Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

Een snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek kan worden gebruikt als een monster voor toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF, Gram-kleuring, antibiotica gevoeligheidstesten en PCR-gebaseerde test. De resultaten kunnen snel worden meegedeeld aan artsen om de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren.

Abstract

Bloedbaan infecties en sepsis zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. De succesvolle uitkomst van patiënten met bacteriëmie, hangt af van een snelle identificatie van de ziekteverwekker om een ​​optimale behandeling met antibiotica te begeleiden. De analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek kan snel worden uitgevoerd en reeds een aanzienlijke invloed hebben op de antibiotica kuur. Echter, is de nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens nog steeds vereist om de optimale gerichte behandeling stellen. We presenteren hier een eenvoudige en snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek die kan worden gebruikt als een monster voor meerdere essentiële verdere toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF MS, antibiotica gevoeligheidstest (AST) door disc diffusie assay of geautomatiseerde systemen AST en geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische test. De uitvoering van deze verschillende identificatie en AST die rechtstreeks aangebracht op de bloedkweek bacteriële pellets zeer siMilar de prestaties gewoonlijk verkregen uit geïsoleerde kolonies gekweekt op agarplaten. Vergeleken met conventionele benaderingen, de snelle verwerving van een bacteriële pellet vermindert de tijd zowel identificatie en AST rapporteren. Zo kan na bloedkweek positiviteit, identificatie door MALDI-TOF worden gemeld binnen minder dan 1 uur, terwijl de resultaten van AST door geautomatiseerde AST systemen of disc diffusie testen binnen 8 tot 18 uur, respectievelijk. Evenzo kunnen de resultaten van een snelle PCR gebaseerde bepaling de clinici worden meegedeeld minder dan 2 uur na het verslag van een bacteremia. Samen tonen deze resultaten aan dat de snelle voorbereiding van een bloedkweek bacteriële pellet heeft een belangrijke invloed op de identificatie en de AST doorlooptijd en dus op de goede afloop van de patiënten die lijden aan infecties in het bloed.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bloedbaan infecties en sepsis bij gehospitaliseerde patiënten een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Zo is de sterfte gerelateerd aan infecties bloedbaan waargenomen bij ongeveer 14% tot 37% van de gehospitaliseerde patiënt en kan op de intensive care-patiënten 1-3 te verhogen tot 35%. De snelle identificatie van de ziekteverwekker is cruciaal voor een optimale antimicrobiële behandeling te begeleiden en om de goede afloop van de antimicrobiële therapie 4,5 te verhogen. De snelle analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek reeds een aanzienlijke invloed op de aanpassing van antimicrobiële therapie 6,7 maar nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens moet de meest geschikte antibiotica om de patiënt te voorzien. Bijvoorbeeld, verschillende antibiotica behandelingen moeten worden uitgevoerd na bacteriëmie met enterokokken en streptokokken die moeilijk te onderscheiden door Gram-kleuring zijn. Ook de identificatie van de soort Level moet Gram negatieve enterobacteriën detecteren codeert AmpC een chromosomaal gen dat een verhoogde resistentie tegen 8-lactamen β.

Met een positieve bloedkweek, conventionele diagnostische benadering is de ziekteverwekker van verschillende agarplaten, die verscheidene uren extra incubatie voorafgaande identificatie met verschillende benaderingen zoals biochemische tests groei van verschillende selectieve media en geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen vereist subcultuur. De tijd om resultaten van een conventionele diagnostische benadering is van ongeveer 1 tot 3 dagen.

De opkomst van de matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) techniek voor snelle identificatie van micro-organismen is een nieuw hulpmiddel om snel micro-organismen kolonies gekweekt op agarplaten ook direct identificeren van positieve bloed ontvangen kweken (figuur 1) 9-12. The gebruik van MALDI-TOF om een ​​infectueus agens te identificeren van bloedkweken is aanzienlijk verminderd de tijd om de resultaten om een ​​paar minuten in plaats van de uren en dagen die door de traditionele methoden. Zoals besproken door Croxatto e.a.. 13, de efficiëntie van MALDI-TOF identificatie berust op verschillende parameters zoals zuiverheid en hoeveelheid van de micro-organisme. Deze twee criteria worden gemakkelijk verkregen uit afzonderlijke kolonies gekweekt op agarplaten maar vereist een pre-analytische behandeling van bacteriële verrijking en zuivering uit complexe monsters zoals bloed cultuur, die meerdere cellulaire en eiwit componenten die kunnen interfereren met MALDI-TOF identificatie bevatten.

Isolatiemethoden van bloedkweek Verschillende micro-organismen "zijn gebruikt in een aantal studies waaronder saponine of andere milde detergentia vormen voor bacteriële extractie 9,14, serumscheidingsbuisjes methode 10, lysis centrifugatiewerkwijzen 12 (figuur 2) 15 toe ontwikkeld. Dit bloed-kweek pellet preparaat ook een voorbeeld voor andere directe verdere toepassingen zoals Gram kleuring, geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische testen zoals POCT-PCRs voor de snelle detectie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en antibioticum gevoeligheidstests met AST geautomatiseerde systemen en / of disk diffusie assays op agarplaten (figuur 3).

In dit werk beschrijven we de verschillende stappen voor de bereiding van de bloed-kweek bacteriële pellet zoals door Prod'hom e.a.. 15 (figuur 4). We zullen ook Deschrijver de protocollen voor drie van de belangrijkste toepassingen die worden uitgevoerd op de bloedkweek pellet: Identificatie met MALDI-TOF 15, identificatie (ID) en antibiotica gevoeligheidstests (AST) met geautomatiseerde systemen 16 voor Enterobacteriaceae en stafylokokken en geautomatiseerde PCR gebaseerde diagnostische test voor de detectie van MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol is ontwikkeld en gevalideerd na het onderzoek en de ontwikkeling van processen en ethische regels van onze instelling voor een routine-instrument wordt geïmplementeerd.

1 Voorbereiding van een Blood Culture bacteriepellet door Ammonium Chloride Erythrocyte-lyseren Procedure

  1. Bereiding van een positieve bloedkweek voor daaropvolgende centrifugatie.
    1. Steriliseer de bloedkweek dop. Voeg 70% ethanol op de dop van de fles en het branden.
      OPMERKING: Voer deze stap onder een laminaire stroming kap niet uitvoeren.
    2. Beweeg de fles om een ​​laminaire stroming kap. Verzamel 5 ml van de bloedkweek met een 20 G injectiespuit.
    3. Voeg 5 ml van bloedkweek in een 50 ml centrifugebuis die 45 ml steriel water (H2O) en meng het monster.
  2. Bereiding van een bloedkweek bacteriële pellet door centrifugeren lysis.
    1. Centrifugeer het monster bij 1000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    2. Remove de supernatant met een laboratorium vacuümpomp (welke hoofdzakelijk H2O en bloedcellen bevat).
    3. Resuspendeer de pellet in 1 ml van zelfgemaakte ammoniumchloride lyserende oplossing (0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3). Breek de pellet door schrapen en door vortexen de buis en centrifugeer het monster bij 140 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant dat vooral bestaat uit rode bloedcellen puin.
      1. Indien de pellet bleef hemorrhagic, resuspendeer de pellet in 2 ml steriel gedistilleerd en H 2 0 verder lyseren resterende rode bloedcellen en de pellet te wassen. Centrifugeer het monster bij 140 xg gedurende 10 min bij RT en de bovenstaande vloeistof.
    5. Resuspendeer de pellet in 200 ui H2O
  3. Subcultuur van bloedkweek van verschillende selectieve en niet-selectieve agar.
    1. Verzamelen van 1 ml van de bloedkweek met een 20 G injectiespuit.
    2. Te enten 1 druppel bloed cultuur into vier kwadranten op bloed agar, chocolade agar, McConkey agar en Schaedler agar.
    3. Incubeer bij 37 ° C de agar en chocolade-agarplaten in een 5% CO2 atmosfeer, de McConkey agar in een normale atmosfeer en Schaedler agarplaat in anaërobe omstandigheden.
    4. Volg bacteriegroei op de verschillende media.
    5. Controleer voor bacteriële zuiverheid.

2 Identificatie van MALDI-TOF MS

  1. Directe identificatie van het bloed pellet.
    1. Breng 1 pl van het bloed pellet op een MALDI doel bord en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform.
    2. Overlay van het monster met 1 pl 70% mierenzuur en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform.
    3. Overlay het monster met 1 pi MALDI matrix (verzadigde oplossing van α-cyano-4-hydroxykaneelzuur in 50% acetonitril-2,5% trifluorazijnzuur) en laat het drogen op 42 ° C verwarmen platform.
    4. Ga verder met MALDI-TOF MS analyse van een MALDI-TOF MS zoals beschreven door de fabrikant.
    5. Als de identificatie score ongeldig op species niveau (bijvoorbeeld met een score <2), het uitvoeren van een eiwit-extractie van het bloed pellet monster.
  2. Identificatie na eiwit extractie uit de bloedkweek pellet.
    1. Meng 20 ul van het pellet met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder het supernatant en voeg 25 ul van 70% mierenzuur en 25 ul 100% acetonitril de pellet. Vortex krachtig om de pellets mengen. Resuspendeer taaie pellets door het breken van hen neer met pipet tips voordat vortexen.
    3. Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Breng 1 pl van het supernatant (die gewonnen eiwitten bevatten) op een MALDI doel bord en laat het drogen op een 42 ° C verwarmen platform. Ga te werk zoals beschreven in 2.1.2.

3 Bacteriële Identificatie en antibiotica gevoeligheid testen met een geautomatiseerde Microbiële Systeem

  1. Bereiding van een bacteriële suspensie voor bacteriële identificatie en AST een geautomatiseerd microbieel systeem.
    1. Bereid een plastic buisje met 3 ml steriel 0,45% NaCl-oplossing verenigbaar met het automatische microbieel systeem.
    2. Voeg een voldoende hoeveelheid van de bloedkweek pellet in het 0,45% NaCl-oplossing een bacteriesuspensie overeenkomt met een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te verkrijgen. Meet de troebelheid met een densitometer machine.
      Opmerking: Het volume van de bloedkweek bacteriële pellet varieert van 50 tot 200 ul van een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te bereiken.
  2. Inoculeer de geautomatiseerde Gram-positieve (GP) of Gram-negatieve (GN) kaarten voor identificatie en geautomatiseerde AST kaarten antimicrobiële gevoeligheidstest van Gram-positieve kokken en Gram-negatieve bacteriën zoals beschreven door de fabrikant.
    OPMERKING: Identification met de huisarts of GN-kaarten wordt niet toegepast als MALDI-TOF MS identificatie score waarde> 2. Controleer de zuiverheid van de bacteriële suspensie door een subcultuur van de bacteriële suspensie op bloed-agar (GP en GN) en MacConkey agar (GN) platen.

4 antibiotica gevoeligheid testen door Disk Diffusion Assay

De disk diffusie test wordt beschreven door de Europese commissie voor tests op antimicrobiële resistentie (EUCAST, Versie 3.0, april 2013, www.eucast.org).

  1. Voorbereiding van een bacteriële suspensie voor antimicrobiële gevoeligheid getest door disk diffusie test uit te voeren.
    1. Bereid een glazen buis bevattende 3 ml steriele 0,9% NaCl-oplossing.
    2. Voeg een voldoende hoeveelheid van de bloedkweek pellet in 0,9% NaCl-oplossing een bacteriesuspensie overeenkomt met een McFarland troebelheid van 0,5 te verkrijgen. Meet de troebelheid met een densitometer machine.
      Opmerking: Het volume van de bloedkweekbacteriële pellet varieert van 50 tot 200 ul van een McFarland troebelheid van 0,6 tot 0,8 te bereiken.
    3. Vortex de bacteriële suspensie.
  2. Inoculatie bacteriesuspensie op Mueller-Hinton agar (MH) of Mueller-Hinton agar-agar veeleisende organismen (MHF) (MH gesupplementeerd met 5% gedefibrineerd paardenbloed en 20 mg / L van β-nicotinamide adenine dinucleotide).
    1. Dompel een steriel wattenstaafje in de bacteriële suspensie en verwijder voorzichtig overtollige vloeistof door de wattenstaafje op de binnenwand van de glazen buis.
    2. Spreid de bacteriële suspensie gelijkmatig op het gehele oppervlak van de MH / MHF agarplaat door zwabberen in drie richtingen, of met een geautomatiseerde plaat rotator.
  3. Toepassing van antimicrobiële schijven op geënt agarplaten.
    1. Breng nauwkeurig de schijven op het oppervlak van de gedroogde geïnoculeerde agar platen handmatig of met een gevoeligheid schijf dispenser.
    2. Incubeer de plaat op de juiste temperatuur en sfeer, zoals beschreven in de antimicrobiële gevoeligheid getest EUCAST disk diffusie methode (Versie 3.0, april 2013, www.eucast.org).

5 Geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische test voor de detectie van MRSA

  1. Met een micropipet, overdracht 50 ul van de bloedkweek pellet in de monsterhouder reagensflesje voorzien MRSA geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische testkit en vortex gedurende 20 seconden.
  2. Met behulp van een 1 ml micropipet, bereid het monster in de monster-poort van de patroon. Plaats de cartridge in de geautomatiseerde PCR-systeem en start de test zoals beschreven door de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In de studie van Prod'hom e.a.. 15, werden bacteriële pellets verkregen door ammoniumchloride lysis centrifugering van 122 positieve bloedkweek van 78 patiënten geanalyseerd met MALDI-TOF MS. Van de 122 positieve bloedkweek, 95 (77,9%) werden correct geïdentificeerd op het niveau van soorten en een (0,8%) op het genus-niveau. De overige 26 (21,3%) bloedkweek pellets gaven geen betrouwbare identificatie door MALDI-TOF. Van deze 21 waren gram-positieve bacteriën, waaronder 13 streptokokken en 5 coagulase-negatieve stafylokokken. Belangrijk, 10 van de 13 geïdentificeerde streptokokken Streptococcus pneumoniae die bezit vaak een moeilijk te lyseren capsule en nauwelijks onderscheiden van soorten van de S. mitis groep met behulp van MALDI-TOF MS. Vijf Gram-negatieve bacteriën werden niet geïdentificeerd door MALDI-TOF, waaronder vier moeilijk te lyseren ingekapselde bacteriesoorten waaronder twee Klebsiella pneumoniae en twee Haemophilus influenzae. Aldus correcte identificatie door MALDI-TOF werd verkregen in 78,7% van bloedkweek pellets, die een efficiënte uitvoering vertegenwoordigt vergelijking met 84,1% van identificatie verkregen uit conventionele identificatie van bacteriële kolonies gekweekt op agarplaten 11.

De werking van het automatische systeem voor bacteriële microbiële identificatie (ID) en AST werd getest op 278 bacteriële pellets positieve bloedkweek voor Gram-positieve kokken in cluster en Gram-negatieve bacteriën. Deze resultaten werden vergeleken met conventionele verkregen met het geautomatiseerde systeem microbiële kaarten van kolonies gekweekt op agarplaten na subcultuur positieve bloedkweek geschikte media 16. Directe identificatie met microbieel identificatiesysteem ID kaarten kunnen worden gebruikt als identificatie van de bacteriële pellet door MALDI-TOF MS is mislukt. Vergeleken met een definitieve identificatie van MALDI-TOF MS, een correcte identificatie metmicrobieel identificatiesysteem identiteitskaart werd waargenomen bij 99% van Enterobacteriaceae, 74% van stafylokokken, 71% van de niet-fermentatieve Gram-negatieve bacteriën en 33% andere Gram-positieve kokken. Een verkeerde identificatie werd waargenomen in 11% van de gevallen dat 8% van bacteriële pellets gaven geen identificatie. Een totaal van 220 bacteriële pellets zoals 87 Enterobacteriaceae en 133 staphylococcen werden geanalyseerd AST met automatische microbieel systeem AST GN26 en AST 580 kaarten 16. De resultaten werden geanalyseerd volgens de definities gegeven door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor de interpretatieve akkoord resultaten, die een valse gevoelig gedefinieerd als een zeer grote fout (VME) en een valse resistent als een grote fout (ME). AST verkregen uit directe inoculatie van bloedkweek pellet vergelijking met inenting van kolonies gekweekt op agarplaten liet 0,1% VME en 0,3% ME voor Enterobacteriaceae, en 0,7% VME en 0,1% ME voor stafylokokken. Dus de prestaties van ASTkaarten rechtstreeks geënt met bloed cultuur pellets zijn in overeenstemming met de door de FDA aanvaard prestatiecriteria.

De resultaten van de PCR-gebaseerde nucleïnezuur amplificatie techniek MRSA proef gericht op de spa, mecA en SCC-genen rechtstreeks op Staphylococcus aureus bloedkweek bacteriële pellets die door MALDI-TOF MS 17. Gebaseerd op 106 gevallen de detectie van methicilline resistentie vertoonden een gevoeligheid van 99% en een 100% specificiteit. Interessant is de mediane tijd tot het nucleïnezuur amplificatie technologie resultaten van bloedkweek positiviteit bericht was gelijk aan 201 min (bereik 100-430) dat de mediane tijd van MALDI-TOF identificatie om bericht vergelijkbare resultaten gelijk aan 97 min (bereik 25- 250).

Figuur 1
Figuur 1 voor en na de MALDI-TOF-tijdperk. Vergeleken met conventionele diagnostische benaderingen die een O / N subcultuur van de steekproef, kunt MALDI-TOF MS identificatie worden uitgevoerd binnen een paar minuten na monsters levering aan het diagnostisch laboratorium. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 Workflow van bloedkweek verwerking van de monsterneming tot MALDI-TOF MS identificatie. Bij bloedkweken positief zijn, is een bacteriële pellet bereid door ammoniumchloride lysis centrifugeren. Deze bacteriële pellet wordt vervolgens gebruikt als directe identificatie door MALDI-TOF MS. MALDI-TOF MS geïndentificeerd worden binnen 30 tot 60 min fo llowing bloedkweek positiviteit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3 Vele verdere toepassingen zoals Gram kleuring, MALDI-TOF MS identificatie, AST middels geautomatiseerde systemen en / of disk diffusie assays en snelle PCR-gebaseerde testen zoals point of care tests PCRs (POCT-PCR) voor de detectie van MRSA kan worden direct uitgevoerd op het bloed cultuur bacteriepellet. Direct testen van de bacteriële bloedkweek pellets verminderen significant de turn-around tijd om ID en AST resultaten te melden die is cruciaal voor de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 De ammoniumchloride lysis centrifugatie protocol maakt de bereiding van een verrijkte en gezuiverde bacteriële pellet van positieve bloedkweek bouillon. Gramkleuring positieve bloedkweek van Escherichia coli, coagulase-negatieve Staphylococcus capitis en Streptococcus dysgalactiae uitgevoerd vóór en na de bereiding van de bloedkweek bacteriële pellet. De klassieke morfologie van stafylokokken in clusters en streptokokken in ketens zijn gemakkelijker waargenomen in de inheemse bloed cultuurbouillon dan in het bloed cultuur bacteriepellet. Schaalbalk = 25 um.= "_blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vergeleken met conventionele positieve bloedkweek diagnostische benaderingen snelle verwerving van een bacteriële pellet met de ammoniumchloride lysis centrifugatie benadering verminderen de tijd tot identificatie rapporteren door 16 tot 24 uur en de tijd AST door 24 rapporteren aan 48 uur (Figuren 1 en 3).

Snelle invoering van geschikte antibiotica therapie is van cruciaal belang voor de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren. Aldus vroege identificatie van de infectieuze agentia binnen 1 uur gevolgd door een snelle AST verkregen in ongeveer 8 tot 16 uur een belangrijke impact op de klinische behandeling van septische patiënten. De snelle melding van Gram-kleuring werd reeds geassocieerd met een grote impact op antimicrobiële therapie en dus met een verlaging van de morbiditeit en mortaliteit 6,7. De Gram kleuring van de bloedkweek bacteriële pellet kan worden uitgevoerd om de gevoeligheid te verhogen wanneer de Gram kleuring van het blood kweekbouillon negatief of zwak positief (figuur 4). Echter, Gramkleuring uitgevoerd op de inheemse bloed cultuurbouillon aanbevolen om typische morfologie zoals stafylokokken in clusters of streptokokken in ketens te observeren. In een recente prospectieve studie uitgevoerd op 202 gevallen van septicemie, MALDI-TOF MS identificatie van bloedkweek pellets vertoonden effecten op antibiotica in 35.1% van de gevallen dat Gramkleuring slechts een extra effect in 20% van de gevallen 8. Interessant is dat het maximale verschil van invloed tussen Gram kleuring en MALDI-TOF MS identificatie rapportage over klinische behandeling werd waargenomen bij bacteriën geassocieerd met een verhoogde resistentie tegen antibiotica, zoals AmpC-producerende Enterobacteriaceae werden geïdentificeerd door MALDI-TOF MS. Evenzo Martiny et al. Blijkt dat MALDI-TOF MS snelle identificatie aanpassing van de antibiotische therapie kan vast in 13.4% van de gevallen dat een retrospectieve study uitgevoerd door Stoneking et al. voorgesteld een snelle identificatie van micro-organismen veroorzaken bacteremia kunnen helpen aanpassen van de empirische therapie bij 77% van de gevallen hetzij door toedienen van een extra antibioticum niet onder de initiële behandeling of door de spectrum van antibiotica 18,19 . Bovendien is het gebruik van een snelle PCR gebaseerde assay zoals het nucleïnezuur amplificatie techniek MRSA volgende S. aureus identificatie door MALDI-TOF MS van bloedkweek pellets maken het meest geschikte antibioticum therapie in minder dan 4 uur voor patiënten met S. aureus bacteriëmie 17. Bij uitzondering patiënten met penicilline allergie, het gebruik van de nucleïnezuur amplificatie techniek MRSA toegestaan ​​een significante reductie van anti-MRSA antibiotica misbruik zoals glycopeptiden van 26,1% tot 8,1%. Tezamen suggereren deze gegevens dat snelle sequentiële melding van Gram-kleuring, MALDI-TOF MS geïdentificeerd en snel PCR-gebaseerde assay uit bloedkweek pellets zijn een aanzienlijke verbetering van de behandeling met antibiotica en dus de klinische behandeling en de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed.

MALDI-TOF MS toegestaan ​​een 78,7% correcte identificatie van bloedkweek pellets, wat een zeer goede prestatie in vergelijking met een percentage van 84,1% identificatie verkregen door gebruikelijke MALDI-TOF MS uitgevoerd op zuivere kolonies gekweekt op agarplaten. Meer dan 50% van bloedbaan infecties veroorzaakt door bacteriële soorten zoals Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en enterococci. Deze bacteriën worden efficiënt geïdentificeerd door MALDI-TOF MS die waarschijnlijk positief beïnvloeden de goede prestaties van MALDI-TOF MS identificatie uitgevoerd direct aan bloedkweek bacteriële pellets. De lage prestaties voor de identificatie van een aantal bacteriesoorten door MALDI-TOF MS uitgevoerd op bloed cultuur pellets is voornamelijk te wijten aan soortgelijke factorendan die waargenomen voor de conventionele identificatie van zuivere kolonies gekweekt op agarplaten. Bijvoorbeeld, verscheidene microbiële species zoals streptokokken behorende tot de groep mitis en coagulase-negatieve staphylococcen zijn nauw verwant en geïdentificeerd met lage nauwkeurigheid door MALDI-TOF MS. Bovendien is een bepaalde samenstelling van de bacteriële celwand van Gram-positieve bacteriën en de aanwezigheid van een dichte capsule waargenomen in bacteriële soorten zoals Klebsiella pneumoniae significant de lysis efficiëntie en dus de prestaties van MALDI-TOF MS identificatie verlagen. Tenslotte, de slechte prestaties van MALDI-TOF MS voor de identificatie van anaërobe bacteriën is vooral door onvolledige en slechte weergave van deze bacteriën in de MALDI-TOF database.

De kleine verminderde werking van MALDI-TOF MS identificatie van bloedkweek pellets in vergelijking met conventionele identificatie van pure kolonies kan door restanten bloedeiwit components of een onvoldoende hoeveelheid bacteriën verkregen na lysis-centrifugatie. Ook de waargenomen met de automatische microbieel systeem cards direct geïnoculeerd met bloedkweek pellets vergeleken met die geïnoculeerd met witte kolonies worden veroorzaakt door resterende bloedkweek componenten zoals eiwitten, bloedcellen en medium verbindingen die kunnen interfereren met bacteriële groei in de verschillen geautomatiseerd microbieel systeem kaarten en kan een aanzienlijke impact hebben op zowel identificatie en AST hebben. Bovendien, de AST resultaten die geautomatiseerde microbiële systemen moeten worden gecontroleerd door disk diffusie testen ook direct uitgevoerd op bloedkweek bacteriële pellets de resultaten van sommige antibiotica bekend significante verschillen bieden vergeleken met conventionele benaderingen te valideren. Echter, directe inoculatie van het automatische systeem microbiële kaarten met bloedkweek pellets weer uitstekend ID en AST prestaties voor zowel Enterobacteriaceae en staphylococci.

Aldus heeft de bacteriële pellet verkregen door ammoniumchloride lysis centrifugatie positieve bloedkweken gevalideerd meerdere verdere toepassingen waarmee snel rapportering van belangrijke resultaten zoals ID en AST in een significant verminderde TAT vergelijking met conventionele benaderingen direct uitvoeren. Bovendien zijn extra toepassingen, zoals extended-spectrum β-lactamasen (ESBL's) testen gevalideerd op gelijksoortige lysis centrifugeren van positieve bloedkweek methodologieën 20 suggereert dat ze ook kunnen worden toegepast op de bacteriële pellet verkregen met de in dit werk beschreven protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken de technici van de bacteriologie laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Centrum van Lausanne voor hun hulp om de technieken in het laboratorium uit te voeren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter