Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

A السريع البكتيرية إعداد بيليه من ثقافة الدم إيجابية يمكن استخدامها كعينة لتطبيقات مثل التعرف بواسطة MALDI-TOF، غرام تلطيخ، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية واختبار PCR القائم. النتائج التي يمكن أن ترسل بسرعة إلى الأطباء لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.

Abstract

التهابات مجرى الدم والإنتان هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. نتائج ناجحة للمرضى الذين يعانون من تجرثم الدم تعتمد على التحديد السريع للجراثيم لتوجيه العلاج بالمضادات الحيوية المثلى. تحليل بقع غرام من ثقافة الدم إيجابية يمكن أن تتم بسرعة وبالفعل تؤثر بشكل كبير على نظام المضادات الحيوية. ومع ذلك، ما زالت هناك حاجة إلى تحديد دقيق للجراثيم لتحديد العلاج الأمثل المستهدفة. نقدم هنا البكتيرية إعداد بيليه بسيطة وسريعة من ثقافة الدم الإيجابية التي يمكن استخدامها كعينة لعدة تطبيقات المصب الأساسية مثل تحديد الهوية من جانب MALDI-TOF MS، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) من خلال القرص نشر الفحص الآلي أو أنظمة AST والتلقائية وفقا PCR-الاختبارات التشخيصية. أداء هذه الأنظمة تحديد وAST مختلفة تطبق مباشرة على كريات الدم البكتيرية الثقافة الاشتراكية جداmilar إلى الأداء التي تم الحصول عليها عادة من المستعمرات المعزولة نمت على لوحات أجار. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية ويقلل بشكل كبير من الوقت لتقرير كل من تحديد وAST. وهكذا، في أعقاب الثقافة الإيجابية الدم، وتحديد من قبل MALDI-TOF يمكن ذكرت في غضون اقل من 1 ساعة في حين أن نتائج AST AST الآلي من قبل أنظمة أو المقايسات نشر القرص ضمن 8 إلى 18 ساعة، على التوالي. وبالمثل، فإن نتائج الفحص السريع PCR القائم يمكن أن ترسل إلى الأطباء أقل من 2 ساعة في أعقاب تقرير لتجرثم الدم. معا، وتظهر هذه النتائج أن الإعداد السريع لبيليه البكتيرية ثقافة الدم لديه تأثير كبير على تحديد وقت وAST التحول وبالتالي على نتيجة ناجحة من المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التهابات مجرى الدم والإنتان في المرضى في المستشفيات هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. وهكذا، ويلاحظ الوفيات المتعلقة دموية العدوى في حوالي 14٪ إلى 37٪ من المرضى في المستشفى وربما تزيد إلى 35٪ في وحدات العناية المركزة المرضى 1-3. تحديد السريع للجراثيم هو محوري في توجيه العلاج المضادة للميكروبات الأمثل وزيادة نجاح العلاج المضادة للميكروبات 4،5. التحليل السريع للبقع غرام من ثقافة الدم إيجابية بالفعل لها تأثير كبير على تكييف العلاج المضادة للميكروبات 6،7 ولكن التحديد الدقيق للجراثيم هو مطلوب لتوفير أفضل العلاج بالمضادات الحيوية تتكيف مع المرضى. على سبيل المثال، تختلف نظم العلاج بالمضادات الحيوية لا بد من تنفيذها التالية تجرثم مع المكورات المعوية والعقديات التي يصعب تمييز من قبل غرام تلطيخ. وبالمثل، والتعرف على الأنواع ليفمطلوب ايل للكشف غرام enterobacteria السلبية ترميز الجينات الصبغية شركة المرفأ للطاقة التي تمنح مقاومة لزيادة β-اكتام 8.

مع ثقافة الدم إيجابية، ونهج التشخيص التقليدي لثقافة فرعية للجراثيم على لوحات أجار مختلفة، الأمر الذي يتطلب عدة ساعات من الحضانة إضافية تحديد مسبق مع الطرق المختلفة بما في ذلك الاختبارات البيوكيميائية والنمو على وسائل الإعلام المختلفة انتقائية ونظم التعرف الآلي الميكروبي. الوقت لنتائج نهج التشخيص التقليدي هو من حوالي 1 إلى 3 أيام.

وقد وفرت ظهور بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF) التكنولوجيا من أجل التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة أداة جديدة لتحديد بسرعة الكائنات الدقيقة من المستعمرات نمت على لوحات أجار ولكن أيضا مباشرة من الدم إيجابي الثقافات (الشكل 1) 9-12. عشراستخدام البريد من MALDI-TOF لتحديد وكيل المعدية من الثقافات الدم قد قلل كثيرا من الوقت إلى النتائج لبضع دقائق بدلا من ساعات وأيام تتطلبها الطرق التقليدية. كما نوقش من قبل Croxatto وآخرون 13، وكفاءة تحديد MALDI-TOF تعتمد على معايير مختلفة بما في ذلك نقاء الكائن الدقيق وكميتها. يتم الحصول على هذين المعيارين بسهولة من مستعمرات منفصلة نمت على لوحات أجار ولكن تتطلب العلاج قبل تحليلية لتخصيب البكتيرية وتنقية من عينات معقدة مثل ثقافة الدم، والتي تحتوي على العديد من المكونات الخلوية والبروتينات التي قد تتداخل مع تحديد MALDI-TOF.

وقد استخدمت أساليب العزلة مختلف الكائنات الحية الدقيقة "من ثقافة الدم في عدد من الدراسات بما في ذلك سابونين أو غيرها من طريقة المنظفات معتدل لاستخراج بكتيريا 9،14، المصل طريقة فاصل 10، تحلل أساليب الطرد المركزي 12 (الشكل 2) 15. هذا المستحضر بيليه ثقافة الدم كما توفر عينة لتطبيقات المصب المباشرة الأخرى مثل تلطيخ غرام، واختبارات التشخيص الآلي PCR القائم مثل POCT-تقارير إنجاز المشروعات للكشف السريع للمقاومة للميثيسيلين Staphyloccocus العنقودية الذهبية (الجرثومة)، واختبار الحساسية للمضادات الحيوية مع أنظمة AST الآلي و / أو عن طريق القرص المقايسات نشر على لوحات أجار (الشكل 3).

في هذا العمل، نحن تصف الخطوات المختلفة لإعداد بيليه البكتيرية ثقافة الدم كما أوضح Prod'hom وآخرون 15 (الشكل 4). ونحن أيضا إلغاءالكاتب البروتوكولات لثلاثة من التطبيقات الرئيسية التي يمكن القيام بها على بيليه ثقافة الدم: تحديد بواسطة MALDI-TOF 15، تحديد الهوية (ID) واختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) مع النظم الآلية 16 لالمعوية والعنقوديات وPCR- الآلي اختبار تشخيصي استنادا للكشف عن الجرثومة 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وبعد التحقق من صحة عمليات البحث والتطوير والقواعد الأخلاقية لمؤسستنا قبل تطبيقها كأداة روتينية.

1. إعداد ثقافة الدم الجرثومي بيليه من كلوريد الأمونيوم الإجراءات كرات الدم الحمراء، lysing

  1. إعداد ثقافة الدم إيجابية لاحق الطرد المركزي.
    1. تعقيم الغطاء ثقافة الدم. إضافة 70٪ من الإيثانول على غطاء الزجاجة وحرقها.
      ملاحظة: لا تؤدي هذه الخطوة تحت غطاء تدفق الصفحي.
    2. نقل زجاجة إلى غطاء تدفق الصفحي. جمع 5 مل من ثقافة الدم مع حقنة G 20.
    3. إضافة 5 مل من ثقافة الدم في أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 45 مل من الماء المعقم (H 2 O) وخلط العينة.
  2. إعداد بيليه البكتيرية ثقافة الدم عن طريق تحلل الطرد المركزي.
    1. أجهزة الطرد المركزي في العينة 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    2. ريمولقد طاف (الذي يحتوي أساسا H 2 O وخلايا الدم) مع مضخة فراغ مختبر.
    3. resuspend الكرية في 1 مل من كلوريد الأمونيوم الصنع lysing الحل (0.15 M NH 4 الكلورين، 1 ملم KHCO 3). كسر بيليه عن طريق كشط وقبل vortexing الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي العينة في 140 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. تجاهل طاف التي تحتوي أساسا خلايا الدم الحمراء الحطام.
      1. إذا بقي بيليه النزفية، resuspend وبيليه في 2 مل من معقم والمقطر H 2 0 لزيادة ليز خلايا الدم الحمراء والمتبقية لغسل بيليه. أجهزة الطرد المركزي العينة في 140 x ج لمدة 10 دقيقة في RT وتجاهل طاف.
    5. Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من H 2 O
  3. ثقافة فرعية من ثقافة الدم على مختلف انتقائي وغير انتقائي وسائل الإعلام أجار.
    1. جمع 1 مل من ثقافة الدم مع حقنة G 20.
    2. تطعيم 1 قطرة من ثقافة الدم كثافة العملياتس أربعة أجزاء على أجار الدم، والشوكولاته أجار، McConkey أجار وSchaedler أجار.
    3. احتضان عند 37 ° C أجار الدم وألواح الشوكولاته أجار في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي، وأجار McConkey في جو طبيعي ولوحة أجار Schaedler في الظروف اللاهوائية.
    4. اتبع نمو البكتيريا على وسائل الإعلام المختلفة.
    5. تحقق من النقاء البكتيرية.

2. تحديد بواسطة MALDI-TOF MS

  1. التعرف المباشر من بيليه الدم.
    1. نقل 1 ميكرولتر من الدم بيليه على لوحة الهدف MALDI واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية.
    2. تراكب العينة مع حمض الفورميك 1 ميكرولتر 70٪ واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية.
    3. تراكب العينة مع 1 ميكرولتر من MALDI مصفوفة (محلول مشبع من α-سيانو-4-hydroxycinnamic حامض في 50٪ حامض trifluoroacetic الأسيتونيتريل 2.5٪) واتركها لتجف على 42 ° C منصة التدفئة.
    4. انتقل إلى MALDI-TOF MS تحليل مع نظام MALDI-TOF MS كما هو موضح من قبل الشركات المصنعة.
    5. إذا كانت النتيجة غير صالحة التعرف على مستوى الأنواع (على سبيل المثال مع درجة <2)، إجراء استخراج البروتين من العينة بيليه الدم.
  2. تحديد بعد استخراج البروتين من بيليه ثقافة الدم.
    1. مزيج 20 ميكرولتر من بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
    2. تجاهل طاف وإضافة 25 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪ و 25 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونيتريل لبيليه. دوامة بقوة ل resuspend الكريات. و resuspend الكريات الصعبة عن طريق كسر عليهم مع نصائح ماصة قبل vortexing ل.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 2 دقيقة في RT. نقل 1 ميكرولتر من طاف (التي تحتوي على البروتينات المستخرجة) على لوحة الهدف MALDI واتركها لتجف على منصة التدفئة 42 درجة مئوية. تابع كما هو موضح في 2.1.2.

3. البكتيرية Identification والمضادات الحيوية اختبار الحساسية مع نظام الميكروبية الآلي

  1. إعداد تعليق البكتيرية لتحديد البكتيريا وAST مع نظام الميكروبية الآلي.
    1. إعداد أنبوب من البلاستيك تحتوي على 3 مل من العقيمة 0.45٪ كلوريد الصوديوم الحل متوافق مع نظام الميكروبية الآلي.
    2. إضافة كمية كافية من بيليه ثقافة الدم في 0.45٪ كلوريد الصوديوم الحل للحصول على تعليق البكتيرية المقابلة لتعكر مكفارلاند من 0،6-0،8. قياس العكارة باستخدام آلة قياس شدة الضوء.
      ملاحظة: حجم بيليه البكتيرية ثقافة الدم يتراوح بين 50 و 200 ميكرولتر لتحقيق التعكر مكفارلاند من 0،6-0،8.
  2. تطعيم الآلي إيجابية الجرام (GP) أو سالبة الجرام (GN) بطاقات لتحديد الهوية وبطاقات AST الآلي لاختبار الحساسية للمضادات الميكروبات من البكتيريا إيجابية الغرام وسلبية الغرام والبكتيريا كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: Identificatioن مع GP أو بطاقات حسن الجوار لا يطبق إذا MALDI-TOF MS تحديد قيمة النتيجة هي> 2. تحقق نقاء تعليق البكتيرية بواسطة subculturing تعليق البكتيرية على أجار الدم (GP وGN) وآغار ماكونكي (GN) لوحات.

4. المضادات الحيوية اختبار حساسية قبل القرص إنتشار الفحص

يوصف فحص القرص نشر من قبل اللجنة الأوروبية على اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات (EUCAST، الإصدار 3.0، إبريل عام 2013، www.eucast.org).

  1. إعداد تعليق البكتيرية لإجراء اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات عن طريق الانتشار فحص القرص.
    1. إعداد أنبوب زجاجي يحتوي على 3 مل من معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل.
    2. إضافة كمية كافية من بيليه ثقافة الدم في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل للحصول على تعليق البكتيرية المقابلة لتعكر مكفارلاند 0.5. قياس العكارة باستخدام آلة قياس شدة الضوء.
      ملاحظة: حجم ثقافة الدمبيليه البكتيرية يتفاوت بين 50 و 200 ميكرولتر لتحقيق التعكر مكفارلاند من 0،6-0،8.
    3. دوامة تعليق البكتيرية.
  2. تلقيح تعليق البكتيرية على أجار مولر هينتون (MH) أو مولر هينتون أجار أجار الحساسية الكائنات الحية (MHF) (MH تستكمل مع 5٪ مزال الفبرين دم الحصان و 20 ملغم / لتر من β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد).
    1. تراجع مسحة القطن المعقمة في تعليق البكتيرية وإزالة بلطف السوائل الزائدة من خلال تحويل مسحة على الجدار الداخلي للأنبوب زجاجي.
    2. نشر تعليق البكتيرية بالتساوي على كامل سطح لوحة أجار MH / MHF بواسطة ينظف في ثلاثة اتجاهات أو باستخدام لوحة المدورة الآلي.
  3. تطبيق الأقراص المضادة للميكروبات على لوحات أجار تلقيح.
    1. تطبيق كثب الأقراص على سطح المجففة لوحات أجار تلقيح يدويا أو باستخدام موزع القرص قابلية.
    2. احتضان لوحة في تيمبي المناسبrature والغلاف الجوي كما هو موضح في اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات طريقة نشر القرص EUCAST (الإصدار 3.0، إبريل عام 2013، www.eucast.org).

5. الآلي PCR القائم على اختبار تشخيص للكشف عن الجرثومة

  1. باستخدام micropipette، ونقل 50 ميكرولتر من بيليه ثقافة الدم إلى قارورة العينة كاشف المتوفرة مع هذه الجرثومة الآلي PCR القائم التشخيص اختبار عدة ودوامة خلال 20 ثانية.
  2. باستخدام micropipette 1 مل، الاستغناء العينة في منفذ عينة من خرطوشة. إدراج خرطوشة في نظام PCR الآلي وبدء الفحص كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في دراسة قام بها Prod'hom وآخرون 15، وقد تم تحليل حبيبات البكتيرية التي حصلت عليها كلوريد الأمونيوم تحلل الطرد المركزي من 122 ثقافة الدم إيجابية من 78 مريضا بواسطة MALDI-TOF MS. من 122 ثقافة الدم إيجابية، 95 (77.9٪) تم التعرف بشكل صحيح على مستوى الأنواع واحدة (0.8٪) عند مستوى جنس. أعطت 26 (21.3٪) الكريات ثقافة الدم المتبقية لا يمكن الاعتماد عليها بواسطة تحديد MALDI-TOF. من بين هؤلاء، 21 كانت البكتيريا موجبة الجرام بما في ذلك 13 العقديات و 5 المخثرة العنقوديات سلبي. الأهم من ذلك، كانت 10 من 13 العقديات مجهولة الهوية العقدية الرئوية التي غالبا ما تمتلك كبسولة يصعب ليز وبالكاد تمييزها عن الأنواع من S. مجموعة هين باستخدام MALDI-TOF MS. لم يتم تحديد خمسة أنواع من البكتريا سالبة الجرام بواسطة MALDI-TOF، من بينها أربعة يصعب ليز مغلفة الأنواع البكتيرية بينهم اثنان الكلبسيلة الرئوية واثنين Haemopنقير النزلية. وهكذا، تم الحصول على التحديد الصحيح بواسطة MALDI-TOF في 78.7٪ من الكريات ثقافة الدم، وهو ما يمثل كفاءة الأداء مقارنة مع 84.1٪ من التعرف عليها من تحديد التقليدي للمستعمرات البكتيرية نمت على لوحات أجار 11.

تم اختبار أداء النظام الميكروبي الآلي لتحديد البكتيريا (ID) وAST على 278 الكريات البكتيرية للثقافة الدم إيجابية للمكورات إيجابية الجرام في العنقودية والبكتيريا سالبة الجرام. وتمت مقارنة هذه النتائج بالنتائج التقليدية التي تم الحصول عليها مع نظام بطاقات الميكروبية الآلي من المستعمرات نمت على لوحات أجار التالية من ثقافة فرعية ثقافة الدم إيجابية على وسائل الإعلام الملائمة 16. التعرف المباشر على استخدام بطاقات الهوية نظام تحديد الميكروبية يمكن استخدامها عند تحديد بيليه البكتيرية بواسطة MALDI-TOF MS قد فشلت. مقارنة مع تحديد النهائي MALDI-TOF MS، وهو التحديد الصحيح معوقد لوحظ بطاقات الهوية نظام تحديد الميكروبية في 99٪ من المعوية، 74٪ من المكورات العنقودية، و 71٪ من الجراثيم سلبية الغرام غير التخمر و 33٪ من الآخرين مكورات إيجابية الجرام. ولوحظ وجود عدم التعرف في 11٪ من مجموع الحالات بينما 8٪ من الكريات البكتيرية لم تذكر الهوية. وقد تم تحليل ما مجموعه 220 الكريات البكتيرية المعوية بما في ذلك 87 و 133 العنقوديات لAST مع النظام الميكروبي الآلي AST AST 580 GN26 وبطاقات 16. تم تحليل النتائج وفقا لتعريفات معينة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لنتائج اتفاق التفسير الذي حدد كاذبة عرضة بمثابة خطأ كبير جدا (VME) ومقاومة كاذبة وخطأ كبير (ME). أظهر AST تم الحصول عليها من التلقيح المباشر للثقافة الدم بيليه مقارنة التلقيح من المستعمرات نمت على لوحات أجار 0.1٪ و 0.3٪ VME ME لالمعوية، و 0.7٪ و 0.1٪ VME ME عن المكورات العنقودية. وبالتالي فإن أداء ASTبطاقات تلقيح مباشرة مع الثقافة الكريات الدم متفقة مع معايير الأداء المقبولة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير.

أداء PCR القائم الحمض النووي التكنولوجيا التضخيم اختبار الجرثومة استهداف منتجع صحي، وميكا والجينات SCC تم تطبيقها مباشرة على المكورات العنقودية الذهبية الثقافة الكريات الدم البكتيرية التي حددها MALDI-TOF MS 17. استنادا 106 حالات، والكشف عن ميثيسيلين مقاومة عرضت حساسية 99٪ وخصوصية 100٪. ومن المثير للاهتمام، ومتوسط ​​الوقت اللازم للإبلاغ عن النتائج تكنولوجيا تضخيم الحمض النووي من ثقافة الدم إيجابية كان يساوي 201 دقيقة (نطاق 100-430) في حين أن متوسط ​​الوقت من تحديد MALDI-TOF أن يقدم نتائج مماثلة كانت تساوي 97 دقيقة (مجموعة 25- 250).

الشكل 1
الرقم 1. قبل وبعد MALDI-TOF العصر. بالمقارنة مع نهج التشخيص التقليدية التي تشمل O / N ثقافة فرعية من العينة، وتحديد MALDI-TOF MS يمكن أن يؤديها في غضون دقائق بعد تسليم العينات إلى المختبر التشخيصي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. سير العمل معالجة ثقافة الدم من أخذ العينات لتحديد MALDI-TOF MS. عندما الثقافات الدم إيجابية، يتم إعداد بيليه البكتيرية بواسطة كلوريد الأمونيوم تحلل الطرد المركزي. ثم يتم استخدام هذا بيليه البكتيرية لتحديد المباشر من قبل MALDI-TOF MS. يمكن الحصول على تحديد MALDI-TOF MS في غضون 30 إلى 60 دقيقة FO النماذج التالية ثقافة الدم إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. العديد من التطبيقات المصب بما في ذلك تلطيخ غرام، MALDI-TOF MS تحديد الهوية، AST باستخدام النظم الآلية و / أو المقايسات نشر القرص والاختبار السريع PCR القائم مثل نقطة اختبار إتمام المشروعات الرعاية (POCT-PCR) للكشف عن الجرثومة يمكن أن يؤديها مباشرة على بيليه البكتيرية ثقافة الدم. الاختبار المباشر من ثقافة البكتيرية الكريات الدم يقلل كثيرا من الوقت بدوره أن يقدم تقريرا حول نتائج ID AST والتي هي محورية لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم. 5fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. كلوريد الأمونيوم بروتوكول تحلل الطرد المركزي يسمح للإعداد بيليه البكتيرية المخصب وتنقيته من الإيجابية المرق ثقافة الدم. تلطيخ غرام من ثقافة الدم إيجابية من الإشريكية القولونية، المكورات العنقودية السلبية المخثرة الرأس والعقدية dysgalactiae يؤديها قبل وبعد إعداد ثقافة الدم بيليه البكتيرية. ولوحظت الأشكال التضاريسية الكلاسيكية من المكورات العنقودية والمكورات العقدية في مجموعات في سلاسل بسهولة في الأصلي ثقافة الدم في مرق من بيليه البكتيرية ثقافة الدم. شريط النطاق = 25 ميكرومتر.= "_ على بياض"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مقارنة مع النهج التشخيص التقليدية ثقافة الدم إيجابية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية باستخدام كلوريد الأمونيوم تحلل نهج الطرد المركزي يقلل من الوقت لتقرير الهوية من قبل 16 إلى 24 ساعة والوقت لتقرير AST قبل 24 إلى 48 ساعة (الشكلان 1 و 3).

مقدمة السريع من العلاج بالمضادات الحيوية المناسبة أمرا حيويا لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم. وبالتالي، الكشف المبكر عن العوامل المعدية في حدود 1 ساعة تليها AST السريع التي تم الحصول عليها في حوالي 8 إلى 16 ساعة يمثل تأثير كبير في التدبير السريري للمرضى الصرف الصحي. وقد تم بالفعل المرتبطة الإبلاغ السريع للغرام تلطيخ مع تأثير كبير على علاج مضادات الميكروبات، وبالتالي مع انخفاض في معدلات الاعتلال بالصبر و6،7 وفيات. ويمكن أن يتم تلطيخ غرام من بيليه البكتيرية ثقافة الدم إلى زيادة حساسية عندما تلطيخ غرام من BLالعود ثقافة مرق هو سلبي أو إيجابي ضعيف (الشكل 4). ومع ذلك، يوصى غرام تلطيخ تجرى على دم الأم ثقافة مرق لمراقبة الأشكال التضاريسية نموذجية مثل المكورات العنقودية في مجموعات أو العقديات في سلاسل. في دراسة استطلاعية حديثة أجريت على 202 حالة إصابة مجرى الدم، وأظهر تحديد MALDI-TOF MS من الكريات ثقافة الدم لها تأثير في العلاج بالمضادات الحيوية في 35.1٪ من الحالات بينما كان غرام وصمة عار لها تأثير إضافي فقط في 20٪ من الحالات 8. ومن المثير للاهتمام، لوحظ الفرق بين الحد الأقصى من تأثير تلطيخ غرام والإبلاغ تحديد MALDI-TOF MS على التدبير العلاجي السريري عندما تم تحديد البكتيريا المرتبطة مع زيادة المقاومة للمضادات الحيوية مثل شركة المرفأ للطاقة المنتجة المعوية بواسطة MALDI-TOF MS. وبالمثل، Martiny آخرون أظهرت أن MALDI-TOF MS التعرف السريع قد ربط التكيف من العلاج بالمضادات الحيوية في 13.4٪ من الحالات في حين أن مسمار بأثر رجعيذ يؤديها Stoneking آخرون اقترح أن التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة المسببة للتجرثم الدم قد يساعد على ضبط العلاج التجريبي في 77٪ من الحالات إما عن طريق ادارتها مضاد حيوي إضافية لا يشملها نظام الأولي أو عن طريق الحد من الطيف من المضادات الحيوية 18،19 . وعلاوة على ذلك، فإن استخدام فحص PCR القائم السريع مثل MRSA الحمض النووي التكنولوجيا التضخيم يلي S. تحديد العنقودية الذهبية بواسطة MALDI-TOF MS من الكريات ثقافة الدم يسمح لتوفير العلاج المضاد الحيوي الأنسب في أقل من 4 ساعات للمرضى الذين يعانون من S. تجرثم الدم الذهبية 17. عند استبعاد المرضى الذين يعانون من حساسية البنسلين، استخدام التكنولوجيا النووية التضخيم حمض يسمح MRSA انخفاض كبير في مكافحة هذه الجرثومة بالمضادات الحيوية إساءة استخدام مثل glycopeptides من 26.1٪ إلى 8.1٪. معا، وتشير هذه البيانات إلى أن التقارير متتابعة السريع لتلطيخ غرام، وتحديد MALDI-TOF MS وسريعة تستند PCR-Assay من الكريات ثقافة الدم آخذة في التحسن بشكل كبير من العلاج بالمضادات الحيوية وبالتالي فإن التدبير العلاجي السريري وكذلك نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.

MALDI-TOF MS سمح التحديد الصحيح 78.7٪ من الكريات ثقافة الدم، وهو أداء جيد جدا مقارنة بمعدل 84.1٪ لتحديد الهوية التي حصل عليها التقليدي MALDI-TOF MS أجريت على مستعمرات نقية نمت على لوحات أجار. أكثر من 50٪ من التهابات مجرى الدم سببها الأنواع البكتيرية مثل المعوية، المكورات العنقودية الذهبية، الزائفة الزنجارية والمكورات المعوية. ويتم تحديد هذه البكتيريا بكفاءة بواسطة MALDI-TOF MS والتي من المرجح التأثير إيجابيا على الأداء الجيد لتحديد MALDI-TOF MS يؤديها مباشرة على الكريات البكتيرية ثقافة الدم. انخفاض مستوى الأداء للتعرف على بعض الأنواع البكتيرية بواسطة MALDI-TOF MS تنفيذها على الكريات ثقافة الدم ويرجع ذلك أساسا إلى عوامل مماثلةمن تلك التي لوحظت لتحديد التقليدي من مستعمرات نقية نمت على لوحات أجار. على سبيل المثال، العديد من الأنواع الميكروبية مثل البكتريا التي تنتمي إلى مجموعة هين والمكورات العنقودية السلبية المخثرة ترتبط ارتباطا وثيقا وحددت مع انخفاض دقة بواسطة MALDI-TOF MS. وعلاوة على ذلك، تكوين معين من جدار الخلية البكتيرية من البكتيريا إيجابية الجرام أو وجود كبسولة كثيفة الملاحظة في الأنواع البكتيرية مثل الكلبسيلة الرئوية يقلل بشكل كبير من كفاءة تحلل وبالتالي أداء تحديد MALDI-TOF MS. وأخيرا، ويرجع ذلك أساسا إلى التمثيل الناقص والفقراء من هذه البكتيريا في قاعدة البيانات MALDI-TOF الأداء المتدني للMALDI-TOF MS للتعرف على البكتيريا اللاهوائية.

قد يكون انخفاض أداء صغيرة من تحديد MALDI-TOF MS من الكريات ثقافة الدم مقارنة مع تحديد التقليدي من مستعمرات نقية بسبب المتبقية بروتين الدم جomponents أو إلى كمية كافية من البكتيريا التي تم الحصول عليها بعد تحلل الطرد المركزي. وبالمثل، فإن الفروق الملحوظة مع بطاقات الميكروبية النظام الآلي تلقيح مباشر مع الكريات ثقافة الدم مقارنة مع أولئك تلقيح مع المستعمرات المعزولة قد تكون ناجمة عن مكونات الثقافة الدم المتبقي مثل البروتينات وخلايا الدم والمركبات المتوسطة الدم التي قد تتداخل مع نمو البكتيريا في بطاقات الآلي النظام الميكروبي وربما يكون لها تأثير كبير على كل من تحديد وAST. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج التي حصل عليها AST النظم الميكروبية الآلي تحتاج إلى أن يتم التحقق من قبل المقايسات نشر القرص أيضا تنفيذ مباشرة على الكريات البكتيرية ثقافة الدم للتحقق من صحة نتائج بعض المضادات الحيوية المعروفة لتقديم اختلافات كبيرة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية. ومع ذلك، التلقيح المباشر للنظام بطاقات الميكروبية الآلي مع الكريات ثقافة الدم ويعرض معرف وAST الأداء الممتاز لكلا المعوية وstaphylococci.

وهكذا، تم التحقق من صحة بيليه البكتيرية التي حصلت عليها كلوريد الأمونيوم تحلل الطرد المركزي الثقافات الدم إيجابية لأداء العديد من التطبيقات المصب مباشرة مما يتيح الإبلاغ السريع عن النتائج الأساسية مثل الهوية وAST في انخفاض كبير TAT مقارنة بالأساليب التقليدية. وعلاوة على ذلك، التطبيقات الإضافية مثل تمديد الطيف lactamases β-(ESBLs) اختبار تم التحقق من صحتها على غرار الطرد المركزي تحلل من ثقافة الدم إيجابية منهجيات 20 مما يوحي بأنها يمكن أن تطبق أيضا على بيليه البكتيرية التي تم الحصول عليها مع بروتوكول وصفها في هذا العمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر فنيي مختبر علم الجراثيم في مركز مستشفى جامعة لوزان لمساعدتهم على تنفيذ التقنيات في المختبر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter