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Biology

प्रोस्टेट कोशिकाओं की दिशात्मक प्रवास का अध्ययन करने के लिए कस्टम डिजाइन Galvanotaxis मंडलों का उपयोग

Published: December 7, 2014 doi: 10.3791/51973
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Dermatology, Scool of Medicine, University of California, Davis

Abstract

शारीरिक बिजली के क्षेत्र में इस तरह के भ्रूण के विकास, न्यूरोनल परिणाम और उपकला घाव भरने में सेल प्रवास के निर्देशन के रूप में विशिष्ट जैविक कार्यों, कार्य करता है। इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक सीधा मौजूदा बिजली के क्षेत्र लागू दिशात्मक सेल प्रवास, या galvanotaxis लाती है। हम यहाँ का प्रदर्शन दो आयामी galvanotaxis विधि कस्टम बनाया पाली (विनाइल क्लोराइड) (पीवीसी) कक्षों, कांच की सतह, प्लैटिनम इलेक्ट्रोड और कोशिकाओं imaged हैं, जिस पर एक मोटर चालित मंच के उपयोग के साथ संशोधित किया गया है। पीवीसी कक्षों और प्लैटिनम इलेक्ट्रोड कम cytotoxicity प्रदर्शन और सस्ती और पुनः useable रहे हैं। कांच की सतह और motorized खुर्दबीन मंच छवियों की गुणवत्ता में सुधार करने और कोशिकाओं के लिए कांच की सतह और उपचार के लिए संभव संशोधनों अनुमति देते हैं। हम दो गैर tumorigenic, SV40-अमर प्रोस्टेट सेल लाइनों, pRNS-1-1 और PNT2 की galvanotaxis फिल्माया। इन दो सेल लाइनों समान प्रवास गति दिखाने के लिए और दोनों ओर की ओर पलायनकैथोड, लेकिन वे galvanotaxis में दिशात्मकता की एक अलग डिग्री दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त परिणामों pRNS-1-1 और PNT2 सेल लाइनों उनके दिशात्मक प्रवासी प्रतिक्रियाओं है कि सरकार विभिन्न आंतरिक सुविधाओं हो सकता है कि सलाह देते हैं।

Introduction

अंतर्जात बिजली क्षेत्र में इस तरह के त्वचा 1, 32, 33 और मस्तिष्क के रूप में 2 विभिन्न ऊतकों में पाया जाता है। शारीरिक बिजली के क्षेत्र neuronal प्रक्रियाओं 5, 6 का परिणाम मार्गदर्शक और उपकला और corneal घाव बंद 1, 7 को बढ़ावा देने, निर्देशन भ्रूण विकास के 3, 4 सहित विशिष्ट जैविक कार्यों, कार्य करता है। इन विट्रो, संवर्धित कोशिकाओं के लिए एक सीधा मौजूदा बिजली क्षेत्र के आवेदन mimics शारीरिक बिजली के क्षेत्र और दिशात्मक सेल प्रवास, या galvanotaxis लाती है। Galvanotaxis, neuroblasts 2, और neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं 14, fibroblasts के 8, मछली केरेटिनकोशिकाओं 9, मानव उपकला और कॉर्निया केरेटिनकोशिकाओं 10-12 में अध्ययन 13 लिम्फोसाइटों किया गया है। (-) ध्रुव एप्लाइड क्षेत्र के संपर्क में, अध्ययन कोशिकाओं के बहुमत cathodal की ओर directionally ओर पलायन। फिर भी, अत्यधिक मेटास्टैटिक सहित कई कैंसर की कोशिकाओं को,मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं और मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन पीसी-3M, anodal (+) ध्रुव 15, 16 के लिए कदम। कई तंत्र galvanotaxis मध्यस्थता करने के लिए या सक्रियण सहित बिजली के क्षेत्र भावना के लिए कोशिकाओं की क्षमता, समझाने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं EGF 12 रिसेप्टर्स की, उपकला सोडियम चैनल 17, PI3K और PTEN 18, और कैल्शियम की रिहाई तंत्र अभी तक पूरी तरह समझ नहीं है। 15, 19 आयनों और यह कई संकेत दे रास्ते galvanotaxis में शामिल कर रहे हैं कि संभव है।

हम यहाँ का प्रदर्शन दो आयामी galvanotaxis विधि पक्षपाती, गतिशील कोशिकाओं की दिशात्मक प्रवास चिह्नित करने के लिए, या तो 18, 20। इस तकनीक से संशोधित किया गया है मिला हुआ कोशिकाओं के एक पत्रक के अलग-अलग सेल प्रवास 10, 12, 17 या प्रवास पर नजर रखने के लिए उपयोगी है पेंग और जैफ्फ 21, और Nishimura एट अल। कस्टम बनाया, स्पष्ट पीवीसी कक्षों के साथ 10, हटाने योग्य coversl साथआईपीएस ऐसे इम्युनो-प्रतिदीप्ति इमेजिंग के रूप में माध्यमिक विश्लेषण के लिए galvanotaxis, के बाद आसान सेल पुनः प्राप्ति के लिए अनुमति देता है। galvanotaxis कक्षों की कांच की सतह उच्च बढ़ाई और fluorescently लेबल कोशिकाओं के साथ फिल्माने की अनुमति देता है, जो ऑप्टिकल-संगत है। यह भी ऐसी सतह कोटिंग या प्रभार बदलने के रूप में, कांच की सतह के संशोधन के साथ प्रयोगात्मक डिजाइन की अनुमति देता है। नंबर 1 coverglass के बने spacers कोशिकाओं पर वर्तमान प्रवाह को कम करने के कक्षों में उपयोग किया जाता है; इसलिए वर्तमान प्रवाह के वर्ग के समानुपाती होता है जो जौल हीटिंग, प्रयोग के दौरान कोशिकाओं से ज़्यादा गरम नहीं होता। जोड़ने अगर पुलों कोशिकाओं के साथ इलेक्ट्रोड के सीधे संपर्क को रोकने और galvanotaxis दौरान मध्यम पीएच या आयन एकाग्रता के परिवर्तन को रोकने के।

दो गैर tumorigenic मानव प्रोस्टेट सेल लाइनों इस अध्ययन में उनके galvanotaxis प्रतिक्रिया के लिए जांच की गई। pRNS-1-1 22 और PNT2 23 दोनों SV4 हैंवृद्धि कारक पर निर्भर सेल लाइनों प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) के कम या कोई अभिव्यक्ति के साथ 5, 8, 18 और 19 cytokeratin उपकला मार्करों व्यक्त 0-अमर। दोनों सेल लाइनों सामान्य उपकला कोशिकाओं के बहुभुज आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए, लेकिन गुणसूत्र असामान्यता karyotyping 22, 24 में मनाया गया। PRNS-1-1 और PNT2 सबसे प्रयोगों में इसी तरह के व्यवहार का हिस्सा है, वे कोष्ठकी संरचना के गठन में और में मतभेद दिखा कर galvanotaxis। एक 3 डी मैट्रिक्स पर, Matrigel, pRNS-1-1 कोशिकाओं सामान्य प्रोस्टेट ग्रंथि ऊतक 25 जैसी lumens के साथ खोखले कोष्ठकी संरचनाओं के रूप में। हालांकि, PNT2 कोशिकाओं को एक लुमेन या ध्रुवीकृत उपकला 26 बिना ठोस spheroids के रूप में। pRNS-1-1 कोशिकाओं को भी वर्तमान अध्ययन में PNT2 तुलना में एक उच्च galvanotactic प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है। में कोष्ठकी संरचना के गठन और galvanotaxis के बीच संबंध pRNS-1-1 galvanotactic संकेतों जनसंपर्क के आयोजन में एक भूमिका निभा सकते हैं कि पता चलता हैostate ग्रंथि ऊतक अंतर्जात बिजली क्षेत्र के जवाब में आंदोलनों, और इन दो सेल लाइनों के बीच विभेद करने के लिए आगे विशेषताओं प्रदान करता है।

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Protocol

1. संवर्धन प्रोस्टेट कोशिकाओं

  1. संस्कृति pRNS-1-1 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS और एंटीबायोटिक antimycotic के साथ पूरक 1640 RPMI माध्यम में 100 मिमी संस्कृति व्यंजन पर और PNT2 प्रोस्टेट कोशिकाओं। कोशिकाओं galvanotaxis प्रयोगों के लिए 80% confluency तक हर दिन संस्कृति के माध्यम ताज़ा करें।

2. कोडांतरण Galvanotaxis मंडलों

  1. नीचे कक्षों कोडांतरण
    1. 2-propanol के साथ एक प्लास्टिक galvanotaxis चैम्बर साफ कर लें। एक सिरिंज के साथ एक कक्ष के नीचे की ओर परिपत्र के उद्घाटन के आसपास समुद्री ग्रेड सिलिकॉन मुहर लागू करते हैं और एक बड़े coverglass (चित्रा 1) देते हैं। Coverglass नीचे धक्का और कपास swabs के साथ अतिरिक्त गोंद बंद पोंछने के लिए एक कपास applicator के के पीछे की ओर का प्रयोग करें। परिपत्र के उद्घाटन के मध्यम और विद्युत प्रवाह दो भीतरी मध्यम जलाशयों के बीच स्थित कोशिकाओं से अधिक प्रवाह करने की अनुमति देते हैं।
    2. 6 मिमी x 2 बनाने के लिए एक छोटा सा coverglass कटएक हीरे बिंदु मार्कर के साथ 5 मिमी spacers के।
    3. चैम्बर फ्लिप। एक सिरिंज और / या नीचे कांच पर दो परिपत्र के उद्घाटन के बीच सेल लगाव के लिए एक 10 मिमी x 25 मिमी चैनल सतह बनाने के लिए एक धातु रंग के साथ सिलिकॉन गोंद की दो पट्टियों को लागू करें। 2 परिपत्र के उद्घाटन के बीच कांच स्पेसर के दो टुकड़े गोंद। Spacers के नीचे धक्का और कपास swabs और / या toothpicks के साथ अतिरिक्त गोंद बंद पोंछने के लिए कपास applicators के पीछे की ओर का प्रयोग करें।
    4. सिलिकॉन गोंद ठीक हो जाता है जब तक 24 घंटे के लिए चैम्बर सूखी। गोंद से एसिटिक एसिड अवशेषों को हटाने के लिए आसुत जल रात भर में चैम्बर भिगोएँ। तत्काल उपयोग के लिए चैम्बर सूखा, या एक साफ कंटेनर में बाद में उपयोग के लिए चैम्बर की दुकान।
      चित्रा 1
      चित्रा 1: नीचे galvanotaxis चैंबर के विधानसभा। ए) एक बड़े coverglass) टी एक साफ चैम्बर। बी के नीचे से जुड़ा हुआ हैकांच spacers के टुकड़े दो परिपत्र के उद्घाटन के बीच चिपका रहे हैं wo के कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए एक 10 मिमी x 25 मिमी चैनल बनाने के लिए।
  2. Galvanotaxis कक्षों पर कोशिकाओं सीडिंग
    1. प्रयोग के लिए आवश्यक galvanotaxis कक्षों की आवश्यकता होती संख्या को तैयार है। प्रत्येक कोशिका लाइन या इलाज के लिए एक एकल galvanotaxis चैम्बर की आवश्यकता है। 2-propanol साथ galvanotaxis कक्षों साफ कर लें। बाँझ पीबीएस 3 बार के साथ कक्षों धो लें और कक्षों में दो परिपत्र के उद्घाटन के बीच तरल के प्रवाह की जाँच करें।
    2. बाँझ सेल संस्कृति बर्तन में कक्षों लगा देना और उन्हें 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने की अनुमति देते हैं। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर 0.25% trypsin-EDTA का उपयोग अपनी संस्कृति पकवान से प्रोस्टेट कोशिकाओं को अलग करें। पीबीएस में 5 मिलीलीटर 10% FBS के साथ trypsin-EDTA के बेअसर।
    3. 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 200 XG, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    4. 20 μ लोसेल के समाधान के एल एक गिनती चैम्बर के लिए लोड और सेल संख्या की गणना करने के लिए। संस्कृति के माध्यम से 8 एक्स 10 4 सेल / एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से बाहर galvanotaxis कक्षों ले लो। प्रत्येक कक्ष पर सेल निलंबन के 350 μl बीज।
    6. गीला Kimwipe के साथ या 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक आर्द्रता चैम्बर में संस्कृति डिश में रात भर कक्षों में कोशिकाओं को सेते हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2:। चैम्बर के लिए कोशिकाओं सीडिंग नीचे चैम्बर सूखे और साफ किया जाता है ए) प्रोस्टेट कोशिकाओं, trypsinized गिना और चैम्बर को हस्तांतरित और रातोंरात incubated हैं बी) के एक शीर्ष coverglass फिल्माने से पहले चैम्बर सील करने के लिए जुड़ा हुआ है।।।

  1. एकशीर्ष कक्षों ssembling
    1. फिल्मांकन करने से पहले शीर्ष चैम्बर इकट्ठे। माइक्रोस्कोप केवल एक ही समय में एक ही galvanotaxis चैम्बर इमेजिंग समायोजित कर सकते हैं। प्रत्येक galvanotaxis कक्ष के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर गर्म। एक 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग की थाली के लिए इन्क्यूबेटरों से एक galvanotaxis चैम्बर स्थानांतरण।
    2. स्वाधीन कोशिकाओं को दूर करने के लिए मध्यम संस्कृति के साथ कोशिकाओं कुल्ला। चैम्बर में मध्यम के 400 μl छोड़ दें। दोनों गिलास spacers के शीर्ष पर उच्च वैक्यूम तेल लागू करने के लिए एक सिरिंज का प्रयोग करें।
    3. चैम्बर सील करने के लिए एक छोटा सा coverglass जोड़ें। धीरे एक कपास applicator के के पीछे की ओर के साथ coverglass नीचे दबाएँ। कपास swabs के साथ अतिरिक्त मध्यम से साफ कर लें।
    4. कांच की सतह सूखी और coverglass और कक्ष के बीच की खाई को सील करने के लिए उच्च वैक्यूम तेल लागू होते हैं। तेल प्रसार करने के लिए एक धातु रंग का प्रयोग करें। भीतरी जलाशयों को संस्कृति के माध्यम से 4 मिलीलीटर जोड़ें और जलाशयों के बीच तरल के प्रवाह की जाँच करें।
  2. अगर बनाओपुलों
    1. 2 इंच लंबी पीवीसी टयूबिंग की एक जोड़ी कट (503/16 आईडी एक्स 5/16 आयुध डिपो एक्स 16/01 वॉल), फ्लिप और एक 100 मिलीलीटर बीकर में उन्हें डालें।
    2. 200 मिलीग्राम Bacto-अग्रवाल उपाय और 2% अगर जेल बनाने के लिए 10 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर फ्लास्क में जोड़ें। 30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव। एक हस्तांतरण pipet के साथ प्लास्टिक टयूबिंग के लिए अगर जेल लोड करें। अगर जमना करने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अगर पुलों छोड़ दें।
    3. Galvanotaxis चैंबर के बाहरी जलाशयों को 2 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें। वर्तमान संचालन करने के लिए आंतरिक और बाहरी मध्यम जलाशयों को अगर पुलों डालें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। चैम्बर पर कोशिकाओं फ़िल्मांकन आरेख galvanotaxis चैंबर के अंतिम विधानसभा प्रदर्शित करने के लिए। चैम्बर पूरी तरह से उच्च वैक्यूम तेल के साथ बंद है। मध्यम टी गयी हैओ जलाशयों को भरने, और दो अगर पुलों के चेंबर में डाला जाता है। तब galvanotaxis चैम्बर माइक्रोस्कोप चरण के लिए स्थानांतरित कर रहा है और इलेक्ट्रोड बिजली के क्षेत्र लागू करने के लिए जुड़े होते हैं। इकट्ठे galvanotaxis चैंबर के ओर देखने के विद्युत प्रवाह अगर पुलों और गिलास को कवर के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से कोशिकाओं पर बहती है कि प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है।

3. समय चूक इमेजिंग

  1. इमेजिंग के लिए पहले घूम हवा 2 घंटे में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पर्यावरण कक्ष पर स्विच करें।
  2. माइक्रोस्कोप पर स्विच और छवि प्राप्त सॉफ्टवेयर आरंभ करें। खुर्दबीन मंच जांच करना और 10X उद्देश्य का चयन करें।
  3. खुर्दबीन चरण के लिए galvanotaxis कक्षों स्थानांतरण टेप के साथ चैम्बर सुरक्षित और कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित। सही पक्ष पर कैथोड के साथ बाहरी जलाशयों को galvanotaxis इलेक्ट्रोड डालें। तार और टेप के साथ इलेक्ट्रोड सुरक्षित।
  4. बिजली बो पर स्विच करेंएक्स चैम्बर के लिए एक बिजली के क्षेत्र लागू करने के लिए। 25 मिमी लंबा चैम्बर (100 एम वी / मिमी) के लिए 2.5 वोल्ट तक पहुँचने के लिए चैम्बर भर वाल्टमीटर के साथ उत्पादन में वोल्टेज उपाय। वर्तमान उत्पादन का समायोजन करके प्रयोग के दौरान क्षेत्र की ताकत को बनाए रखें।
  5. दस समय चूक फिल्मों उत्पन्न करने के लिए सॉफ्टवेयर में फिल्म के लिए चैम्बर भर में 10 अंक का चयन करें। 2 घंटे के लिए 10 मिनट के अंतराल पर अधिग्रहण शर्तों को निर्धारित करें।
  6. फिल्म शुरू करने और जरूरत के रूप में उत्पादन चालू समायोजित करें।
  7. प्रयोग के अंत में, मंच से चैम्बर को हटाने और 95% शराब के साथ कोशिकाओं को ठीक। साफ करने के लिए एक धार के साथ खुले चैम्बर तोड़ने और इसे फिर से उपयोग करें।

Galvanotaxis 4. मात्रा

  1. समय चूक फिल्मों और फिर से ओरिएंट छवियों के शीर्ष पर कैथोड घुमाएँ। सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के लिए फिल्मों में निर्यात करें।
  2. स्वयं एक फिल्म (चित्रा 4 ए, बी) से हर समय बिंदु पर 10-20 कोशिकाओं की (एक्स, वाई) की स्थिति पर नज़र रखने के।उत्तर-दक्षिण दिशा के सापेक्ष प्रवास दूरी और कोण, बिजली के क्षेत्र की एक ही अभिविन्यास, सेल ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 4C) में गणना की जाएगी।
    नोट: औसत प्रवास गति कुल माइग्रेशन दूरी और कुल फिल्माने के समय से बदल जाती है। दिशात्मकता कोज्या मूल्य के लिए कोणों से बदल जाती है। कोशिकाओं यादृच्छिक दिशात्मकता साथ विस्थापित हैं, शुद्ध कोज्या का औसत शून्य के करीब हो जाएगा। कोशिकाओं कैथोड की ओर सीधे विस्थापित हैं, कोसाइन मूल्य एक हो जाएगा। कोशिकाओं एनोड की ओर सीधे विस्थापित हैं, कोसाइन मूल्य -1 हो जाएगा।

चित्रा 4
चित्रा 4: सेल ट्रैकिंग दिशात्मकता को मापने के लिए सेल छवियों के साथ ट्रैकिंग लाइनों की ए) ओवरले।। कोशिकाओं की (एक्स, वाई) पदों manua हैंlly समय चूक फिल्मों में नज़र रखी। । कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से विस्थापित हैं, औसत कोज्या शून्य के करीब है बी) हालांकि, कोशिकाओं कैथोड या एनोड की ओर विस्थापित हैं, तो औसत कोज्या का मूल्य + (कैथोड) या के करीब है -। (एनोड) 1.0 सी ) दिशात्मकता प्रवास कोण (θ) से बदल जाती है जो कोज्या मूल्य, द्वारा प्रस्तुत किया जाता है। कोज्या (θ) दूरी बी (बिजली क्षेत्र की दिशा का अनुमान दूरी) की दूरी एक (माइग्रेशन दूरी) का अनुपात बराबर होती है।

  1. माप बचाओ। संयुक्त परिणाम की गणना करने के लिए एक डेटाबेस आवेदन करने के लिए डेटा आयात करें।
  2. बार रेखांकन (चित्रा 5) साजिश करने के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए औसत प्रवास गति और औसत कोज्या मूल्य के संयुक्त डेटा निर्यात करें।

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Representative Results

प्रोस्टेट कोशिकाओं (pRNS-1-1 और PNT2) की दो पंक्तियाँ इस विधि के साथ जांच की गई। दोनों लाइनों में कोशिकाओं 2 घंटे (चित्रा 5A) के पाठ्यक्रम पर 1.0 +/- 0.3 माइक्रोन / मिनट की समान गति में आ जाते हैं। हालांकि, बिजली क्षेत्र के लिए दिशात्मकता pRNS-1-1 लाइन के लिए 0.7 +/- 0.3, और PNT2 लाइन (चित्रा 5 ब) के लिए 0.2 +/- 0.8 है। परिणाम वे स्थितीय संकेतों को अलग दिशात्मक प्रतिक्रियाओं में परिणाम है कि विभिन्न सेलुलर संकेत तंत्र है, सुझाव है कि (, 100 कोशिकाओं ट्रैक किए गए थे पी <0.01) इन दो सेल लाइनों के galvanotaxis में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखा।

चित्रा 5
चित्रा 5: Galvanotaxis प्रोस्टेट कोशिकाओं की। कोशिकाओं बिजली के क्षेत्र को उजागर कर रहे हैं जब ए) pRNS-1-1 और PNT2 लाइनों के पलायन की गति के समान हैं।PNT2 लाइन बिजली के क्षेत्र में एक कम दिशात्मकता (कोज्या = 0.2) से पता चला है, जबकि बी) हालांकि, pRNS-1-1 लाइन, कैथोड (कोज्या = 0.7) की ओर से एक उच्च दिशात्मकता दिखाया।

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Discussion

एक सेल के galvanotaxis प्रतिक्रिया के विश्लेषण के कई सेलुलर प्रवासी या विकास के लिए एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक सूचक 27, 28 प्रक्रियाओं की गई है। यहाँ हम दो प्रोस्टेट सेल लाइनों फिल्म के लिए कांच की सतह के साथ एक कस्टम निर्मित कक्ष का उपयोग करें। इन सेल लाइनों galvanotaxis के विभिन्न डिग्री का प्रदर्शन किया है, और हम इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण या galvanotaxis-मध्यस्थता प्रोटीन की सक्रियता galvanotaxis जवाब में मनाया फर्क है, जिसके परिणामस्वरूप अमर सेल लाइनों पैदा करने की प्रक्रिया के दौरान दखल हो सकता है कि अटकलें।

संस्कृति व्यंजन 27, 28 में किए गए अन्य galvanotaxis कक्ष डिजाइन की तुलना में, वर्तमान डिजाइन करने के लिए कई लाभ हैं। सबसे पहले, कांच की सतह इमेजिंग के लिए उपयुक्त है और कोशिकाओं के साथ coverglass immunostaining के लिए galvanotaxis के बाद लिया जा सकता है। इस अध्ययन में हम कोशिकाओं का एक समूह की निगरानी के लिए 10X उद्देश्य से एक कम बढ़ाई इस्तेमाल किया। हालांकि, thes के साथई सुधार कांच प्रकाशिकी, यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं कोशिकाओं 17 के अग्रणी धार पर lamellipodial का तेजी से विस्तार और त्याग ट्रैकिंग, या नज़र रखने के लिए, एक 60X तेल उद्देश्य के साथ उच्च बढ़ाई पर एक एकल कोशिका फिल्म के लिए संभव है। दूसरा, कांच की सतह मैट्रिक्स प्रोटीन कोटिंग्स 10, 12 के साथ संशोधित या सूक्ष्म चैनल के साथ नमूनों किया जा सकता है। रासायनिक उपचार भी 29 फिल्माने से पहले कोशिकाओं का इलाज पूर्व के लिए संभव हो रहे हैं। मैट्रिक्स कोटिंग यहां इस्तेमाल प्रोस्टेट सेल लाइनों के लिए आवश्यक नहीं है, और मैट्रिक्स कोटिंग सेल प्रकार पर निर्भर है। उदाहरण के लिए, कोलेजन मैं कोटिंग मानव केरेटिनकोशिकाओं 30 की galvanotaxis के लिए आवश्यक है, लेकिन laminin कोटिंग मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 31 के galvanotaxis के लिए आवश्यक है। हम कोलेजन मैं कोलेजन चतुर्थ, फ़ाइब्रोनेक्टिन, और laminin पर मानव keratinocyte galvanotaxis का परीक्षण किया। अलग मैट्रिक्स प्रोटीन सेल प्रवास गति बदल दिया है, लेकिन cathodal migrati परिवर्तन नहीं किया galvanotaxis 29 में पर। तीसरा, संशोधित प्लैटिनम इलेक्ट्रोड बिजली के क्षेत्र में निष्क्रिय रहे हैं। अन्य galvanotaxis विधियों 27 में उपयोग के रूप में चांदी इलेक्ट्रोड की तुलना में, वे टूट नहीं है या galvanotaxis में cytotoxicity कम कर देता है जो मध्यम, धातु आयनों जारी। चौथा, हम हमारे तेज या धीमी गति या तो सेल प्रवास पर नजर रखने में मदद करता है जो फ्रेम पर कब्जा, के अंतराल बदल सकते हैं। मोटरयुक्त माइक्रोस्कोप भी एक कक्ष में विभिन्न क्षेत्रों से कई फिल्में अर्जित करने का अवसर प्रदान करता है। आवेदन बिजली क्षेत्र के बिना एक नियंत्रण प्रयोग बिजली के क्षेत्र कोशिकाओं के प्रवासी गति बदल निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

हालांकि, मौजूदा galvanotaxis कक्षों के कारण जलाशयों में मध्यम की छोटी मात्रा के लिए ऊपर से 4 घंटे के लिए फिल्माने सेल प्रवास के लिए सीमित कर रहे हैं। कक्ष डिजाइन का एक विस्तृत संस्करण के साथ, यह समय की एक लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं फिल्म के लिए संभव हो जाएगा।

ve_content "> विधि में कुछ संभावित समस्याओं में शामिल हैं:। वे शोषित हो जाते हैं अगर चैम्बर (400 μl) में मध्यम की एक बहुत छोटी मात्रा के बाद से वहाँ 1) कोशिकाओं चैम्बर विधानसभा के दौरान मर सकता है, यह हवा फँसाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है यह है पहले बुलबुले कक्ष में और सेल कुल्ला चरण के दौरान कोशिकाओं को कवर कुछ तरल रखने के लिए। 2) चैम्बर कक्ष के माध्यम से गुजर रहा है वर्तमान में कमी होगी, जो इमेजिंग के दौरान रिसाव सकता है। चैम्बर में तरल प्रवाह ध्यान से जाँच की जानी चाहिए लागू किया खुर्दबीन मंच और अधिक उच्च वैक्यूम तेल को हस्तांतरित की जरूरत है। 3) उच्च वैक्यूम तेल फिल्माने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं smudged है। कांच की सतह से तेल निकालने के लिए 95% शराब के साथ साफ किया जा सकता है। 4) स्टेज बहाव या पर कक्षों के किसी भी विस्थापन एक मोटर चालित खुर्दबीन मंच पूर्वाग्रह सकता है दिशात्मक प्रवास की माप। इसलिए, यह पर्याप्त चरण धारक और लेबलिंग टेप के साथ galvanotaxis कक्षों सुरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

ntent "> कुल मिलाकर, galvanotaxis विधि हमें आगे जीवों में दिशात्मक प्रवास समझने में मदद मिलेगी जो एक आवेदन बिजली क्षेत्र में गतिशील कोशिकाओं के आंतरिक दिशात्मकता प्रकट करने के लिए उपयोगी है।

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Acknowledgments

प्रोस्टेट सेल लाइनों कृपया कैंसर केंद्र, यूसी डेविस में डॉ लिंग-यू वांग और डॉ सिंग-Jien कुंग द्वारा प्रदान की जाती हैं। इस परियोजना एनआईएच galvanotaxis अनुदान 4R33AI080604 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells Sigma-Aldrich 95012613-1VL Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  Invitrogen 11875-093 warm up to 37 °C before use
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 10% in PBS, warm up to 37 °C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240 add 5 ml to 500 ml medium
2-propanol VWR BDH1133-5GL
PBS - - 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 and 1.5 mM KH2PO4 in 1,000 ml of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37 °C before use
0.25% Trypsin-EDTA  Invitrogen 25200-056 warm up to 37 °C before use, treat cells for 3-5 min at 37 °C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers Precision Plastics Inc, CA Custom-designed (1/4" x 2" x 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers. Please contact the authors for the design specs.
Galvanotaxis electrodes UCD electric shop platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box Substrate Engineering, CA custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45 x 50 mm, No. 1.5 Fisher 12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25 x 25 mm, No. 1 ThermoScientific 3307
Diamond point marker ThermoScientific 750
Marine grade silicon sealer, clear 3M 051135-08019
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
6 ml syringe Fisher Scientific 05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5 ml Nichiryo SG-M
Cotton applicators Purtian Medical Products 806-WC
Qtips Johnson & Johnson 729389
Nalgene 180 PVC tubing  Nalgene 8000-9030 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar Difco 0140-01 make 2% agar solution
Razor Blade Personna 74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5810R operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4 Nexcelom Auto T4
Cellometer counting chambers Nexcelom CHT4-SD100-002 load 20 μl cell solutions to count
Culture Temp Warming plate Bel-Art Scienceware 370150000 to keep the galvanotaxis chambers at 37 °C 
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len Nikon
Retiga EX CCD camera  Qimaging Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2 Airgas special order
Volocity 6.3 PerkinElmer Image acquiring software
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References

  1. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  2. Cao, L., et al. Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts. EMBO Rep. 14 (2), 184-190 (2013).
  3. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption. Dev Biol. 166 (2), 789-800 (1994).
  4. Hotary, K. B., Robinson, K. R. Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development. Development. 114 (4), 985-996 (1992).
  5. Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited. Biochem Biophys Res Commun. 431 (2), 280-283 (2013).
  6. Wood, M. D., Willits, R. K. Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements. J Neural Eng. 6 (4), 046003 (2009).
  7. Kucerova, R., et al. The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization. J Cell Physiol. 226 (6), 1544-1553 (2011).
  8. Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength. Exp Dermatol. 12 (4), 396-402 (2003).
  9. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  10. Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds. J Cell Sci. 109 (1), 199-207 (1996).
  11. Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 70 (5), 667-673 (2000).
  12. Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).
  13. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11 (7), 1298-1304 (2011).
  14. Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  15. Wu, D., Ma, X., Lin, F. DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. Cell Biochem Biophys. 67 (3), 1115-1125 (2013).
  16. Martin-Granados, C., et al. A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells. PLoS One. 7 (7), 40769 (2012).
  17. Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes. J Cell Sci. 126 (9), 1942-1951 (2013).
  18. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  19. Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium. J Cell Sci. 119 (22), 4741-4748 (2006).
  20. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (13), 2548-2558 (1996).
  21. Peng, H. B., Jaffe, L. F. Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields. Dev Biol. 53 (2), 277-284 (1976).
  22. Lee, M., et al. Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome. Int J Oncol. 4 (4), 821-830 (1994).
  23. Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines. Int J Oncol. 6 (2), 333-343 (1995).
  24. Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines. Genes Chromosomes Cancer. 30 (2), 143-160 (2001).
  25. Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium. Prostate. 67 (15), 1601-1613 (2007).
  26. Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
  27. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field. J Vis Exp. (68), (2012).
  28. Meng, X., et al. Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments. J Vis Exp. (60), (2012).
  29. Pullar, C. E., Isseroff, R. R. Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field. J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).
  30. Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules. J Invest Dermatol. 106 (4), 642-646 (1996).
  31. Feng, J. F., et al. Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field. Stem Cells. 30 (2), 349-355 (2012).
  32. Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. Microneedle array for measuring wound generated electric fields. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).
  33. Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing. Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 94 कोशिका जीव विज्ञान प्रोस्टेट कोशिकाओं सेल प्रवास बिजली के क्षेत्र galvanotaxis समय चूक इमेजिंग
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Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff,… More

Yang, H. y., Dinh La, T., Isseroff, R. R. Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells. J. Vis. Exp. (94), e51973, doi:10.3791/51973 (2014).

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