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Immunology and Infection

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

Una rapida preparazione pellet batterico da una emocoltura positiva può essere utilizzato come campione per le applicazioni quali l'identificazione mediante MALDI-TOF, colorazione di Gram, test di sensibilità agli antibiotici e test di PCR-based. I risultati possono essere tempestivamente ai medici di migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Abstract

Infezioni del sangue e sepsi sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Il buon esito dei pazienti affetti da batteriemia dipende da una rapida identificazione dell'agente infettivo per guidare il trattamento antibiotico ottimale. L'analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva può essere rapidamente condotto e già un impatto significativamente il regime antibiotico. Tuttavia, l'accurata identificazione dell'agente infettivo è ancora necessaria per stabilire il trattamento ottimale mirato. Presentiamo qui una preparazione pellet batterico semplice e veloce da una cultura del sangue positivo che può essere utilizzato come campione per diverse applicazioni a valle essenziali quali l'identificazione mediante MALDI-TOF MS, test di sensibilità agli antibiotici (AST) mediante saggio di diffusione del disco o sistemi automatizzati AST e automatizzato PCR-based test diagnostici. Le prestazioni di questi diversi sistemi di identificazione e AST applicati direttamente sulle emocolture pellet batterico è molto SImilar alla performance, normalmente ottenuto da colonie isolate cresciute su piastre di agar. Rispetto ai metodi tradizionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico riduce notevolmente il tempo di segnalare sia l'identificazione e AST. Così, seguendo la cultura positività del sangue, l'identificazione mediante MALDI-TOF può essere segnalato in meno di 1 ora, mentre i risultati di AST da sistemi automatizzati o AST test di diffusione del disco entro 8 a 18 ore, rispettivamente. Allo stesso modo, i risultati di un test rapido basato su PCR possono essere comunicati ai medici meno di 2 ore a seguito della relazione di una batteriemia. Insieme, questi risultati dimostrano che la rapida preparazione di un pellet batterico cultura del sangue ha un impatto significativo sulla identificazione e AST turnaround tempo e quindi sul buon esito dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Introduction

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Infezioni del sangue e sepsi nei pazienti ospedalizzati sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Così, la mortalità correlata al flusso sanguigno infezioni si osserva in circa il 14% al 37% dei pazienti ricoverati in ospedale e può aumentare fino al 35% in unità di terapia intensiva dei pazienti 1-3. La rapida identificazione dell'agente infettivo è fondamentale per guidare il trattamento antimicrobico ottimale e di aumentare il buon esito della terapia antimicrobica 4,5. La rapida analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva ha già un impatto significativo sull'adattamento della terapia antimicrobica 6,7 ma accurata identificazione dell'agente infettivo è tenuto a fornire il trattamento antibiotico più adatto ai pazienti. Per esempio, diversi regimi di trattamento antibiotico deve essere attuato a seguito batteriemia con enterococchi e streptococchi che sono difficili da distinguere da colorazione di Gram. Allo stesso modo, l'identificazione alle specie Level è tenuto a rilevare enterobatteri Gram negativi che codifica per una cromosomico AMPC gene che conferisce una maggiore resistenza ai β-lattamici 8.

Con una emocoltura positiva, l'approccio diagnostico convenzionale è di sottocultura l'agente infettivo su diverse piastre di agar, che richiede diverse ore di incubazione supplementare prima identificazione con vari metodi tra cui i test biochimici, la crescita su diversi terreni selettivi e di sistemi di identificazione microbica automatizzati. Il tempo per i risultati di un approccio diagnostico convenzionale è di circa 1 a 3 giorni.

L'emergere della tecnologia matrix-assisted laser desorbimento / spettrometria di massa a ionizzazione a tempo di volo (MALDI-TOF) per una rapida identificazione dei microrganismi ha fornito un nuovo strumento per identificare rapidamente microrganismi da colonie cresciute su piastre di agar, ma anche direttamente dal sangue positivo culture (Figura 1) 9-12. The l'uso di MALDI-TOF per identificare un agente infettivo da colture di sangue ha ridotto significativamente il tempo di risultati per alcuni minuti invece delle ore e dei giorni richiesti dai metodi tradizionali. Come discusso da Croxatto et al. 13, l'efficienza di identificazione MALDI-TOF si basa su diversi parametri compresa la purezza e la quantità del microrganismo. Questi due criteri sono facilmente ottenuti da colonie discrete cresciute su piastre di agar, ma richiedevano un trattamento pre-analitico per l'arricchimento batterica e purificazione da campioni complessi come la cultura del sangue, che contengono più componenti cellulari e proteine ​​che possono interferire con l'identificazione MALDI-TOF.

Metodi di isolamento vari microrganismi 'di coltura sangue sono stati utilizzati in un certo numero di studi inclusi saponina o altro metodo detergenti delicati per l'estrazione batterica 9,14, siero metodo separatore 10, lisi metodi di centrifugazione 12 (Figura 2) 15. Questa preparazione sangue-cultura pellet anche fornire un campione per altre applicazioni a valle diretti come colorazione di Gram, test automatizzati basati sulla PCR diagnostici come POCT-PCR per il rilevamento rapido di meticillino-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), e test di sensibilità agli antibiotici con sistemi automatizzati di AST e / o mediante saggi di diffusione del disco su piastre di agar (Figura 3).

In questo lavoro, descriviamo le fasi per la preparazione del pellet batterico sangue-cultura come spiegato da Prod'hom et al. 15 (Figura 4). Ci sarà anche descrivano i protocolli per tre delle principali applicazioni che possono essere eseguite sul pellet cultura del sangue: Identificazione mediante MALDI-TOF 15, di identificazione (ID) e test di sensibilità agli antibiotici (AST) con i sistemi automatizzati 16 per Enterobacteriaceae e stafilococchi e PCR-automatizzato test diagnostico basato per la rilevazione di MRSA 17.

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Protocol

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Questo protocollo è stato sviluppato e validato seguendo i processi di ricerca e sviluppo e le regole etiche della nostra istituzione, prima di essere implementato come strumento di routine.

1 Preparazione di una cultura Sangue batterica pellet da Ammonio Cloruro Procedura eritrociti-lisi

  1. Preparazione di una coltura ematica positiva per la successiva centrifugazione.
    1. Sterilizzare il tappo cultura del sangue. Aggiungere etanolo al 70% sul tappo della bottiglia e bruciarlo.
      NOTA: Non eseguire questo passaggio sotto una cappa a flusso laminare.
    2. Spostare la bottiglia di una cappa a flusso laminare. Raccogliere 5 ml della coltura di sangue con una siringa da 20 G.
    3. Aggiungere i 5 ml di coltura di sangue in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 45 ml di acqua sterile (H 2 O) e miscelare il campione.
  2. Preparazione di una coltura sangue pellet batterico per lisi centrifugazione.
    1. Centrifugare il campione a 1000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
    2. Remove il surnatante (contenente principalmente H 2 O e cellule del sangue) con una pompa a vuoto laboratorio.
    3. Risospendere il pellet in 1 ml di fatto in casa di cloruro di ammonio Soluzione di Lisi (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO mm 3). Abbattere il pellet mediante raschiatura e vortex la provetta e centrifugare il campione a 140 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Eliminare il surnatante contenente principalmente detriti globuli rossi.
      1. Se il pellet rimasto emorragica, risospendere il pellet in 2 ml di acqua distillata sterile e H 2 0 per lisare i globuli rossi ulteriori residui e lavare il pellet. Centrifugare il campione a 140 xg per 10 min a RT e scartare il surnatante.
    5. Risospendere il pellet in 200 ml di H 2 O
  3. Subculture della cultura sangue su vari supporti agar selettivo e non selettivo.
    1. Raccogliere 1 ml della cultura di sangue con una siringa da 20 G.
    2. Inoculare 1 goccia di sangue cultura into quattro quadranti su agar sangue, agar cioccolato, McConkey agar e agar Schaedler.
    3. Incubare a 37 ° C l'agar sangue e piastre di agar cioccolato in una atmosfera di CO 2 5%, l'agar McConkey in ambiente normale, e la piastra di agar Schaedler in condizioni anaerobiche.
    4. Seguire la crescita batterica sui diversi media.
    5. Verificare la purezza batterica.

2 Identificazione mediante MALDI-TOF MS

  1. Identificazione diretta dal pellet sangue.
    1. Trasferire 1 ml di pellet di sangue su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C.
    2. Sovrapporre il campione con 1 ml del 70% di acido formico e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C.
    3. Sovrapporre il campione con 1 ml di matrice MALDI (soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido nel 50% acetonitrile-2.5% di acido trifluoroacetico) e lasciarlo asciugare su una piattaforma C di riscaldamento 42 °.
    4. Procedere alla MALDI-TOF MS analisi di un sistema MALDI-TOF MS, come descritto dai produttori.
    5. Se il punteggio di identificazione non è valida a livello di specie (ad esempio con un punteggio <2), eseguire una estrazione di proteine ​​del campione di pellet di sangue.
  2. Identificazione dopo l'estrazione di proteine ​​dal sangue pellet cultura.
    1. Mescolare 20 ml di pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
    2. Eliminare il surnatante e aggiungere 25 ml di 70% di acido formico e 25 ml di acetonitrile 100% al pellet. Vortex vigorosamente per risospendere il pellet. Risospendere pellet difficili da rompere giù con puntali delle pipette prima di vortex.
    3. Centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 1 ml di surnatante (che contengono proteine ​​estratte) su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C. Procedere come descritto in 2.1.2.

3. batterica Identificazione e antibiotici test di suscettibilità con un sistema automatizzato microbica

  1. Preparazione di una sospensione batterica di identificazione batterica e AST con un sistema automatizzato microbica.
    1. Preparare una provetta di plastica contenente 3 ml di soluzione sterile 0,45% NaCl compatibile con il sistema automatizzato microbica.
    2. Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl 0,45% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro.
      NOTA: Il volume del pellet batterico coltura sangue varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8.
  2. Inoculare i Gram-positivi (GP) o Gram-negativi (GN) schede automatizzate per l'identificazione e le schede AST automatizzati per i test di sensibilità antimicrobica di cocchi Gram-positivi e Gram-negativi batteri come descritto dal produttore.
    NOTA: IDENTIFICAZIONEn con il medico di famiglia o carte GN non si applica se il MALDI-TOF MS valore punteggio di identificazione è> 2. Controllare la purezza della sospensione batterica subcoltura la sospensione batterica su agar sangue (GP e GN) e MacConkey agar (GN) piatti.

4. antibiotici test di suscettibilità da Disk Diffusion Assay

Il test di diffusione del disco è descritto dal Comitato europeo sui test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST, versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org).

  1. Preparazione di una sospensione batterica di eseguire il test di sensibilità antimicrobica mediante saggio disco-diffusione.
    1. Preparare un tubo di vetro contenente 3 ml di soluzione di NaCl allo 0,9% sterile.
    2. Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland 0,5. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro.
      NOTA: Il volume della coltura sanguepellet batterico varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8.
    3. Agitare la sospensione batterica.
  2. Inoculazione di sospensione batterica su agar Mueller-Hinton (MH) o Mueller-Hinton agar-agar esigenti organismi (MHF) (MH integrato con 5% di sangue defibrinato di cavallo e 20 mg / L di β-nicotinamide adenina dinucleotide).
    1. Immergere un tampone di cotone sterile nella sospensione batterica e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso ruotando il tampone sulla parete interna del tubo di vetro.
    2. Distribuire la sospensione batterica in modo uniforme su tutta la superficie della piastra di agar MH / MHF tamponando in tre direzioni o utilizzando una piastra rotatore automatizzato.
  3. Applicazione di dischi antimicrobici su piastre di agar inoculate.
    1. Applicare da vicino i dischi sulla superficie delle piastre di agar inoculate secchi manualmente o utilizzando un dispenser disco di suscettibilità.
    2. Incubare la piastra a tempe appropriatoratura e l'atmosfera come descritto nel metodo di diffusione su disco EUCAST test di suscettibilità antimicrobica (Versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org).

5. Automated PCR-based Test diagnostico per la rilevazione di MRSA

  1. Usando una micropipetta, trasferire 50 ml di pellet cultura di sangue nel flacone di reagente esempio fornito con l'MRSA automatizzato kit diagnostico basato su PCR e vortex per 20 sec.
  2. Usando una micropipetta 1 ml, dispensare il campione nella porta campione della cartuccia. Inserire la cartuccia nel sistema PCR automatico e avviare il test come descritto dal produttore.

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Representative Results

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Nello studio effettuato da Prod'hom et al. 15, pellet batterici ottenuti da cloruro di ammonio lisi centrifugazione di 122 emocoltura positiva da 78 pazienti sono stati analizzati mediante MALDI-TOF MS. Su 122 emocoltura positiva, 95 (77,9%) sono stati correttamente identificati a livello di specie e uno (0,8%) a livello di genere. I restanti 26 (21,3%) Pellets emocoltura non hanno dato un'identificazione affidabile mediante MALDI-TOF. Tra questi, 21 sono stati i batteri Gram-positivi, tra cui 13 streptococchi e 5 stafilococchi coagulasi negativi. È importante sottolineare che, 10 su 13 streptococchi non identificato erano Streptococcus pneumoniae, che spesso possiedono una capsula difficile da Lyse e sono difficilmente distinguibili da specie del S. gruppo mitis con MALDI-TOF MS. Cinque batteri Gram-negativi non sono stati identificati mediante MALDI-TOF, tra cui quattro difficili da Lyse incapsulato specie batteriche tra cui due Klebsiella pneumoniae e due Haemopilo influenzae. Pertanto, la corretta identificazione mediante MALDI-TOF è stato ottenuto nel 78,7% di sangue pellet cultura, che rappresenta un efficace svolgimento rispetto al 84,1% di identificazione ottenuti dalla individuazione convenzionale di colonie batteriche cresciute su piastre di agar 11.

Le prestazioni del sistema microbico automatico di identificazione batterica (ID) e per AST stato testato su 278 pellet batterici di coltura sangue positive per cocchi gram-positivi in ​​cluster e batteri Gram-negativi. Questi risultati sono stati confrontati con i risultati ottenuti con le tradizionali schede di sistema microbiche automatizzati da colonie cresciute su piastre di agar seguenti sottocultura di emocoltura positiva su supporti adeguati 16. Identificazione diretta mediante microbici carte d'identità al sistema di identificazione può essere utilizzato quando l'identificazione del pellet batterico mediante MALDI-TOF MS è fallito. Rispetto ad una identificazione finale mediante MALDI-TOF MS, una corretta identificazione conmicrobiche carte d'identità al sistema di identificazione è stata osservata nel 99% delle Enterobacteriaceae, il 74% degli stafilococchi, il 71% dei batteri Gram-negativi non-fermentanti e il 33% di altri cocchi Gram-positivi. Una errata identificazione è stata osservata nel 11% dei casi totali, mentre l'8% dei pellet batterici ha dato nessuna identificazione. Un totale di 220 pellet batterici tra cui 87 Enterobacteriaceae e 133 stafilococchi sono stati analizzati per AST con il sistema automatizzato microbica AST GN26 e AST 580 carte 16. I risultati sono stati analizzati in base alle definizioni date dalla US Food and Drug Administration (FDA) per i risultati accordo interpretative, che ha definito una falsa suscettibile come un errore molto grave (VME) e una falsa resistente come un errore grave (ME). AST ottenuto da inoculazione diretta della cultura sangue pellet rispetto a inoculazione di colonie cresciute su piastre di agar ha mostrato 0,1% e 0,3% VME ME per Enterobacteriaceae, e il 0,7% e il 0,1% VME ME per stafilococchi. Così la prestazione di ASTcarte inoculati direttamente con sangue pellet cultura sono in accordo con i criteri di prestazione accettati dalla FDA.

Le prestazioni del test MRSA tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici PCR-based targeting per il centro benessere, mecA e geni SCC è stato applicato direttamente su Staphylococcus aureus emocolture pellet batterici identificati mediante MALDI-TOF MS 17. Sulla base di 106 casi, la diagnosi della resistenza alla meticillina esibito una sensibilità del 99% e una specificità del 100%. È interessante notare che, il tempo mediano di riferire i risultati della tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici da emocoltura positività è stato pari a 201 minuti (range 100-430), mentre il tempo mediano dalla identificazione MALDI-TOF per segnalare risultati analoghi era pari a 97 minuti (range 25- 250).

Figura 1
Epoca Figura 1 pre e post-MALDI-TOF. Rispetto agli approcci diagnostici convenzionali che includono un O / N sottocultura del campione, l'identificazione MALDI-TOF MS può essere eseguita in pochi minuti seguenti esempi di consegna al laboratorio diagnostico. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 Flusso di lavoro di elaborazione culturale sangue dal campionamento all'identificazione MALDI-TOF MS. Quando emocolture sono positive, il pellet batterico è preparato da cloruro di ammonio lisi centrifugazione. Questo pellet batterico viene quindi utilizzato per l'identificazione diretta mediante MALDI-TOF MS. Identificazione MALDI-TOF MS può essere ottenuto entro 30 a 60 min fo llowing emocoltura positività. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 Molte applicazioni a valle, tra cui la colorazione di Gram, l'identificazione MALDI-TOF MS, AST utilizzando sistemi automatizzati e / o test di diffusione su disco e rapido test PCR-based, come punto di PCR test cura (POCT-PCR) per la rilevazione di MRSA può essere eseguita direttamente sul pellet batterico cultura del sangue. Diretto test da parte degli batteriche pellet emocolture ridurre in modo significativo il tempo di turn-around per segnalare ID e AST risultati che è fondamentale per migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Il protocollo di lisi centrifugazione cloruro di ammonio consente la preparazione di un pellet batterico arricchito e purificato da positivi brodi di coltura sangue. Colorazione di Gram di emocoltura positiva di Escherichia coli, Staphylococcus coagulasi negativi capitis e Streptococcus dysgalactiae eseguita prima e dopo la preparazione dei la cultura del sangue pellet batterico. Le morfologie classiche di stafilococchi e streptococchi in cluster in catene sono più facilmente osservate nella cultura nativo sangue brodo rispetto al pellet batterico cultura del sangue. Barra della scala = 25 micron.= "_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Rispetto a emocoltura positiva approcci diagnostici convenzionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico utilizzando il cloruro di lisi approccio centrifugazione ammonio ridurre il tempo di segnalare l'identificazione da 16 a 24 ore e il tempo di riferire AST per 24 per 48 ore (figure 1 e 3).

Rapida introduzione di un'appropriata terapia antibiotica è fondamentale per migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue. Così, l'identificazione precoce degli agenti infettivi nel raggio di 1 ora seguita da un rapido AST ottenuto in circa 8 a 16 ore rappresenta un forte impatto nella gestione clinica dei pazienti settici. La rapida segnalazione di colorazione di Gram è già stato associato con un grande impatto sulla terapia antimicrobica e quindi con una diminuzione della morbilità del paziente e 6,7 mortalità. La colorazione di Gram del pellet batterico cultura sangue può essere fatto per aumentare la sensibilità quando la colorazione di Gram del blood brodo di coltura è negativa o debolmente positivi (Figura 4). Tuttavia, la colorazione di Gram eseguita sul sangue nativo cultura brodo si raccomanda di osservare morfologie tipiche come stafilococchi o streptococchi in cluster in catene. In un recente studio prospettico effettuato su 202 casi di infezione ematica, l'identificazione MALDI-TOF MS dal sangue pellet di coltura hanno mostrato un impatto nella terapia antibiotica nel 35,1% dei casi, mentre la colorazione di Gram aveva solo un ulteriore impatto nel 20% dei casi 8. È interessante notare che la differenza massima di impatto tra la colorazione di Gram e la segnalazione di identificazione MALDI-TOF MS sulla gestione clinica è stata osservata quando i batteri associati con una maggiore resistenza agli antibiotici, come AmpC-produzione Enterobacteriaceae sono stati identificati mediante MALDI-TOF MS. Allo stesso modo, Martiny et al. Hanno dimostrato che MALDI-TOF MS rapida identificazione può fissare l'adattamento della terapia antibiotica nel 13,4% dei casi, mentre un perno retrospettivay eseguita da Stoneking et al. suggerisce che una rapida identificazione di microrganismi che causano batteriemia può aiutare a regolare la terapia empirica nel 77% dei casi mediante la gestione di un ulteriore antibiotico non coperto dal regime iniziale o riducendo lo spettro degli antibiotici 18,19 . Inoltre, l'uso di un rapido test basato su PCR come l'MRSA tecnologia di amplificazione dell'acido nucleico seguente S. Identificazione aureus mediante MALDI-TOF MS da pellet emocoltura ha consentito di fornire la terapia antibiotica più appropriata in meno di 4 ore per i pazienti affetti da S. aureus batteriemia 17. Escludendo i pazienti con allergia alla penicillina, l'uso della tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici MRSA ha permesso una significativa riduzione di anti-MRSA antibiotici abuso come glicopeptidi dal 26,1% al 8,1%. Insieme, questi dati suggeriscono che la rapida segnalazione sequenziale di colorazione di Gram, l'identificazione MALDI-TOF MS e rapido a base di PCR di unssay da pellet emocolture stanno migliorando in modo significativo la terapia antibiotica e quindi la gestione clinica e la prognosi di pazienti affetti da infezioni del sangue.

MALDI-TOF MS ha permesso una corretta identificazione 78,7% di sangue pellet della cultura, che è una prestazione molto buona rispetto ad un tasso di identificazione del 84,1% ottenuto dalla tradizionale MALDI-TOF MS su colonie pure cresciute su piastre di agar. Altro che il 50% delle infezioni del sangue sono causate da specie batteriche come Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e gli enterococchi. Questi batteri sono identificati in modo efficiente mediante MALDI-TOF MS che probabilmente influenzare positivamente il buon andamento di identificazione MALDI-TOF MS eseguita direttamente su emocoltura pellet batterici. Il basso rendimento per l'identificazione di alcune specie batteriche mediante MALDI-TOF MS eseguita su sangue pellet cultura è dovuto principalmente a fattori similidi quelli osservati per l'identificazione convenzionale da colonie pure cresciute su piastre di agar. Ad esempio, alcune specie microbiche, come streptococchi appartenenti al gruppo mitis e stafilococchi coagulasi negativi sono strettamente collegati e identificata con bassa precisione mediante MALDI-TOF MS. Inoltre, una particolare composizione della parete cellulare batterica dei batteri Gram-positivi o la presenza di una capsula denso osservato in specie batteriche come Klebsiella pneumoniae diminuiscono significativamente l'efficienza di lisi e quindi la performance di identificazione MALDI-TOF MS. Infine, il basso rendimento di MALDI-TOF MS per l'identificazione di batteri anaerobi è dovuto principalmente una rappresentazione incompleta e poveri di questi batteri nel database MALDI-TOF.

La piccola riduzione delle prestazioni di identificazione MALDI-TOF MS da pellet emocolture rispetto al tradizionale di controllo da colonie pure può essere dovuto a residui di proteine ​​del sangue componenti o di una quantità insufficiente di batteri ottenuti dopo lisi-centrifugazione. Allo stesso modo, le differenze osservate con le schede di sistema microbiche automatizzati inoculati direttamente con pellet di coltura di sangue rispetto a quelli inoculati con colonie isolate possono essere causati da sangue residuo componenti della cultura, come le proteine, le cellule del sangue e composti medie sangue che può interferire con la crescita batterica nel automatizzato schede di sistema microbica e può avere un impatto significativo sia l'identificazione e AST. Inoltre, i risultati ottenuti AST da sistemi microbici automatici devono essere controllate mediante saggi di diffusione del disco anche eseguiti direttamente su emocoltura pellet batterici per convalidare i risultati di alcuni antibiotici noti per presentare differenze significative rispetto agli approcci tradizionali. Tuttavia, inoculazione diretta delle schede di sistema microbiche automatizzati con pellet emocolture presenta un'ottima performance ID e AST sia per Enterobacteriaceae e staphylococci.

Così, il pellet batterico ottenuto da cloruro di ammonio lisi centrifugazione di emocolture positive è stato convalidato per eseguire direttamente numerose applicazioni a valle che consentono una rapida comunicazione dei risultati essenziali quali ID e AST in un TAT significativamente ridotto rispetto agli approcci tradizionali. Inoltre, applicazioni aggiuntive come spettro esteso β-lattamasi test (ESBL) sono stati validati su simili lisi centrifugazione di emocoltura positiva metodologie 20 suggerendo che potrebbero essere applicate anche sul pellet batterico ottenuto con il protocollo descritto in questo lavoro.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Ringraziamo i tecnici del laboratorio di batteriologia del Centro Ospedaliero Universitario di Losanna per il loro aiuto per attuare le tecniche in laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici
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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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