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Immunology and Infection

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

Una preparación rápida sedimento bacteriano de un cultivo de sangre positivo puede ser utilizado como una muestra para aplicaciones tales como la identificación por MALDI-TOF, la tinción de Gram, la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y prueba basada en PCR. Los resultados pueden ser comunicados rápidamente a los médicos a mejorar el resultado de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Abstract

Infecciones del torrente sanguíneo y sepsis son una causa importante de morbilidad y mortalidad. El resultado exitoso de los pacientes que sufren de bacteremia depende de una rápida identificación del agente infeccioso para guiar el tratamiento antibiótico óptimo. El análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo puede llevar a cabo con rapidez y ya afecta significativamente el régimen de antibióticos. Sin embargo, todavía se requiere la identificación precisa del agente infeccioso para establecer el tratamiento óptimo de destino. Se presenta aquí una preparación sedimento bacteriano simple y rápido de un cultivo de sangre positivo que puede ser utilizado como una muestra para varias aplicaciones posteriores esenciales tales como la identificación por MALDI-TOF MS, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) por ensayo de difusión en disco o sistemas automatizados de AST y por PCR automatizado basado en pruebas de diagnóstico. El rendimiento de estos diferentes sistemas de identificación y AST aplicados directamente sobre los sedimentos bacterianos de cultivo de sangre es muy SIMilar con el rendimiento que se obtiene normalmente a partir de colonias aisladas cultivadas en placas de agar. En comparación con los métodos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano se reduce significativamente el tiempo para reportar tanto la identificación y AST. Así, siguiendo la positividad del cultivo de sangre, identificación por MALDI-TOF puede ser reportado en menos de 1 hora mientras que los resultados de AST por sistemas automatizados AST o ensayos de difusión en disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Del mismo modo, los resultados de un ensayo rápido basado en la PCR se pueden comunicar a los médicos a menos de 2 horas tras el informe de una bacteriemia. Juntos, estos resultados demuestran que la rápida preparación de un sedimento bacteriano cultivo de sangre tiene un impacto significativo en el tiempo de identificación y de respuesta AST y por tanto en el resultado exitoso de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Introduction

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Infecciones del torrente sanguíneo y la sepsis en pacientes hospitalizados son una causa importante de morbilidad y mortalidad. Por lo tanto, se observa la mortalidad relacionada con infecciones del torrente sanguíneo en aproximadamente 14% a 37% de los pacientes hospitalizados y puede aumentar hasta el 35% en las unidades de cuidados intensivos de los pacientes 1-3. La identificación rápida del agente infeccioso es fundamental para orientar el tratamiento antimicrobiano óptimo y para aumentar el éxito de la terapia antimicrobiana 4,5. El rápido análisis de la tinción de Gram de hemocultivo positivo ya tiene un impacto significativo en la adaptación de la terapia antimicrobiana 6,7 pero la identificación precisa del agente infeccioso que se requiere para proporcionar el tratamiento antibiótico más adecuado a las pacientes. Por ejemplo, diferentes regímenes de tratamiento con antibióticos tienen que ser aplicadas tras bacteriemia con enterococos y estreptococos que son difíciles de distinguir por la tinción de Gram. Del mismo modo, la identificación de las especies LevEL es necesario para detectar enterobacterias Gram negativo que codifica un gen cromosómico ampC que confieren una mayor resistencia a β-lactámicos 8.

Con un hemocultivo positivo, el enfoque de diagnóstico convencional es subcultura del agente infeccioso en diferentes placas de agar, que requiere varias horas de incubación adicional previa identificación con diversos enfoques, incluyendo pruebas bioquímicas, el crecimiento en diferentes medios selectivos y sistemas de identificación microbiana automatizados. El tiempo de los resultados de un enfoque de diagnóstico convencional es de aproximadamente 1 a 3 días.

La aparición de la tecnología de desorción láser asistida por matriz / espectrometría de masas de tiempo de vuelo-ionización (MALDI-TOF) para la identificación rápida de microorganismos ha proporcionado una nueva herramienta para identificar rápidamente los microorganismos de colonias crecidas en placas de agar sino también directamente a partir de sangre positivo culturas (Figura 1) 9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar un agente infeccioso a partir de cultivos de sangre se ha reducido significativamente el tiempo a los resultados a unos pocos minutos en lugar de las horas y los días requeridos por los métodos tradicionales. Como se discutió por Croxatto et al. 13, la eficiencia de identificación MALDI-TOF se basa en diferentes parámetros, incluyendo la pureza y la cantidad de microorganismo. Estos dos criterios se obtienen fácilmente a partir de colonias discretas cultivadas en placas de agar, pero requiere un tratamiento de pre-analítica para el enriquecimiento bacteriana y purificación a partir de muestras complejas, tales como cultivo de sangre, que contienen múltiples componentes celulares y proteínas que pueden interferir con la identificación MALDI-TOF.

Varios métodos de aislamiento de microorganismos a partir de cultivo de sangre se han utilizado en una serie de estudios que incluyen saponina u otro método detergentes suaves para la extracción bacteriana 9,14, el método de separador de suero 10, la lisis métodos de centrifugación 12 (Figura 2) 15. Esta preparación de pellets de hemocultivo también proporcionar una muestra para otras aplicaciones posteriores directos tales como la tinción de Gram, pruebas de diagnóstico basados ​​en PCR automatizados, como el POCT-PCR para la detección rápida de la meticilina-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con sistemas automatizados de AST y / o por ensayos de difusión de disco en placas de agar (Figura 3).

En este trabajo se describen los diferentes pasos para la preparación del sedimento bacteriano hemocultivos según ha explicado Prod'hom et al. 15 (Figura 4). También vamos a desescriba los protocolos para tres de las principales aplicaciones que se pueden realizar en el sedimento de la cultura de la sangre: La identificación por MALDI-TOF 15, la identificación (ID) y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) con los sistemas automatizados 16 para enterobacterias y estafilococos y PCR automatizada prueba de diagnóstico basado en la detección de MRSA 17.

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Protocol

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Este protocolo ha sido desarrollado y validado después de los procesos de investigación y desarrollo y las normas éticas de nuestra institución antes de ser implementado como una herramienta rutinaria.

1 Preparación de un cultivo de sangre bacteriana Pellet por Amonio Procedimiento Cloruro de eritrocitos-lisis

  1. Preparación de una cultura positiva de sangre para su posterior centrifugación.
    1. Esterilizar la tapa hemocultivo. Añadir 70% de etanol en la tapa de la botella y quemarlo.
      NOTA: No realice este paso en una campana de flujo laminar.
    2. Mover la botella a una campana de flujo laminar. Recoger 5 ml del cultivo de la sangre con una jeringa 20 G.
    3. Añadir los 5 ml de cultivo de sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 45 ml de agua estéril (H 2 O) y mezclar la muestra.
  2. Preparación de un cultivo de sangre sedimento bacteriano por lisis centrifugación.
    1. Centrifugar la muestra a 1000 xg durante 10 min a TA.
    2. Remove el sobrenadante (que contiene principalmente H 2 O y células de la sangre) con una bomba de vacío de laboratorio.
    3. Resuspender el precipitado en 1 ml de cloruro de amonio casero solución de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3). Divida el sedimento por raspado y agitando con vórtex el tubo y centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA.
    4. Descartar el sobrenadante que contiene principalmente los escombros células rojas de la sangre.
      1. Si el sedimento se mantuvo hemorrágico, resuspender el precipitado en 2 ml de H destilada estéril y 2 0 para lisar los glóbulos rojos más residuales y para lavar el sedimento. Centrifugar la muestra a 140 xg durante 10 min a TA y desechar el sobrenadante.
    5. Resuspender el sedimento en 200 l de H 2 O
  3. Subcultura de cultivo de sangre en diversos medios de agar selectivo y no selectivo.
    1. Recoge 1 ml del cultivo de sangre con una jeringa de 20 G.
    2. Inocular 1 gota de hemocultivo into cuatro cuadrantes en agar sangre, agar chocolate, agar McConkey y agar Schaedler.
    3. Incubar a 37 ° C el agar sangre y placas de agar de chocolate en una atmósfera de 5% de CO 2, el agar McConkey en un ambiente normal y la placa de agar Schaedler en condiciones anaeróbicas.
    4. Siga el crecimiento bacteriano en los distintos medios.
    5. Compruebe la pureza bacteriana.

2. identificación por MALDI-TOF MS

  1. La identificación directa del sedimento de sangre.
    1. Transferencia de 1 l de la pastilla de sangre en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C.
    2. Superposición de la muestra con ácido fórmico 1 l 70% y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C.
    3. Superposición de la muestra con 1 l de matriz MALDI y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C (solución de α-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo al 50%-un 2,5% de ácido trifluoroacético saturada).
    4. Proceda a MALDI-TOF MS análisis con un sistema MALDI-TOF MS como se describe por los fabricantes.
    5. Si la puntuación de identificación no es válido a nivel de especie (por ejemplo, con una puntuación <2), lleve a cabo una extracción de proteínas de la muestra de sedimento de sangre.
  2. Identificación de la proteína después de la extracción del sedimento cultivo de sangre.
    1. Mezclar 20 l de la pastilla con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 13.000 xg durante 2 min a TA.
    2. Descartar el sobrenadante y añadir 25 l de ácido fórmico al 70% y 25 l de acetonitrilo al 100% a la pastilla. Vortex vigorosamente para volver a suspender los pellets. Resuspender bolitas duras por romper hacia abajo con puntas de pipeta antes de vórtice.
    3. Se centrifuga a 13.000 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferencia de 1 l del sobrenadante (que contiene proteínas extraídas) en una placa de MALDI objetivo y dejar secar en una plataforma de calentamiento 42 ° C. Proceda como se describe en 2.1.2.

3. bacteriana Identificación y Antibiótico Pruebas de Susceptibilidad con un Sistema Automatizado Microbiana

  1. Preparación de una suspensión bacteriana de identificación bacteriana y AST con un sistema automatizado microbiana.
    1. Preparar un tubo de plástico que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,45% compatible con el sistema automatizado microbiana.
    2. Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl 0,45% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro.
      NOTA: El volumen del sedimento bacteriano cultivo de sangre varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8.
  2. Inocular las automatizados Gram-positivo (GP) o Gram-negativo (GN) tarjetas de identificación y las tarjetas AST automatizados para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de bacterias cocos Gram-positivos y Gram-negativos como se describe por el fabricante.
    NOTA: Identificación con GP o tarjetas GN no se aplica si MALDI-TOF MS valor de la puntuación de identificación es> 2. Comprobar la pureza de la suspensión bacteriana mediante subcultivo la suspensión bacteriana en agar sangre (GP y GN) y agar MacConkey (GN) placas.

4. antibióticos Pruebas de Susceptibilidad por difusión con discos de ensayo

El ensayo de difusión en disco es descrito por el Comité Europeo de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (EUCAST, Versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org).

  1. Preparación de una suspensión bacteriana para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana mediante el ensayo de difusión en disco.
    1. Preparar un tubo de vidrio que contiene 3 ml de solución estéril de NaCl al 0,9%.
    2. Añadir un volumen suficiente de la pastilla de cultivo de sangre en la solución de NaCl al 0,9% para obtener una suspensión bacteriana correspondiente a una turbidez McFarland de 0,5. Medir la turbidez usando una máquina de densitómetro.
      NOTA: El volumen del cultivo de sangresedimento bacteriano varía entre 50 y 200 l para lograr una turbidez McFarland de 0,6 a 0,8.
    3. Vórtex con la suspensión bacteriana.
  2. La inoculación de suspensión bacteriana sobre agar Mueller-Hinton (MH) o agar Mueller-Hinton agar-organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado con 5% de sangre desfibrinada de caballo y 20 mg / l de adenina dinucleótido nicotinamida-β).
    1. Sumergir un hisopo de algodón estéril en la suspensión bacteriana y retirar suavemente el exceso de fluido girando el hisopo en la pared interior del tubo de vidrio.
    2. Corre la suspensión bacteriana de manera uniforme sobre toda la superficie de la placa de agar MH / MHF en muestras de secreciones en tres direcciones o mediante el uso de una placa de rotador automático.
  3. Aplicación de los discos antimicrobianos en placas de agar inoculadas.
    1. Aplicar de cerca los discos en la superficie de las placas de agar inoculadas secas manualmente o mediante un dispensador de disco de susceptibilidad.
    2. Incubar la placa a la tempe apropiadaratura ambiente y como se describe en el método de difusión en disco EUCAST las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (versión 3.0, abril de 2013, www.eucast.org).

5. automatizado PCR-basado de prueba de diagnóstico para la detección de MRSA

  1. Usando una micropipeta, transferir 50 l de la pastilla de cultivo de sangre en el frasco de reactivo de ejemplo proporcionado con el kit de prueba de MRSA automatizado de diagnóstico basado en la PCR y agitar durante 20 seg.
  2. Usando una micropipeta de 1 ml, dispensar la muestra en el puerto de muestra del cartucho. Insertar el cartucho en el sistema de PCR automatizado e iniciar el ensayo como se describe por el fabricante.

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Representative Results

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En el estudio realizado por Prod'hom et al. 15, sedimentos bacterianos obtenidos por cloruro de amonio lisis centrifugación de 122 hemocultivo positivo de 78 pacientes se analizaron por MALDI-TOF MS. Fuera de 122 hemocultivos positivos, 95 (77,9%) fueron correctamente identificados a nivel de especie y uno (0,8%) a nivel de género. Los 26 (21,3%) Bolitas de hemocultivo restantes no dieron ninguna identificación fiable por MALDI-TOF. Entre ellos, 21 eran bacterias gram positivas incluyendo 13 estreptococos y 5 estafilococos coagulasa negativos. Es importante destacar que 10 de los 13 estreptococos no identificados fueron Streptococcus pneumoniae que a menudo poseen una cápsula difícil de lisis y son difícilmente distingue de especies de la S. grupo mitis utilizando MALDI-TOF MS. Cinco bacterias Gram-negativas no fueron identificados por MALDI-TOF, entre los cuales cuatro difíciles de lisar encapsulado especies bacterianas incluyendo dos Klebsiella pneumoniae y dos Haemopinfluenzae hilio. Así, se obtuvo correcta identificación por MALDI-TOF en 78,7% de los pellets de cultivo de sangre, lo que representa un rendimiento eficiente en comparación con el 84,1% de identificación obtenido a partir de la identificación convencional de colonias bacterianas cultivadas en placas de agar 11.

El rendimiento del sistema automatizado para la identificación microbiana bacteriana (ID) y para AST fue probado en 278 sedimentos bacterianos de cultivo de sangre positivo para cocos Gram-positivos en el grupo y las bacterias Gram-negativas. Estos resultados se compararon con los resultados obtenidos con los convencionales tarjetas automatizadas del sistema microbianas de colonias crecidas en placas de agar siguientes subcultivo de cultivo de sangre positivo en los medios de comunicación apropiados 16. La identificación directa usando tarjetas microbianas ID del sistema de identificación se puede utilizar cuando la identificación del sedimento bacteriano por MALDI-TOF MS ha fallado. En comparación con una identificación final por MALDI-TOF MS, una identificación correcta contarjetas de identificación microbiana sistema de identificación se observó en el 99% de las enterobacterias, el 74% de los estafilococos, el 71% de las bacterias Gram-negativas no fermentativos y 33% de otros cocos grampositivos. Un error en la identificación se observó en el 11% del total de casos, mientras que el 8% de los sedimentos bacterianos dio ningún tipo de identificación. Se analizaron un total de 220 ​​pastillas de bacterias incluyendo 87 enterobacterias y estafilococos 133 para AST con el sistema microbiano automatizado AST GN26 y AST 580 tarjetas de 16. Los resultados fueron analizados de acuerdo a las definiciones dadas por la Food and Drug Administration (FDA) de los resultados de acuerdos interpretativos, que definen un falso susceptible como un error muy importante (VME) y un falso resistente como un error grave (ME). AST obtenido a partir de la inoculación directa de la cultura de la sangre de pellets en comparación con la inoculación de colonias cultivadas en placas de agar, fue 0,1% y 0,3% VME ME para enterobacterias, y el 0,7% y el 0,1% VME ME para estafilococos. Por lo tanto el rendimiento de ASTtarjetas inoculadas directamente con pellets de cultivo de sangre están de acuerdo con los criterios de desempeño aceptados por la FDA.

El rendimiento de la prueba de MRSA tecnología de amplificación de ácido nucleico basada en PCR dirigida al spa, mecA y los genes de SCC se aplicó directamente sobre Staphylococcus aureus cultivo de sangre sedimentos bacterianos identificados por MALDI-TOF MS 17. Basado en 106 casos, la detección de resistencia a la meticilina exhibió una sensibilidad de 99% y una especificidad del 100%. Curiosamente, el tiempo medio para informar de los resultados de la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos a partir de hemocultivo positividad fue igual a 201 minutos (rango 100-430), mientras que la mediana de tiempo desde la identificación de MALDI-TOF reportar resultados similares fue igual a 97 min (rango de 25 250).

Figura 1
Figura 1. pre y post-MALDI-TOF era. En comparación con los enfoques convencionales de diagnóstico que incluyen una O / N subcultura de la muestra, la identificación MALDI-TOF MS se puede realizar en cuestión de minutos después de la entrega de muestras al laboratorio de diagnóstico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. de flujo de trabajo de procesamiento de cultivo de sangre del muestreo a la identificación MALDI-TOF MS. Cuando los cultivos de sangre son positivos, un sedimento bacteriano se prepara por centrifugación de lisis de cloruro de amonio. Este sedimento bacteriano se utiliza entonces para la identificación directa por MALDI-TOF MS. Identificación MALDI-TOF MS se puede conseguir dentro de 30 a 60 min fo llowing hemocultivo positividad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Muchas aplicaciones posteriores, incluyendo la tinción de Gram, MALDI-TOF MS identificación, AST usando sistemas automatizados y / o ensayos de difusión en disco y las pruebas basadas en PCR rápida, tales como punto de PCR de ensayo atención (POCT-PCR) para la detección de MRSA puede se lleva a cabo directamente en el sedimento bacteriano hemocultivo. prueba directa de los gránulos de hemocultivo bacterianas disminuir significativamente el tiempo a su vez-en torno a reportar ID y AST resultados que es fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. El protocolo de centrifugación de lisis de cloruro de amonio permite la preparación de un sedimento bacteriano enriquecido y purificado a partir de caldos de cultivo de sangre positivo. Tinción de Gram de cultivo de sangre positivo de Escherichia coli, coagulasa-negativos Staphylococcus capitis y Streptococcus dysgalactiae lleva a cabo antes y después de la preparación de el hemocultivo sedimento bacteriano. Las morfologías clásicas de estafilococos y estreptococos en grupos en las cadenas se observan más fácilmente en el caldo de cultivo de sangre nativa que en el sedimento bacteriano cultivo de sangre. Barra de escala = 25 m.= "_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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En comparación con los métodos de diagnóstico de hemocultivos positivos convencionales, la rápida adquisición de un sedimento bacteriano utilizando el cloruro de enfoque centrifugación lisis de amonio a reducir el tiempo para informar de identificación en un 16 a 24 horas y el tiempo de reportar AST por 24 a 48 horas (Figuras 1 y 3).

Rápida introducción de la terapia antibiótica adecuada es fundamental para mejorar el pronóstico de los pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo. Por lo tanto, la identificación temprana de los agentes infecciosos dentro de 1 hora seguida de un AST rápido obtenido en alrededor de 8 a 16 horas representa un gran impacto en el manejo clínico de los pacientes sépticos. La comunicación rápida de la tinción de Gram ya ha sido asociada con un gran impacto en la terapia antimicrobiana y por lo tanto con una disminución en la morbilidad del paciente y la mortalidad 6,7. La tinción de Gram del sedimento bacteriano hemocultivo se puede hacer para aumentar la sensibilidad cuando la tinción de Gram del blood caldo de cultivo es negativo o débilmente positivo (Figura 4). Sin embargo, se recomienda la tinción de Gram se realiza en el caldo de cultivo de sangre nativa observar morfologías típicas, como los estafilococos o estreptococos en racimos en las cadenas. En un reciente estudio prospectivo realizado en 202 casos de infección del torrente sanguíneo, la identificación MALDI-TOF MS de pellets de cultivo de sangre mostraron un impacto en la terapia antibiótica en el 35,1% de los casos mientras que la tinción de Gram sólo tuvo un impacto adicional en el 20% de los casos 8. Curiosamente, se observó la máxima diferencia de impacto entre la tinción de Gram y la información de identificación de MALDI-TOF MS en el manejo clínico cuando las bacterias asociadas con el aumento de la resistencia a antibióticos tales como la producción de AmpC-Enterobacteriaceae fueron identificados por MALDI-TOF MS. Del mismo modo, Martiny et al. Han demostrado que MALDI-TOF MS rápida identificación puede sujetar la adaptación de la terapia con antibióticos en 13,4% de los casos mientras que un perno retrospectivay realizada por Stoneking et al. sugirió que una identificación rápida de microorganismos causantes de bacteriemia puede ayudar a ajustar la terapia empírica en 77% de los casos, ya sea mediante la administración de un antibiótico adicional no cubierto por el régimen inicial o reduciendo el espectro de los antibióticos 18,19 . Por otra parte, el uso de un ensayo rápido basado en la PCR tales como el MRSA tecnología de amplificación de ácido nucleico siguiente S. aureus identificación por MALDI-TOF MS de pellets de cultivo de sangre en condiciones de brindar la terapia antibiótica más adecuada en menos de 4 horas para pacientes que sufren de S. aureus bacteremia 17. Cuando excluir a los pacientes con alergia a la penicilina, el uso de la tecnología de amplificación de ácido nucleico MRSA permitió una reducción significativa de anti-MRSA abuso de antibióticos, tales como glicopéptidos de 26,1% a 8,1%. Juntos, estos datos sugieren que la notificación rápida secuencial de la tinción de Gram, identificación de MALDI-TOF MS y rápida basada en PCR unssay de pellets de cultivo de sangre están mejorando significativamente la terapia con antibióticos y por lo tanto el manejo clínico, así como la evolución de los pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

MALDI-TOF MS permitió una identificación correcta 78.7% de gránulos de cultivo de sangre, que es un muy buen rendimiento en comparación con una tasa de identificación de 84,1% obtenido por convencional MALDI-TOF MS realizado en colonias puras cultivadas en placas de agar. Más que 50% de las infecciones del torrente sanguíneo son causadas por especies bacterianas tales como Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y enterococos. Estas bacterias se identifican de manera eficiente por MALDI-TOF MS que probablemente influyen positivamente en el buen desempeño de la identificación MALDI-TOF MS realizado directamente en hemocultivo sedimentos bacterianos. El bajo rendimiento para la identificación de algunas especies bacterianas mediante MALDI-TOF MS realizó en gránulos de cultivo de sangre se debe principalmente a factores similaresque los observados para la identificación convencional a partir de colonias puras cultivadas en placas de agar. Por ejemplo, varias especies microbianas tales como estreptococos perteneciente al grupo mitis y estafilococos coagulasa-negativos están estrechamente relacionados y identificado con baja precisión por MALDI-TOF MS. Por otra parte, una composición particular de la pared celular bacteriana de bacterias Gram-positivas o la presencia de una cápsula densa observado en especies bacterianas tales como Klebsiella pneumoniae disminuyen significativamente la eficiencia de lisis y por lo tanto el rendimiento de la identificación MALDI-TOF MS. Finalmente, el bajo rendimiento de MALDI-TOF MS para la identificación de bacterias anaerobias se debe principalmente a una representación incompleta y deficiente de estas bacterias en la base de datos de MALDI-TOF.

La pequeña disminución del rendimiento de la identificación MALDI-TOF MS a partir de sedimentos de cultivo de sangre en comparación con la identificación convencional a partir de colonias puras puede ser debido a la proteína de la sangre residual cOMPONENTES o de una cantidad insuficiente de bacterias obtenidas después de la lisis-centrifugación. Del mismo modo, las diferencias observadas con las tarjetas del sistema microbianas automatizados inoculados directamente con pellets de cultivo de sangre en comparación con aquellos inoculados con colonias aisladas pueden ser causados ​​por componentes del cultivo de sangre residual, tales como proteínas, células sanguíneas y compuestos medianas sangre que pueden interferir con el crecimiento bacteriano en el automatizado tarjetas microbiana del sistema y puede tener un impacto significativo tanto en la identificación y AST. Por otra parte, los resultados de AST obtenidos por sistemas automatizados microbianas deben ser verificados por medio de ensayos de difusión de disco también se realizan directamente en hemocultivo sedimentos bacterianos para validar los resultados de algunos antibióticos conocidos para presentar discrepancias significativas en comparación con los métodos convencionales. Sin embargo, la inoculación directa de las tarjetas del sistema microbianas automatizados con bolitas de hemocultivo presenta un excelente rendimiento ID y AST tanto para Enterobacteriaceae y staphylococci.

Por lo tanto, el sedimento bacteriano obtenido por cloruro de amonio lisis centrifugación de los hemocultivos positivos se ha validado para realizar directamente varias aplicaciones posteriores que permiten una rápida notificación de los resultados esenciales tales como la identificación y antibiograma en un TAT reducido significativamente en comparación con los métodos convencionales. Por otra parte, las aplicaciones adicionales, tales como espectro extendido β-lactamasas (BLEE) las pruebas han sido validadas en la centrifugación lisis similar de hemocultivo positivo metodologías 20 lo que sugiere que también podrían aplicarse en el sedimento bacteriano obtenido con el protocolo descrito en este trabajo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Damos las gracias a los técnicos del laboratorio de Bacteriología del Centro Hospitalario Universitario de Lausana por su ayuda para poner en práctica las técnicas en el laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos
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Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

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