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Biology

Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

doi: 10.3791/51973 Published: December 7, 2014

Abstract

Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, telles que diriger la migration des cellules dans le développement embryonnaire, l'excroissance neuronale et la cicatrisation epitheliale. L'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées in vitro induit la migration des cellules directionnel, ou galvanotaxie. Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est modifiée avec sur mesure poly (chlorure de vinyle) (PVC) chambres, la surface de verre, des électrodes en platine et l'utilisation d'une platine motorisée à laquelle les cellules sont imagés. Les chambres de PVC et des électrodes de platine présentent une faible cytotoxicité et sont abordables et ré-utilisable. La surface du verre et la platine du microscope motorisée améliorer la qualité des images et permettent d'éventuelles modifications de la surface du verre et des traitements aux cellules. Nous avons filmé l'galvanotaxie de deux, les lignées cellulaires non-tumorigènes SV40 immortalisé la prostate, PRNS-1-1 et PNT2. Ces deux lignées cellulaires montrent des vitesses de migration à la fois similaires et migrent versla cathode, mais ils montrent un degré différent de directivité dans galvanotaxie. Les résultats obtenus par l'intermédiaire de ce protocole suggérer que les PRNS-1-1 et les lignées cellulaires PNT2 peuvent avoir des caractéristiques intrinsèques qui régissent leurs réponses migrateurs directionnelles.

Introduction

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Les champs électriques endogènes sont détectés dans divers tissus tels que la peau, 1, 32, 33 et deux cerveau. Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, y compris diriger le développement des embryons 3, 4, le guidage du prolongement de processus neuronaux 5, 6 et la promotion de l'épithélium et la cornée plaie fermeture 1, 7. In vitro, l'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées imite le champ électrique physiologique et induit la migration cellulaire directionnelle ou galvanotaxie. Galvanotaxie a été étudié dans des fibroblastes, des kératinocytes 8 9 de poisson, épithélial humain et les kératinocytes de la cornée 10 à 12, les lymphocytes 13, deux neuroblastes et les cellules progénitrices neuronales 14. Lorsqu'il est exposé au champ appliqué, la majorité des cellules étudiées migrer de manière directionnelle vers l'cathodique pôle (-). Cependant, plusieurs cellules cancéreuses, y compris hautement métastatiquecellules de cancer du sein humain et la lignée cellulaire de cancer de la prostate humain PC-3M, se déplacent vers le anodique pôle (+) 15, 16. Plusieurs mécanismes sont proposés à médiation galvanotaxie ou pour expliquer la capacité des cellules à détecter le champ électrique, y compris l'activation récepteurs de l'EGF 12, le canal sodique épithélial 17, PI3K et PTEN 18, et la libération des ions calcium 15, 19. Le mécanisme ne est pas encore entièrement compris et il est possible que de multiples voies de signalisation sont impliqués dans galvanotaxie.

Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est utile pour caractériser la migration directionnelle de adhérente, cellules mobiles, que ce soit pour surveiller la migration individuelle des cellules 10, 12, 17 ou la migration d'une feuille de cellules confluentes 18, 20. Cette technique est modifiée à partir de Peng et Jaffe 21 et Nishimura et al., avec 10 chambres de PVC transparent sur ​​mesure, avec coversl amovibleips permettant l'extraction de cellules facile après galvanotaxie pour analyse secondaire, telles que l'imagerie immuno-fluorescence. La surface de verre des chambres de galvanotaxie est optique compatible, ce qui permet le tournage à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. Il permet également la conception expérimentale avec modification de la surface du verre, par exemple modifier le revêtement ou la surface des charges. Entretoise en une lamelle n ° sont utilisés dans les chambres afin de minimiser le flux de courant dans les cellules; par conséquent, le chauffage par effet Joule, qui est proportionnelle au carré du flux de courant, ne serait pas surchauffer les cellules pendant l'expérience. Les ponts de liaison de gélose empêchent le contact direct des électrodes avec les cellules et empêchent le changement de pH du milieu ou de la concentration d'ions pendant galvanotaxie.

Deux lignes non-tumorigènes cellulaires prostate humaine ont été examinés pour leur réponse galvanotaxie dans cette étude. Les PRNS-1-1 22 et 23 sont à la fois PNT2 SV40 à immortalisation, les lignées cellulaires dépendantes de facteurs de croissance exprimant des marqueurs épithéliaux cytokératine 5, 8, 18 et 19 avec peu ou pas d'expression de l'antigène spécifique de la prostate (PSA). Les deux lignées cellulaires conservent la morphologie polygonale de cellules épithéliales normales, mais anomalie chromosomique a été observée dans le caryotype 22, 24. Bien que PRN-1-1 et PNT2 part des comportements similaires dans la plupart des expériences, elles montrent des différences dans la formation de la structure et dans acineuses galvanotaxie. Sur une matrice 3-D, Matrigel, les cellules PRN-1-1 former des structures creuses avec des lumières acineuses ressemblant à la glande prostatique normale 25 tissu. Cependant, les cellules forment des sphéroïdes solides PNT2 sans une lumière polarisée ou 26 épithélium. Les cellules PRN-1-1 démontrent également une réponse plus élevée que la galvanotactic PNT2 dans la présente étude. La corrélation entre la formation de la structure acinaire et galvanotaxie dans PRNS-1-1 suggère que les signaux galvanotactic peuvent jouer un rôle dans l'organisation de la prles mouvements des tissus de la glande ostate en réponse à des champs électriques endogènes et fournit d'autres caractéristiques de discriminer entre ces deux lignées cellulaires.

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Protocol

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1. Culture de cellules de la prostate

  1. Culture les PRNS-1-1 et PNT2 prostate cellules sur des boîtes de 100 mm de la culture dans un milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et antibiotiques antimycosique à 37 ° C avec 5% de CO 2. Actualiser le milieu de culture tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence pour les expériences de galvanotaxie.

2. Assemblage galvanotaxie Chambers

  1. Assemblage chambres inférieures
    1. Essuyer une chambre de galvanotaxie plastique avec du 2-propanol. Appliquer le scellant de silicium de qualité marine autour des ouvertures circulaires sur la face inférieure d'une chambre avec une seringue et attacher une grande lamelle (figure 1). Utilisez le côté arrière d'un applicateur de coton pour faire baisser la lamelle et essuyez l'excès de colle avec des cotons-tiges. Les ouvertures circulaires permettent au milieu et le courant électrique à se écouler sur les cellules se trouvant entre les deux réservoirs intérieurs moyennes.
    2. Couper une petite lamelle de faire 6 mm x 25 mm entretoises avec un marqueur de pointe de diamant.
    3. Retournez la chambre. Appliquer deux bandes de colle de silicium avec une seringue et / ou une spatule en métal pour créer une surface de canal de 25 mm x 10 mm pour la fixation des cellules entre les deux ouvertures circulaires sur la vitre inférieure. Coller deux morceaux de verre entretoise entre les deux ouvertures circulaires. Utilisez le côté arrière des applicateurs de coton pour faire baisser les entretoises et essuyez l'excès de colle avec des tampons et / ou des cure-dents coton.
    4. Séchez la chambre pendant 24 heures jusqu'à ce que la colle de silicium est guéri. Faire tremper pendant une nuit dans la chambre de l'eau distillée pour éliminer le résidu de l'acide acétique à partir de la colle. Séchez la chambre pour une utilisation immédiate, ou de stocker la chambre pour une utilisation ultérieure dans un récipient propre.
      Figure 1
      Figure 1: Assemblée de la chambre du fond. A) Une grande lamelle est fixé sur le fond d'une chambre propre. B) TDeux morceaux de cales de verre sont collées entre les deux ouvertures circulaires pour créer un canal x 25 mm 10 mm pour cellules de se fixer.
  2. Ensemencement de cellules sur les chambres à galvanotaxie
    1. Préparer le nombre de chambres de nécessiter galvanotaxie nécessaires pour l'expérience. Chaque ligne ou cellule de traitement nécessite une chambre de galvanotaxie unique. Essuyer les chambres de galvanotaxie avec du 2-propanol. Laver les chambres stériles avec PBS trois fois et vérifier l'écoulement de liquide entre les deux ouvertures circulaires dans les chambres.
    2. Joindre les chambres dans des boîtes de culture de cellules stériles et les laisser se équilibrer à 37 ° C pendant 15 min. Détacher les cellules de la prostate à partir de leur boîte de culture de 5 ml en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 ml de 10% de FBS dans du PBS.
    3. Transférer les cellules pour tubes de 15 ml et centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g, 37 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
    4. Prenez 20 μl de solution de cellule de charge à une chambre de comptage et calculer le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 8 x 10 4 cellules / ml avec du milieu de culture.
    5. Prenez les chambres de galvanotaxie de la 37 ° C incubateur. Ensemencer 350 ul de la suspension cellulaire sur chaque chambre.
    6. Incuber les cellules pendant une nuit dans les chambres dans la boîte de culture avec Kimwipe ou humide dans une chambre d'humidité à l'étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2.

Figure 2
Figure 2:. Ensemencement des cellules à la chambre La chambre inférieure est séché et nettoyé cellules A) de la prostate sont trypsinisées, comptées et transférés dans la chambre et incubées pendant une nuit B) Une lamelle supérieure est fixée à étanchéité de la chambre avant le tournage...

  1. Unssembling les meilleurs chambres
    1. Assemblez la chambre supérieure avant le tournage. Le microscope ne peut accueillir l'imagerie d'une chambre de galvanotaxie seul à la fois. Réchauffez-vous 10 ml de milieu de culture à 37 ° C pour chaque chambre de galvanotaxie. Transférer une chambre de galvanotaxie des incubateurs à une plaque C de réchauffement de 37 °.
    2. Rincer les cellules avec un milieu de culture pour éliminer les cellules seules. Donner 400 pi de milieu dans la chambre. Utilisez une seringue pour appliquer de la graisse à vide élevé au-dessus de deux cales de verre.
    3. Ajouter une petite lamelle pour sceller la chambre. Appuyez doucement la lamelle avec le côté arrière d'un applicateur de coton. Essuyez l'excès du milieu avec des cotons-tiges.
    4. Séchez la surface de verre et appliquer de la graisse à vide élevé pour sceller l'écart entre la lamelle et la chambre. Utiliser une spatule en métal pour répartir la graisse. Ajouter 4 ml du milieu de culture pour les réservoirs intérieurs et vérifier l'écoulement de liquide entre les réservoirs.
  2. Assurez-agarponts
    1. Couper une paire de long tuyau de PVC de 2 pouces (503/16 ID x 5/16 x 1/16 OD mur), flip et les insérer dans un bécher de 100 ml.
    2. Mesurer 200 mg de Bacto-Agar et l'ajouter à un ballon de 50 ml avec 10 ml de milieu de culture pour faire gel d'agar à 2%. Micro-ondes pendant 30 secondes. Chargez le gel d'agar à la tubulure en plastique avec une pipette de transfert. Laissez les ponts de gélose à la température ambiante pendant 10 minutes pour solidifier la gélose.
    3. Ajouter 2 ml de milieu de culture dans les réservoirs extérieurs de la chambre de galvanotaxie. Insérer les ponts de gélose au milieu des réservoirs intérieur et extérieur pour conduire le courant.

Figure 3
Figure 3:. Lieux les cellules de la chambre de mettre en évidence un schéma de l'assemblage final de la chambre de galvanotaxie. La chambre est complètement scellé avec de la graisse à vide élevé. Medium est t ajoutéo remplir les réservoirs, et deux ponts d'agar sont insérés dans la chambre. Ensuite, la chambre de galvanotaxie est transféré vers la platine du microscope et les électrodes sont fixées à appliquer le champ électrique. Vue latérale de la chambre de galvanotaxie assemblé est illustré pour démontrer que le courant électrique circule dans les cellules à travers les ponts de gélose et l'espace entre le verre de protection.

3. imagerie time-lapse

  1. Mettre en marche l'enceinte climatique à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans l'air circulant deux heures avant l'imagerie.
  2. Allumez le microscope et lancer le logiciel d'image-acquisition. Calibrer la platine du microscope et sélectionnez l'objectif 10X.
  3. Transférez les chambres de galvanotaxie à la platine du microscope, sécuriser la chambre avec du ruban adhésif et de se concentrer sur les cellules. Insérer les électrodes du galvanotaxie aux réservoirs extérieurs à cathode sur le côté droit. Fixez le fil et les électrodes avec du ruban adhésif.
  4. Allumez le bo de puissancex pour appliquer un champ électrique dans la chambre. Mesurer la tension de sortie avec le voltmètre à travers la chambre pour atteindre 2,5 volt pour la longue chambre 25 mm (100 mV / mm). Maintenir l'intensité du champ au cours de l'expérience en ajustant le courant de sortie.
  5. Sélectionnez 10 points à travers la chambre de filmer dans le logiciel pour générer des dix films time-lapse. Mettre en place les conditions d'acquisition à intervalles de 10 min pendant 2 heures.
  6. Commencer à filmer et ajuster le courant de sortie en fonction des besoins.
  7. A la fin de l'expérience, retirer la chambre de la scène et fixer les cellules avec 95% d'alcool. Casser la chambre avec une lame de rasoir pour nettoyer et re-utiliser.

4. Quantification des galvanotaxie

  1. Faites tourner les films de time-lapse et réorienter la cathode vers le haut des images. Exporter les films sur le logiciel de suivi de la cellule.
  2. Suivre manuellement le (x, y) de 10 à 20 cellules à chaque point de temps de chaque film (Figure 4 A, B).Les distances de migration et les angles par rapport à la direction nord-sud, la même orientation du champ électrique, seront calculées dans le logiciel de suivi de la cellule (figure 4C).
    NOTE: La vitesse moyenne de migration est converti de la distance de migration totale et le temps de tournage totale. La directivité est converti à partir des angles par rapport à la valeur du cosinus. Si les cellules migrent avec directivité aléatoire, la moyenne des cosinus net sera proche de zéro. Si les cellules migrent directement vers la cathode, la valeur de cosinus sera une. Si les cellules migrer directement vers l'anode, la valeur de cosinus sera -1.

Figure 4
Figure 4: Suivi de la cellule à mesurer directivité A) Superposition des lignes de repérage des images de cellules.. Les positions (x, y) des cellules sont manually suivis dans les films time-lapse. . Si les cellules migrent de façon aléatoire, le cosinus moyen est proche de zéro B) Cependant, si les cellules migrent vers la cathode ou l'anode, la valeur du cosinus est proche de la moyenne + (cathode) ou -. (Anode) 1,0 C ) La directivité est présenté par la valeur du cosinus, qui est converti à partir des angles de migration (θ). Le cosinus (θ) est égal au rapport de la distance a (la distance de migration) à distance b (la distance projetée à la direction du champ électrique).

  1. Sauvegardez les mesures. Importez les données à une application de base de données pour calculer les résultats combinés.
  2. Exporter les données combinées de vitesse de migration moyen et la valeur moyenne du cosinus à une feuille de calcul pour tracer les graphiques à barres (figure 5).

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Representative Results

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Deux lignes de cellules de la prostate (PRN-1-1 et PNT2) ont été étudiés avec cette méthode. Les cellules dans les deux lignes migrent à des vitesses similaires de 1,0 +/- 0,3 microns / min au cours de 2 heures (figure 5A). Cependant, la directivité du champ électrique est de 0,7 +/- 0,3-PRN pour la ligne 1-1, et 0,2 +/- 0,8 pour la ligne de PNT2 (figure 5B). Les résultats montrent une différence significative dans la galvanotaxie de ces deux lignées cellulaires (p <0,01, les cellules 100 ont été suivis), ce qui suggère qu'ils ont différents mécanismes de signalisation cellulaire qui entraînent des réponses directionnelles à différents indices de position.

Figure 5
Figure 5: galvanotaxie de cellules de la prostate. A) Les vitesses de migration des PRN-1-1 et les lignes PNT2 sont similaires lorsque les cellules sont exposées au champ électrique.B) Cependant, la ligne PRN-1.1 a montré une haute directivité vers la cathode (cosinus = 0,7), tandis que la ligne de PNT2 a montré une faible directivité (cosinus = 0,2) dans le champ électrique.

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Discussion

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L'analyse de la réponse d'une cellule de galvanotaxie a été un indicateur fonctionnel important pour un grand nombre de migration cellulaire ou la croissance des processus 27, 28. Ici, nous utilisons une chambre sur mesure avec la surface de verre à film à deux lignées de cellules de la prostate. Ces lignées cellulaires ont démontré des degrés différents de galvanotaxie, et nous avons spéculé que la localisation intracellulaire ou l'activation des protéines de galvanotaxie-médiation pourraient interférer au cours du processus de génération des lignées de cellules immortelles, ce qui entraîne la différence observée dans la réponse de galvanotaxie.

Comparé à d'autres types de chambre galvanotaxie faites dans des boîtes de culture 27, 28, il ya plusieurs avantages à la conception actuelle. Tout d'abord, la surface du verre est convenable pour l'imagerie et le couvre-objet avec des cellules peut être récupérée après galvanotaxie pour immunocoloration. Dans cette étude, nous avons utilisé un faible grossissement de l'objectif 10X pour surveiller un groupe de cellules. Cependant, avec these meilleure verre optique, il est possible de filmer une seule cellule à plus fort grossissement avec un objectif d'huile 60X, pour suivre la rapide extension et la rétraction de lamellipodial à la pointe des cellules 17, ou de suivi cellules marquées avec des protéines fluorescentes. Deuxièmement, la surface du verre peut être modifiée avec des revêtements de protéines de matrice 10, 12 ou motif de micro-canaux. Les traitements chimiques sont également possible afin d'traiter les cellules avant de filmer 29. revêtement de la matrice ne est pas nécessaire pour les lignées cellulaires de la prostate utilisés ici, et le revêtement de la matrice dépend du type de cellule. Par exemple, le collagène I revêtement est requise pour l'galvanotaxie des kératinocytes humains 30, mais revêtement de laminine est requise pour l'galvanotaxie de cellules souches 31 neurales humaines. Nous avons testé galvanotaxie de kératinocytes humains sur le collagène I, le collagène IV, la fibronectine, la laminine et. Protéines de la matrice différents modifiés vitesse de migration de cellules, mais ne ont pas changé les migrati de cathodiques dans galvanotaxie 29. En troisième lieu, les électrodes de platine modifiés sont inertes dans le champ électrique. Par rapport aux électrodes d'argent tel qu'il est utilisé dans d'autres modes de galvanotaxie 27, ils ne se décomposent pas ou libèrent des ions métalliques dans le milieu, ce qui réduit la cytotoxicité dans galvanotaxie. Quatrièmement, nous pouvons modifier les intervalles de capture d'image, ce qui nous permet de suivre la migration des cellules soit rapide ou lent. Le microscope motorisé offre également la possibilité d'acquérir plusieurs films de différents domaines dans une chambre. Une expérience témoin sans champ électrique appliqué est important pour déterminer si le champ électrique modifie la vitesse de migration des cellules.

Cependant, les chambres de galvanotaxie actuelles sont limitées à la migration des cellules de prise de vue pour un maximum de 4 heures en raison du faible volume de milieu dans les réservoirs. Avec une version agrandie de la conception de la chambre, il serait possible de filmer les cellules pendant une période de temps plus longue.

ve_content "> Certains problèmes potentiels dans la méthode sont les suivants:. 1), les cellules pourraient mourir au cours de l'ensemble de chambre se ils deviennent desséchée Depuis il ya un très petit volume de milieu dans la chambre (400 pi), il est important d'éviter d'emprisonner l'air bulles dans la chambre et à garder un peu de liquide couvrant les cellules lors de l'étape de rinçage de la cellule. 2) La chambre pourrait fuir lors de l'imagerie, ce qui diminuerait le courant passant à travers la chambre. L'écoulement de liquide dans la chambre doivent être soigneusement vérifiés avant qu'il ne soit transféré à la platine du microscope et de graisse plus élevé de dépression appliquée si nécessaire. 3) ont coulé graisse haute vide peut interférer avec le tournage. La surface du verre peut être nettoyé avec 95% d'alcool pour enlever la graisse. 4) dérive de scène ou tout déplacement des chambres sur une platine de microscope motorisé pourrait fausser les mesures de la migration directionnelle. Par conséquent, il est important de sécuriser les chambres de galvanotaxie avec support de scène adéquate et la bande d'étiquetage.

MÉNAGEMENT "> Dans l'ensemble, la méthode de galvanotaxie est utile pour révéler la directivité intrinsèque des cellules mobiles dans un champ électrique appliquée, qui nous aidera à mieux comprendre la migration directionnelle dans les organismes.

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Acknowledgments

Les lignées de cellules de la prostate sont aimablement fournies par le Dr Ling-Yu Wang et le Dr Kung Hsing-Jien au Cancer Center, UC Davis. Ce projet est soutenu par le NIH galvanotaxie subvention 4R33AI080604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0 FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2, (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14, (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166, (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114, (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431, (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6, (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226, (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12, (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23, (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109, (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70, (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112, (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227, (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67, (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7, (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126, (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119, (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53, (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4, (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6, (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30, (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67, (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85, (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118, (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106, (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30, (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).
Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate
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Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

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