer deres retningsbestemte vandrende svar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endogene elektriske felter påvises i forskellige væv, såsom hud 1, 32, 33 og hjerne 2. Den fysiologiske elektriske felt tjener specifikke biologiske funktioner, herunder at lede udvikling 3, 4 embryo, vejlede udvækst af neuronale processer 5, 6 og fremme epitel- og hornhinden sårlukning 1, 7. In vitro anvendelse af en jævnstrøm elektrisk felt til dyrkede celler efterligner den fysiologiske elektriske felt og inducerer retningsbestemt cellemigration eller galvanotaxis. Galvanotaxis er blevet undersøgt i fibroblaster 8, fisk keratinocytter 9, human epitel og hornhinden keratinocytter 10-12, lymfocytter 13, neuroblaster 2 og neuronale stamceller 14. Når de udsættes for det påførte felt, hovedparten af ​​undersøgte celler migrerer retningsbestemt mod katodisk (-) pol. Endnu flere cancerceller, herunder højt metastatiskhumane brystcancerceller og human prostatacancer-cellelinie PC-3M, flytte til anodisk pol (+) 15, 16. Der foreslås flere mekanismer til at mediere galvanotaxis eller at forklare cellernes evne til at afføle det elektriske felt, herunder aktivering af EGF-receptorer 12, epitel natriumkanal 17 PI3K og PTEN 18, og frigivelse af calciumioner 15, 19. Mekanismen er endnu ikke fuldt forstået og det er muligt at multiple signalveje er involveret i galvanotaxis.

Den 2-dimensional galvanotaxis metode viser vi her er nyttigt at karakterisere retningsbestemt vandring af vedhængende, motile celler, enten at overvåge individuelle cellemigrering 10, 12, 17 eller migrering af et ark af sammenflydende celler 18, 20. Denne teknik er modificeret fra Peng og Jaffe 21, og Nishimura et al. 10 med specialfremstillede, klar PVC kamre, med aftagelig coverslIPS giver mulighed for nem hentning cellen efter galvanotaxis til sekundær analyse, såsom immuno-fluorescens billeddannelse. Glasset overflade galvanotaxis kamre er optisk-kompatible, hvilket gør det muligt for optagelserne ved høj forstørrelse og med fluorescens-mærkede celler. Det giver også den eksperimentelle design med modifikation af glasoverfladen, såsom ændring af overfladebelægning eller afgifter. Afstandsstykker fremstillet af No. 1 dækglasset anvendes i kamrene for at minimere strømmen over cellerne; derfor Joule-opvarmning, som er proportional med kvadratet på strømmen, ikke ville overophede cellerne under eksperimentet. Forbindelsesorganerne agar broer forhindre direkte kontakt af elektroderne med cellerne og forhindrer ændring af mediets pH-værdi eller ionkoncentrationen i galvanotaxis.

To ikke-tumorigene humane prostata cellelinier blev undersøgt for deres galvanotaxis reaktion i denne undersøgelse. De PRN-1-1 22 og PNT2 23 er begge SV40-udødeliggjort, en vækstfaktor-afhængige cellelinier, der udtrykker de epiteliale markører cytokeratin 5, 8, 18 og 19 med lav eller ingen ekspression af prostataspecifikt antigen (PSA). Begge cellelinier opretholde den polygonale morfologi af normale epitelceller, men kromosom abnormitet blev observeret i karyotypebestemmelse 22, 24. Selv PRN-1-1 og PNT2 deler lignende adfærd i de fleste forsøg, de viser forskelle i dannelsen af acinære struktur og i galvanotaxis. På en 3-D matrix Matrigel de PRN-1-1 celler danner hule acinære strukturer med lumen ligner den normale prostata væv 25. Men PNT2 celler danner, massive kugler uden en lumen eller polariseret epitel 26. De PRN-1-1 celler også vise en højere galvanotactic respons end PNT2 i den aktuelle undersøgelse. Sammenhængen mellem dannelsen af ​​acinar struktur og galvanotaxis i PRN-1-1 antyder, at galvanotactic signaler kan spille en rolle i organiseringen af ​​prostate kirtel væv bevægelser som reaktion på endogene elektriske felter, og giver yderligere kendetegn til at skelne mellem disse 2 cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Dyrkning prostataceller

  1. Kultur PRN-1-1 og PNT2 prostataceller på 100 mm dyrkningsskåle i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C med 5% CO 2. Opdater dyrkningsmediet hver dag, indtil cellerne når 80% konfluens for galvanotaxis eksperimenter.

2. SAMLING Galvanotaxis Chambers

  1. Samling nederste kamre
    1. Tør en plastik galvanotaxis kammer med 2-propanol. Påfør marine grade silicium sealer omkring de cirkulære åbninger på undersiden af et kammer med en sprøjte og vedhæfte et stort dækglas (figur 1). Brug bagsiden af ​​en bomuld applikator til at skubbe ned dækglasset og tør den overskydende lim med vatpinde. De cirkulære åbninger tillader medium og elektrisk strøm at flyde over cellerne placeret mellem de to indvendige mellemstore reservoirer.
    2. Skær et lille dækglas at lave 6 mm x 25 mm afstandsstykker med en diamant point markør.
    3. Vend kammeret. Påfør 2 striber af silicium lim med en sprøjte og / eller en metalspatel for at skabe en 10 mm x 25 mm kanal overflade til cellevedhæftning mellem de 2 cirkulære åbninger på bunden glas. Lim 2 stykker glas spacer mellem de 2 cirkulære åbninger. Brug bagsiden af ​​bomuld applikatorer til at skubbe ned afstandsstykkerne og tør den overskydende lim med podninger og / eller tandstikkere bomuld.
    4. Tør kammer i 24 timer, indtil silicium lim hærdes. Soak kammeret i destilleret vand natten over for at fjerne eddikesyre rest fra limen. Tør kammeret til øjeblikkelig brug, eller opbevare kammeret til senere brug i en ren beholder.
      Figur 1
      Figur 1: Montering af bunden galvanotaxis kammer. A) En stor dækglasset er fastgjort til bunden af en ren kammer. B) Two stykker glas afstandsstykker er limet mellem de 2 cirkulære åbninger for at skabe en 10 mm x 25 mm kanal for celler at vedhæfte.
  2. Seeding celler på galvanotaxis kamre
    1. Forbered kræve antal galvanotaxis kamre er nødvendige for eksperimentet. Hver cellelinje eller behandling kræver en enkelt galvanotaxis kammer. Tør galvanotaxis kamre med 2-propanol. Vask kamrene med sterilt PBS 3 gange og kontrollere væskestrømmen mellem de 2 cirkulære åbninger i kamrene.
    2. Omslutte kamre i sterile cellekulturskåle og tillade dem at ækvilibrere ved 37 ° C i 15 min. Frigør prostata celler fra deres dyrkningsskål under anvendelse af 5 ml 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 minutter. Neutraliseres trypsin-EDTA med 5 ml 10% FBS i PBS.
    3. Overfør cellerne til 15 ml rør og centrifugeres cellerne i 5 minutter ved 200 xg, 37 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedium.
    4. Tag 20 μl celle løsning for at indlæse en tællekammer og beregne celleantal. Juster cellekoncentrationen til 8 x 10 4 celler / ml med dyrkningsmedium.
    5. Tag galvanotaxis kamre ud af 37 ° C inkubator. Frø 350 pi af cellesuspensionen på hvert kammer.
    6. Inkubér cellerne i kamrene natten over i dyrkningsskålen med vådt Kimwipe eller i et fugtigt kammer i inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO 2.

Figur 2
Figur 2:. Podning af celler til kammeret bundkammeret tørres og renses A) prostataceller er trypsiniseret, talt og overført til kammeret og inkuberet natten B) En top dækglasset er fastgjort til at forsegle kammeret før indspilningen...

  1. Assembling de øverste kamre
    1. Saml det øverste kammer før optagelserne. Mikroskopet kan kun rumme afbildning af et enkelt galvanotaxis kammer på én gang. Varm op 10 ml dyrkningsmedium ved 37 ° C for hver galvanotaxis kammer. Overfør en galvanotaxis kammer fra innovationsmiljøerne til en 37 ° C opvarmning plade.
    2. Skyl cellerne med dyrkningsmedium for at fjerne ubundne celler. Lad 400 pi medium i kammeret. Brug en sprøjte til at anvende højt vakuum fedt oven på begge glas afstandsstykker.
    3. Tilføj en lille dækglas for at forsegle kammeret. Tryk forsigtigt ned dækglasset med bagsiden af ​​en bomuld applikator. Tør overskydende medie med vatpinde.
    4. Tør glasoverfladen og anvende højvakuum fedt at tætne mellemrummet mellem dækglasset og kammeret. Brug en metalspatel for at sprede fedt. Tilsæt 4 ml af dyrkningsmediet til de indre reservoirer og kontrollere væskestrømningen mellem reservoirer.
  2. Gør agarbroer
    1. Skær et par 2 tommer lange PVC-rør (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), flip og indsætte dem i et 100 ml bægerglas.
    2. Mål 200 mg Bacto-agar og tilføje det i en 50 ml kolbe med 10 ml dyrkningsmedium til at gøre 2% agar-gel. Mikrobølgeovn til 30 sek. Læg Agar-gel til plastrør med en overførsel pipette. Lad agar broer ved stuetemperatur i 10 minutter for at størkne agaren.
    3. Tilsæt 2 ml dyrkningsmedium til de ydre reservoirer af galvanotaxis kammeret. Sæt agar broer til de indre og ydre medium reservoirer til at lede strøm.

Figur 3
Figur 3:. Filme cellerne på kammeret Et diagram for at demonstrere den endelige samling af galvanotaxis kammeret. Kammeret er helt forseglet med højvakuum fedt. Medium tilsat to fylde reservoirerne og to agar broer er indsat i kammeret. Derefter galvanotaxis kammer overføres til mikroskopbordet og elektroderne er fæstnet til at anvende det elektriske felt. Side-visning af den samlede galvanotaxis kammer er vist at vise, at den elektriske strøm strømmer over cellerne gennem agar broer og rummet mellem dækglasset.

3. Time-lapse Imaging

  1. Tænd for miljøkammeret til 37 ° C med 5% CO2 i den cirkulerende luft 2 timer før billeddannelse.
  2. Tænd mikroskopet og indlede billedet-erhvervelse software. Kalibrer mikroskopbordet og vælg 10X mål.
  3. Overfør galvanotaxis kamre til mikroskopbordet fastgøre kammeret med tape og fokusere på cellerne. Sæt galvanotaxis elektroder til de ydre reservoirer med katode på højre side. Fastgøre ledningen og elektroderne med tape.
  4. Tænd for strømmen box for at anvende et elektrisk felt til kammeret. Mål udgangsspændingen med voltmeter tværs af kammeret for at nå op på 2,5 volt for 25 mm lange kammer (100 mV / mm). Oprethold feltstyrken under eksperimentet ved at justere udgangsstrøm.
  5. Vælg 10 point på tværs af kammeret for at filme i softwaren til at generere ti time-lapse film. Opsæt erhvervelse betingelser ved 10-minutters intervaller i 2 timer.
  6. Start filme og justere udgangsstrømmen efter behov.
  7. Ved afslutningen af ​​forsøget fjernes kammeret fra scenen og fikseres cellerne med 95% alkohol. Bryde åbne kammeret med et barberblad til at rense og genbruge den.

4. Kvantificering af Galvanotaxis

  1. Drej time-lapse film og re-orientere katoden til toppen af ​​billederne. Eksporter film til cellen tracking software.
  2. Manuelt spore (x, y) position på 10-20 celler ved hvert tidspunkt fra hver film (figur 4 A, B).De migration afstande og vinkler i forhold til retningen nord-syd, den samme orientering af det elektriske felt, vil blive beregnet i cellen tracking software (figur 4C).
    BEMÆRK: Den gennemsnitlige migration hastighed er konverteret fra den samlede migration distance og total filme tid. Retningen er konverteret fra vinklerne til cosinus værdi. Hvis celler migrerer med tilfældig retningsbestemmelse, vil gennemsnittet af netto cosinus være tæt på nul. Hvis cellerne migrerer direkte mod katoden vil cosinus værdien være +1. Hvis cellerne migrerer direkte mod anoden, vil cosinus værdien være -1.

Figur 4
Figur 4: Cell sporing at måle retningsbestemmelse A) Overlay for sporing linjer med celle billeder.. (X, y) positioner af cellerne er manually spores i time-lapse film. . Hvis cellerne migrerer tilfældigt, den gennemsnitlige cosinus er tæt på nul B) Hvis cellerne migrerer mod katoden eller anoden, værdien af den gennemsnitlige cosinus er tæt på + (katode) eller -. (Anode) 1,0 C ) retningen præsenteres af cosinus værdi, der er konverteret fra migrationen vinkler (θ). Cosinus (θ) er lig med forholdet mellem afstanden a (migration afstand) til afstanden B (afstanden forventes at retningen af ​​det elektriske felt).

  1. Gem målingerne. Importere dataene til en database program til at beregne de kombinerede resultater.
  2. Eksporter de kombinerede data for gennemsnitlig migration hastighed og gennemsnitlig cosinus værdi til et regneark til at plotte søjlediagrammer (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

To linjer af prostata celler (PRN-1-1 og PNT2) blev undersøgt med denne metode. Celler i begge linjer migrere på lignende hastigheder på 1,0 +/- 0,3 mikron / min i løbet af 2 timer (figur 5A). Men retningen af det elektriske felt er 0,7 +/- 0,3 til PRN-1-1 linje og 0,2 +/- 0,8 i PNT2 linje (figur 5B). Resultaterne viser en signifikant forskel i galvanotaxis af disse to cellelinier (p <0,01, blev 100 celler spores), hvilket antyder, at de har forskellige cellulære signalveje mekanismer, der resulterer i forskellige retningsbestemte reaktioner på positionelle signaler.

Figur 5
Figur 5: Galvanotaxis af prostata celler. A) migrationen hastigheder på PRN-1-1 og PNT2 linjer er ens, når cellerne udsættes for det elektriske felt.B) Det PRN-1-1 linie viste en høj direktionalitet mod katode (cosinus = 0,7), mens PNT2 linje viste en lav retningsvirkning (cosinus = 0,2) i det elektriske felt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analysen af en celles galvanotaxis svar har været en vigtig funktionel indikator for mange cellulære vandrende eller vækst processer 27, 28. Her bruger vi en skræddersyet kammer med glasoverflade at filme to prostata cellelinjer. Disse cellelinier vist forskellige grader af galvanotaxis, og vi spekulere, at den intracellulære lokalisering eller aktiveringen af ​​galvanotaxis-medierende proteiner kan blive forstyrret under processen med at generere de udødelige cellelinjer, hvilket resulterer i den observerede forskel i galvanotaxis respons.

Sammenlignet med andre galvanotaxis chamber design lavet i dyrkningsskåle 27, 28, der er flere fordele for den nuværende udformning. Først glasoverfladen er egnet til billeddannelse og dækglasset med celler kan hentes efter galvanotaxis til immunfarvning. I denne undersøgelse anvendte vi en lav forstørrelse 10X formål at overvåge en gruppe af celler. Men med these forbedret optik, er det muligt at filme en enkelt celle ved højere forstørrelse med et 60X objektiv olie, til sporing af hurtig udvidelse og tilbagetrækning af lamellipodial på forkanten af cellerne 17, eller sporing af celler mærket med fluorescerende proteiner. For det andet kan glasoverfladen modificeres med matrix protein belægninger 10, 12 eller mønstret med mikrokanaler. Kemiske behandlinger er også muligt at præ- behandle celler, før optagelserne 29. Matrix belægning er ikke nødvendig for prostata cellelinjer, der anvendes her, og matricen belægning er celletype-afhængig. For eksempel er collagen I belægning er nødvendig for galvanotaxis af humane keratinocytter 30, men laminin belægning er nødvendig for galvanotaxis af humane neurale stamceller 31. Vi testede humane keratinocyt galvanotaxis på collagen I, collagen IV, fibronektin og laminin. Forskellige matrixproteiner ændret celle migration hastighed, men ikke ændre katodiske migrati indenfor galvanotaxis 29. For det tredje modificerede platinelektroder er inerte i det elektriske felt. Sammenlignet med sølvelektroderne som anvendes i andre galvanotaxis metoder 27, de ikke nedbrydes eller frigive metalioner til mediet, hvilket reducerer cytotoksicitet i galvanotaxis. For det fjerde kan vi ændre intervaller på ramme fanger, som hjælper os til at overvåge enten hurtigt eller langsomt celle migration. Den motoriserede mikroskop giver også mulighed for at erhverve flere film fra forskellige områder i et kammer. Et kontrolforsøg uden den anvendte elektriske felt er vigtig for at bestemme, om det elektriske felt ændrer vandrende hastighed af cellerne.

Men de nuværende galvanotaxis kamre begrænset til optagelserne cellemigration i op til 4 timer på grund af den lille mængde medium i reservoirerne. Med en forstørret version af kammeret design, vil det være muligt at filme celler i en længere periode.

ve_content "> Nogle potentielle problemer i fremgangsmåden omfatter: 1). cellerne dør i løbet af kammeret samling, hvis de bliver udtørret Da der er en meget lille mængde af mediet i kammeret (400 pi), er det vigtigt at undgå luftlommer bobler i kammeret og at holde noget væske, der dækker cellerne under cellen skylletrinnet. 2) Kammeret kan lække under billedbehandling, hvilket ville sænke strømmen passerer gennem kammeret. Væsken flow i kammeret skal nøje kontrolleres, inden det er overført til mikroskopbordet og mere højt vakuum fedt anvendes, hvis det er nødvendigt. 3) udtværet højvakuum fedt kan forstyrre optagelserne. Glasset overflade kan rengøres med 95% alkohol for at fjerne fedt. 4) Stage afdrift eller forskydning af kamrene på et motoriseret mikroskop stadium kunne bias målinger af retningsbestemt migration. Derfor er det vigtigt at sikre galvanotaxis kamre med trin holder passende og mærkning tape.

ntent "> Generelt galvanotaxis metode er anvendelig til at afsløre den indre retningsbestemmelse af motile celler i et elektrisk felt, som vil hjælpe os til yderligere at forstå den retningsbestemte migration i organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De prostata cellelinjer venligst stillet til rådighed af Dr. Ling-Yu Wang og Dr. Hsing-Jien Kung på Cancer Center, UC Davis. Dette projekt er støttet af NIH galvanotaxis tilskud 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Ved hjælp af brugerdefinerede designet Galvanotaxis Chambers at studere Directional Migration af prostata celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter