Summary
Selvom en kendt model, marsvin i øjeblikket udgør en niche i forsøgsdyr videnskaber og begrænsede data om gennemførelsen af de fleste procedurer. Her præsenterer vi fire forskellige tilgange til ikke-terminal in vivo blodprøvetagning teknikker i enten bevidste eller bedøvede marsvin.
Abstract
Marsvin har flere biologiske ligheder til mennesker og valideres eksperimentelle dyremodeller 1-3. Men brugen af marsvin i øjeblikket udgør et relativt smalt område af forskning og beskrivende data om specifikke metode er tilsvarende knappe. De anatomiske træk af marsvin er lidt forskellig fra andre gnavermodeller dermed modulering af stikprøver at rumme artsspecifikke forskelle, f.eks. Sammenlignet med mus og rotter, er nødvendige for at opnå tilstrækkelige og høj kvalitet prøver. Da både lang og kort sigt in vivo-undersøgelser ofte kræver gentagne blodprøvetagning valg af teknik bør være godt overvejes for at reducere stress og ubehag i dyrene, men også for at sikre overlevelse, samt overholdelse af kravene til stikprøvestørrelse og tilgængelighed. Kan fås venøse blodprøver på en række steder i marsvin f.eks., Saphenous og jugularisvener, hver teknik indeholder både fordele og ulemper 4,5. Her præsenterer vi fire forskellige blodprøvetagning teknikker til enten bevidste eller bedøvede marsvin. Procedurerne er alle ikke-terminale procedurer, forudsat at prøvevolumener og antal prøver ikke overstiger retningslinjer for indsamling af blod i forsøgsdyr 6. Alle de beskrevne metoder er blevet grundigt afprøvet og anvendt til gentagen in vivo blodprøveudtagning i studier inden for vores forskning facilitet.
Introduction
Marsvin er en værdifuld og valideret eksperimentel dyremodel på grund af en række biologiske ligheder til mennesker, såsom et krav om en kosten forsyning af C-vitamin, sammenlignelig plasma lipoprotein enzymer og lipoprotein profiler, samt delte ligheder med menneskelig placentation og prænatal udvikling 1-3,7,8. Dette gør marsvin et attraktivt og velegnet model til at studere virkningerne af kost-associerede sygdomme såsom alkoholfri fedtlever sygdom, hjerte-kar-sygdomme og formodede virkninger af C-vitaminmangel, men også effekten af f.eks., Moderens kostintervention på udviklingslandene afkom.
Gentagen blodprøvetagning er ofte nødvendig i både lang og kort sigt, in vivo-undersøgelser. På grund af artsspecifikke anatomiske forskelle er nødvendigt modulation af stikprøveudtagningsteknik for at opnå blodprøver i marsvin sammenlignet med andre gnavermodeller
Her præsenterer vi fire forskellige blodprøvetagning teknikker til enten bevidste eller bedøvede marsvin. Procedures er alle ikke-terminale procedurer, forudsat at prøvevolumener og antal prøver ikke overstiger retningslinjer for indsamling af blod i forsøgsdyr 6. Det er af hensyn til god videnskab samt dyrevelfærd, at stress bør holdes på et minimum. Følgelig kan kun veluddannede og kompetent personlig skal udføre procedurerne dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De viste procedurer blev udført i henhold til protokoller, der er godkendt af den danske Dyreforsøg inspektorat under Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri.
1. Blodprøvetagning fra Lateral saphenus eller Tarsal Vein
- Udfør denne procedure uden bedøvelse og med hjælp fra en efterforsker, en håndtering af marsvin, og en opsamling af prøven.
- Barber tarsal region bagbenet med en elektrisk barbermaskine, indtil vener er synlige. Sørg for, at området er stort nok til at undgå pels forstyrre punkturstedet.
- Placer bagbenet i en lunken vandbad og forsigtigt gnide benet, hvilket gør venerne mere dilaterede og indlysende.
- Tør benet med et rent håndklæde og desinficere indstiksstedet med gaze eller en vatpind fugtet med 70% alkohol.
- Begrænse marsvin og udvide bagbenet nedad mens tilføre et let pres umiddelbart over knæleddet to levere stasis.
- Punkter venen ved hjælp af en 21 G kanyle eller Lancet. Blodprøven f.eks. Ved hjælp af en samling eller kapillarrør. Forsigtigt manipulere ben til støtte blodgennemstrømningen.
- Slip stasis, når prøven er blevet opnået. Sæt et stykke gaze eller vat med let tryk på punkturstedet, indtil blødningen er stoppet.
- Sende dyret tilbage til sit bur og skærm i 5-10 minutter for at sikre hæmostase.
2. Blodprøvetagning fra ørevenen
- Udfør denne procedure uden bedøvelse, enten alene eller fortrinsvis ved hjælp af en kollega.
- Desinficer den dorsale overflade af øret ved hjælp af gaze eller en vatpind fugtet med 70% alkohol.
- Påfør let tryk til bunden af øret for at give stasis.
- Punkter venen ved anvendelse af en 21 G nål eller lancet, og indsamle blod.
- Slip stasis, når prøven er opnået, Sæt et stykke gaze eller vat med GEntle tryk på punkturstedet, indtil blødningen er stoppet.
- Sende dyret tilbage til sit bur og skærm i 5-10 minutter for at sikre hæmostase.
3. Blodprøvetagning fra halsvenen
- Udfør denne procedure ved hjælp af hjælp af en ekstra efterforsker; en håndtering af marsvin og en opsamling af prøven.
- Bedøve marsvin med et egnet bedøvelsesmiddel for hele varigheden af denne procedure. En blanding af tiletamin (0,93 mg / kg), zolazepam (0,93 mg / kg), xylazin (1,49 mg / kg) og butorphanol (0,06 mg / kg) kan anvendes.
- Placer bedøvede marsvin på ryggen og træk forsigtigt forbenene kaudalt.
- Barbering og desinficere (f.eks. Med 70% alkohol) den ventrale del af halsen.
- Coat sprøjten med enten heparin eller EDTA før prøveudtagningen med henblik på at mindske risikoen for koagulation.
- Palpere kravebenet og indsætte en 25 g (eller 23 g) nål monteret på en 1 ml sprøjte apkring 1 cm lateralt for midterlinien på niveau med skulderleddet. Opbevar sprøjten i en svag opadgående og mediale vinkel mens anvendelse et svagt undertryk. Undgå at beskadige de underliggende strukturer som halsvenen ligger ganske overfladisk. Vip hals marsvin lidt bagud for at give øget stase af venen.
- Slip forbenene når blodprøven opnås, og lindre stasis før nålen er trukket tilbage. Brug en tør stykke gaze eller vat til at anvende let tryk på punkturstedet.
- Sende dyret tilbage til et opsving bur og overvåge for at sikre hæmostase og genrejsning efter anæstesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire forskellige tilgange til ikke-terminal in vivo blodprøvetagning teknikker i enten bevidste eller bedøvede marsvin er blevet præsenteret. Figur 1 viser forløbet af den laterale vena og tarsal vene i marsvin og eventuelle punktur. Ørevener synlige på den dorsale overflade af et marsvin øre er illustreret i figur 2. Disse vener kan anvendes til blodprøvetagning, hvor kun en meget lille mængde er påkrævet. Placeringen af forsøgskanin for jugularis blodprøvetagning er vist på Figur 3. Forløbet af halsvenen er illustreret ved pilene med den øverste pil, der peger i den anbefalede indstiksstedet.
Figur 1. Den laterale vena og tarsal vene i marsvin. Billedet illustrerer kurset ogpunkturstedet til blodprøvetagning fra den laterale saphenous (øverste pil) eller tarsal vene (nederste pil) i marsvin.
Figur 2. ørevener. Dette billede illustrerer ørevener (pile) er synlige på den dorsale overflade af et marsvin øre. Disse vener kan anvendes til blodprøvetagning, hvor kun en meget lille mængde er påkrævet.
Figur 3. Placering af forsøgskanin for jugularis prøvetagning vene blod. Dette illustrerer placeringen af marsvin og punkturstedet til jugularis prøvetagning vene blod. Pilene viser forløbet af halsvenen med den øverste pil, der peger i retning af den anbefalede punkturstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenlignet med mus og rotter, marsvin er bange af natur og skal behandles roligt og håndteres korrekt med henblik på at reducere stress. Ud fra et dyrevelfærdsmæssigt synspunkt, der handler med omhu, er naturligvis en prioritet; Dette vil imidlertid også reducere risikoen for angst-effekter på indsamlede data f.eks., øgede blodniveauer af kortikosteroider og glucose 12. Ligeledes vil daglige håndtering vænne dyrene til normale procedurer og kan tjene til at reducere stress yderligere. Praktisk ekspertise i et bestemt blodprøvetagning teknik skal opnås ved først at observere en erfaren operatør og derefter gennemføre den teknik under opsyn indtil kompetence er opnået. Den valgte teknik bør ideelt både reducere stress og ubehag på et minimum, men også for at sikre overlevelse, samt overholdelse af kravene til stikprøvestørrelse og tilgængelighed. For alle præsenterede blod prøveudtagningsmetoder aseptiske teknikker bør væreanvendes til at minimere risikoen for infektion og sikre indsamling af uforurenede prøver.
De illustrerede tilgange til blodprøvetagning sikre overlevelse af dyret, forudsat at prøve volumen og frekvens opnås i henhold til retningslinjerne og kan alle anvendes til gentagen prøvetagning i både korte og lange sigt undersøgelser 6. Dette gør det muligt konsekvent overvågning af de enkelte dyr over tid herved reducere varians og antal medtaget dyr i overensstemmelse med 3R «(reduktion) 13,14. De teknikker, der præsenteres her har forskellige serier af opnåelige prøvevolumen (et par pi op til 1-2 ml), som bør overvejes før påbegyndelse et eksperiment. Selvom procedurer for indsamling af blod fra halsvenen i un-bedøvede marsvin er blevet beskrevet 12, anbefaler vi kraftigt brugen af bedøvelse for at reducere stress og ubehag så meget som muligt. Når du gør det, bør valget af anæstesi være carefully rettet, at bemærke, at marsvin er notorisk svære at bedøve og vise betydelig variation effektiviteten af anæstesi samt en høj følsomhed over for induceret respiration depression 15,16. Som jugularvenen i marsvin hverken er synlig eller håndgribelig enhver reduktion i stasis / venøs dilatation kan øge prøvetagning vanskeligheder, hvorfor det anbefales generelt at undgå vaskulær snærende agenter i anæstesi-blandinger. . Desuden kendte virkninger af specifikke bedøvende midler, der kan forstyrre den ønskede dataindsamling fx kardiovaskulære virkninger og / eller forhøjede blodsukkerniveauer efter α 2 - bør agonistvirkninger hos gnavere vurderes 16,17. Brugen af inhalationsanæstetika, som f.eks isofluran kan også være en mulighed, men som intubation i marsvin er skal træffes en meget vanskelig opgave omhu for at undgå interferens ved indånding-maske med hoved / hals position, da dette kan complicspiste proceduren unødvendigt. Generaliseret anæstesi f.eks. Ved indånding er også påkrævet for hjertepunktur som kan give en større prøvemængde. Men hjertepunktur er en terminal og kan derfor ikke umiddelbart til gentagen prøveudtagning og vil ikke blive beskrevet yderligere.
Kan forekomme Potentielle bivirkninger såsom blødning, blå mærker, trombose, infektion og ardannelse efter punktering af en vene. Det er vores erfaring, er marsvin ikke udviser en øget risiko for sådanne uønskede komplikationer i forhold til andre gnavermodeller forudsat at proceduren er udført som beskrevet i den aktuelle manuskript. Som halsvenen ikke kan visualiseres fra den ydre overflade, er det meget vigtigt at lindre stasis før nålen trækkes ud og at tilvejebringe tilstrækkelig hæmostase for at minimere risikoen for peri-venøs blødning og blå mærker. I tilfælde af bivirkninger, bør behandlingen altid søges fra den ansvarlige veterinarian. Af hensyn til god dyrevelfærd og videnskab, skal alvorlige overvejelser gives til den kombinerede effekt af prøvevolumen og frekvens og valg af stikprøver teknik. Alle de beskrevne blodprøvetagning teknikker er blevet grundigt afprøvet og anvendt til gentagen in vivo blodprøvetagning i studier inden for vores forskning facilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre. Alle procedurer blev godkendt af Dyreforsøg Act of Danmark, hvilket er i overensstemmelse med Europarådets konvention ETS 123.
Acknowledgments
Vi anerkender den dygtige bistand fra Annie B. Kristensen, Elisabeth V. Andersen, Belinda B. Bringtoft og animalske pedeller på Institut for Eksperimentel Medicin, Frederiksberg Campus, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, Danmark. Jacob Lønholdt er takkede for hans fremragende teknisk bistand filme procedurerne. Denne undersøgelse blev støttet delvist af LIFEPHARM Center for in vivo Farmakologi og Københavns Universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electric shaver | Wella (Contura), Denmark | 273207 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Syringes | B.Braun-Omnifix-F, Germany | 9161406V | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Needles | BD Microlance, Spain | 301156 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Microvette collection tube | Sarstedt, D-51588Nümbrecht, Germany | 201,288,100 | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
| Accu-Check analyzer | Roche A/S Diagnostics, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Heparin 5000 IE/ml | LEO Pharma, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Zoletil 50, Chemvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Narcoxyl vet 20 mg/ml, Intervet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Anesthesia | Torbugesic vet 10 mg/ml, Scanvet, Denmark | Alternative product may be used. Multiple suppliers | |
| Neutral eye ointment | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Gauze or a cotton swab | Alternative product may be used. Multiple suppliers | ||
| Disinfectant (70% alcohol) | Alternative product may be used. Multiple suppliers |
References
- DeOgburn, R., et al. Effects of increased dietary cholesterol with carbohydrate restriction on hepatic lipid metabolism in Guinea pigs. Comp.Med. 62 (2), 109-115 (2012).
- Fernandez, M., Volek, J. S. Guinea pigs a suitable animal model to study lipoprotein metabolism, atherosclerosis and inflammation. Nutr Metab (Lond). 3 (17), (2006).
- Frikke-Schmidt, H., Tveden-Nyborg, P., Birck, M. M., Lykkesfeldt, J. High dietary fat and cholesterol exacerbates chronic vitamin C deficiency in guinea pigs. Br J Nutr. 105 (1), 54-61 (2011).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig, ferret and mink. Lab Anim. 32 (4), 364-368 (1998).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ye, P., Cheah, I. K., Halliwell, B. High fat diets and pathology in the guinea pig Atherosclerosis or liver damage. Biochim Biophys Acta. 1832 (2), 355-364 (2013).
- Tveden-Nyborg, P., et al. Maternal vitamin C deficiency during pregnancy persistently impairs hippocampal neurogenesis in offspring of guinea pigs. PLoS One. 7 (10), 12-18391 (2012).
- Schjoldager, J. G., Tveden-Nyborg, P., Lykkesfeldt, J. Prolonged maternal vitamin C deficiency overrides preferential fetal ascorbate transport but does not influence perinatal survival in guinea pigs. Br J Nutr. 110 (9), 1573-1579 (2013).
- Greulich, S., et al. Secretory products of guinea pig epicardial fat induce insulin resistance and impair primary adult rat cardiomyocyte function. J Cell Mol Med. 15 (11), 2399-2410 (2011).
- Swifka, J., Weiss, J., Addicks, K., Eckel, J., Rosen, P. Epicardial fat from guinea pig a model to study the paracrine network of interactions between epicardial fat and myocardium. Cardiovasc Drugs Ther. 22 (2), 107-114 (2008).
- Pilny, A. A. Clinical hematology of rodent species. Vet.Clin North Am Exot Anim Pract. 11 (3), 523-vii (2008).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Van, L. J., et al. eAssessing the application of the 3Rs a survey among animal welfare officers in The Netherlands. Lab Anim. 47 (3), 210-219 (2013).
- Sloan, R. C., et al. High doses of ketamine-xylazine anesthesia reduce cardiac ischemia-reperfusion injury in guinea pigs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (3), 349-354 (2011).
- Jacobson, C. A. A novel anaesthetic regimen for surgical procedures in guinea pigs. Lab Anim. 35 (3), 271-276 (2001).
- Saha, J. K., Xia, J., Grondin, J. M., Engle, S. K., Jakubowski, J. A. Acute hyperglycemia induced by ketamine xylazine anesthesia in rats mechanisms and implications for preclinical models. Exp Biol Med(Maywood). 230 (10), 777-784 (2005).
