Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

En snabb bakteriell pellet-beredning från en positiv blododling kan användas som ett prov för tillämpningar såsom identifiering genom MALDI-TOF, Gram-färgning, antibiotiska resistensbestämning och PCR-baserat test. Resultaten kan snabbt kommuniceras till kliniker att förbättra resultatet av patienter som lider av infektioner i blodomloppet.

Abstract

Blodomloppet infektioner och sepsis är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Framgången för patienter som lider av bakteriemi är beroende av en snabb identifiering av smittämnet för att vägleda optimal antibiotikabehandling. Analysen av Gram fläckar från positiv blododling kan snabbt genomföras och redan avsevärt påverka antibiotikakur. Men den exakta identifieringen av smittämnet fortfarande krävs för att fastställa den optimala riktad behandling. Vi presenterar här en enkel och snabb bakteriepelleten beredning från en positiv blododling som kan användas som prov för flera viktiga tillämpningar i senare led såsom identifiering av MALDI-TOF MS, antibiotika resistensbestämning (AST) med skiv diffusionsanalys eller automatiserade ASAT system och genom automatiserad PCR-baserad diagnostisk testning. Utförandet av dessa olika identifierings och AST som tillämpas direkt på blododlings bakteriella pellets är mycket siMilar till prestanda som normalt erhålls från isolerade kolonier odlas på agarplattor. Jämfört med konventionella metoder, den snabba förvärv av en bakteriell pellet minskar avsevärt tiden för att rapportera både identifikation och AST. Således kan följa blododling positivitet, identifiering av MALDI-TOF rapporteras inom mindre än 1 timme, medan resultaten från AST genom automatiserade AST system eller skiv diffusionsanalyser inom 8 till 18 timmar, respektive. På samma sätt kan resultatet av en snabb PCR-baserad analys meddelas de kliniker mindre än 2 timmar efter rapporten om en bakteriemi. Tillsammans visar dessa resultat att den snabba beredningen av en blododling bakteriell pellet har en betydande inverkan på identifiering och AST handläggningstid och därmed på det framgångsrika resultatet av patienter som lider av blodinfektioner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blodomloppet infektioner och sepsis i inlagda patienter är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Således är dödligheten relaterad till blodomloppet infektioner observerades hos cirka 14% till 37% av sjukhus patienten och kan öka till 35% på intensivvårdsavdelningar patienter 1-3. Den snabb identifiering av smittämnet är avgörande för att vägleda optimal antimikrobiell behandling och öka framgångsrikt resultat av antimikrobiell behandling 4,5. Den snabba analysen av Gram fläckar från positiv blododling redan har en betydande inverkan på anpassningen av antimikrobiell behandling 6,7 men korrekt identifiering av smittämnet är skyldig att ge den bästa anpassad antibiotikabehandling till patienterna. Till exempel olika antibiotikabehandlingsregimer måste genomföras efter bakteriemi med enterokocker och streptokocker som är svåra att skilja från Gram-färgning. Likaså identifiering på arten Level krävs för att detektera Gramnegativa enterobakterier kodar en kromosomal AmpC gen som ger en ökad resistens mot β-laktamer 8.

Med en positiv blododling, är det konventionella diagnostiska tillvägagångssätt för subkultur smittämnet på olika agarplattor, som kräver flera timmars extra inkubation föregående kartläggning med olika metoder, bland annat biokemiska tester, tillväxt på olika selektiva medier och automatiserade mikrobiell identifieringssystem. Tiden till resultaten av ett konventionellt diagnostiskt tillvägagångssätt är av ca 1 till 3 dagar.

Framväxten av den matris assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF)-teknik för snabb identifiering av mikroorganismer har gett ett nytt verktyg för att snabbt identifiera mikroorganismer från kolonier som odlas på agarplattor utan också direkt från positivt blod kulturer (Figur 1) 9-12. The användning av MALDI-TOF för att identifiera ett smittämne från blododlingar har minskat avsevärt tiden till resultat att några minuter istället för timmar och dagar som krävs med traditionella metoder. Såsom diskuteras av Croxatto et al. 13, effektiviteten i MALDI-TOF-identifiering baseras på olika parametrar, inklusive den mikroorganism s renhet och kvantitet. Dessa två kriterier kan lätt erhållas från diskreta kolonier odlas på agarplattor utan krävde en pre-analytiska behandling för bakteriell anrikning och rening från komplexa prover såsom blod kultur, som innehåller multipla cellulära och proteinkomponenter som kan interferera med MALDI-TOF-identifiering.

Olika mikroorganismer "isoleringsmetoder från blododling har använts i ett antal studier, inklusive saponin eller annan milda tvättmedel metod för bakteriell extraktion 9,14, serum separator metod 10, Lysis centrifugemetoder 12 (figur 2) 15. Detta blod-kultur pellets preparatet ger också ett prov för andra direkta tillämpningar i senare led såsom Gram färgning, automatiserade PCR-baserade diagnostiska tester såsom POCT-PCR för snabb detektion av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och antibiotika resistensbestämning med automatiserade ASAT system och / eller från disk diffusionsanalyser på agarplattor (Figur 3).

I detta arbete beskriver vi de olika stegen för framställning av blod-kulturen bakteriepelleten som förklaras av Prod'hom et al. 15 (Figur 4). Vi kommer också att frånskriftlärd protokollen för tre av de viktigaste applikationer som kan utföras på blododling pellets: Identifiering av MALDI-TOF 15, identifiering (ID) och antibiotikaresistensbestämning (AST) med de automatiserade system 16 för Enterobacteriaceae och stafylokocker och automatiserade PCR- baserat diagnostiskt test för påvisande av MRSA 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll har utvecklats och validerats följa forskning och utvecklingsprocesser och etiska regler i vår institution innan de genomförs som ett rutinverktyg.

1. Framställning av en Blood Culture bakteriepelleten genom Ammoniumklorid Erytrocyt-lysera Procedur

  1. Beredning av en positiv blododling för efterföljande centrifugering.
    1. Sterilisera blodkultur cap. Lägg 70% etanol på locket på flaskan och bränna den.
      OBS: Utför inte detta steg i dragskåp huva.
    2. Flytta flaskan till ett dragskåp med laminärt flöde. Samla 5 ml av blododling med en 20 G spruta.
    3. Tillsätt 5 ml blod kultur i en 50 ml centrifugrör innehållande 45 ml sterilt vatten (H2O) och blanda provet.
  2. Framställning av en blodkultur bakteriepelleten genom lys centrifugering.
    1. Centrifugera provet vid 1000 xg under 10 min vid RT.
    2. Remove supernatanten (som innehåller huvudsakligen H2O och blodceller) med en laboratorievakuumpump.
    3. Återsuspendera pelleten i 1 ml hemgjorda ammoniumklorid lyserande lösning (0,15 M NH4CI, 1 mM KHCO3). Bryt ned pelleten genom skrapning och genom vortexning röret och centrifugera provet vid 140 xg under 10 min vid RT.
    4. Kasta bort supernatanten som främst innehåller röda blodkroppar skräp.
      1. Om pelleten förblev hemorragisk, resuspendera pelleten i 2 ml sterilt och destillerat H 2 0 för att ytterligare lysera resterande röda blodkroppar och för att tvätta pelleten. Centrifugera provet vid 140 xg under 10 min vid RT och kassera supernatanten.
    5. Återsuspendera pelleten i 200 | il H2O
  3. Subkultur av blododling på olika selektiva och icke-selektiva agar media.
    1. Samla 1 ml av blododling med en 20 G spruta.
    2. Inokulera 1 droppe blod kultur into fyra kvadranter på blodagar, choklad agar, McConkey agar och Schaedler-agar.
    3. Inkubera vid 37 ° C på biodagar och choklad-agarplattor i en 5% CO 2 atmosfär, McConkey agar i en normal atmosfär och Schaedler agarplatta i anaeroba förhållanden.
    4. Följ bakterietillväxt på de olika medierna.
    5. Kontrollera om bakteriell renhet.

2 Identifiering av MALDI-TOF MS

  1. Direkt identifiering från blod pelleten.
    1. Överför 1 l av blod pelleten på en MALDI måltavla och låt den torka på en 42 ° C värmeplattform.
    2. Över provet med 1 pl 70% myrsyra och låt den torka på en 42 ° C värmeplattform.
    3. Överlägg av provet med 1 pl av MALDI matris (mättad lösning av α-cyano-4-hydroxikanelsyra i 50% acetonitril-2,5% trifluorättiksyra) och låt den torka på ett 42 ° C värmeplattform.
    4. Gå vidare till MALDI-TOF MS-analys med MALDI-TOF MS-system som beskrivs av tillverkarna.
    5. Om identifieringsresultat är ogiltigt på nivån arter (till exempel med en poäng <2), utför ett protein extraktion av blod pelletprov.
  2. Identifiering efter protein extraktion från blododling pellets.
    1. Blanda 20 pl av pelleten med 1 ml 70% etanol och centrifugera vid 13.000 xg under 2 min vid rumstemperatur.
    2. Kasta bort supernatanten och tillsätt 25 ul av 70% myrsyra och 25 | il av 100% acetonitril till pelleten. Vortex kraftfullt för att suspendera pellets. Resuspendera tuffa pellets genom att bryta ner dem med pipettspetsar innan virvelbildning.
    3. Centrifugera vid 13.000 xg under 2 min vid rumstemperatur. Överför 1 l av supernatanten (som innehåller extraherade proteiner) på en MALDI måltavla och låt den torka på en 42 ° C värmeplattform. Fortsätt enligt beskrivningen i 2.1.2.

3. Bakteriell Identifblue och Antibiotikum resistensbestämning med ett automatiserat Microbial System

  1. Beredning av en bakteriesuspension för bakteriell identifiering och AST med en automatiserad mikrobiell system.
    1. Bered en plasttub innehållande 3 ml steril 0,45% NaCl-lösning förenlig med den automatiserade mikrobiell systemet.
    2. Lägg till en tillräcklig volym av blod kultur pelleten i 0,45% NaCl-lösning för att erhålla en bakteriesuspension motsvarande en McFarland grumligheten 0,6-0,8. Mät grumlighet med användning av en densitometer maskin.
      OBSERVERA: Volymen av blododling bakteriella pelleten varierar från 50 till 200 | j, l för att uppnå en McFarland grumlig av 0,6-0,8.
  2. Inokulera de automatiserade grampositiva (GP) eller gramnegativa (GN) kort för identifiering och de automatiserade AST kort för resistensbestämning av grampositiva kocker och gramnegativa bakterier som beskrivs av tillverkaren.
    NOTERA: Identification med GP eller GN-kort inte tillämpas om MALDI-TOF MS identifieringsresultat värdet är> 2. Kontrollera renhet bakteriesuspensionen genom subkultur bakteriesuspensionen på blodagar (GP GN) och MacConkey agar (GN) plattor.

4 antibiotikakänslighet Testning Disk Diffusion analys

Disken diffusion analys beskrivs av Europeiska kommittén för resistensbestämning (EUCAST, version 3.0, april 2013, www.eucast.org).

  1. Beredning av en bakteriesuspension att utföra resistensbestämning av disk diffusion analys.
    1. Förbered ett glasrör innehållande 3 ml steril 0,9% NaCl-lösning.
    2. Lägg till en tillräcklig volym av blod kultur pelleten i 0,9% NaCl-lösning för att erhålla en bakteriesuspension motsvarande en McFarland grumligheten 0,5. Mät grumlighet med användning av en densitometer maskin.
      OBSERVERA: Volymen av blododlingbakteriella pelleten varierar från 50 till 200 | j, l för att uppnå en McFarland grumlig av 0,6-0,8.
    3. Vortexa bakteriesuspensionen.
  2. Inokulering av bakteriesuspension på Mueller-Hinton-agar (MH) eller Mueller-Hinton-agar-kräsna organismer agar (MHF) (MH kompletterat med 5% defibrinerat hästblod och 20 mg / I av β-nikotinamid-adenin-dinukleotid).
    1. Doppa en steril bomullstopp i bakteriesuspensionen och försiktigt avlägsna överskottsvätska genom att vrida svabb på väggen på insidan av glasröret.
    2. Sprid bakteriesuspensionen jämnt på hela ytan av MH / MHF agarplatta vid bomullstopp i tre riktningar eller genom användning av en automatiserad platt rotator.
  3. Tillämpningen av antimikrobiella diskar på ympade agarplattor.
    1. Applicera noga diskarna på ytan av de torkade inokulerade agarplattor manuellt eller genom att använda en mottaglighet disk dispenser.
    2. Inkubera plattan vid lämplig tempeperatur och atmosfär som beskrivs i resistensbestämning EUCAST disk diffusion metod (Version 3.0, april 2013, www.eucast.org).

5. Automatiserad PCR-baserade diagnostiska testet för detektion av MRSA

  1. Med hjälp av en mikropipett, överför 50 pl av blododlings pelleten i provreagensflaskan försedd med MRSA automatiserade PCR-baserade diagnostiska testkit och skaka under 20 sek.
  2. Med hjälp av en 1 ml mikropipett, befria provet i provporten av patronen. Sätt i kassetten i automatiserade PCR-systemet och starta analysen som beskrivs av tillverkaren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I studien utförd av et al. Prod'hom 15, var bakterie pellets erhållits genom ammoniumklorid lys centrifugering av 122 positiva blododling från 78 patienter analyserades med MALDI-TOF MS. Av 122 positiva blododling, 95 (77,9%) identifierades korrekt på nivån arter och en (0,8%) på släktet nivå. De återstående 26 (21,3%) blododlings pellets gav ingen tillförlitlig identifiering av MALDI-TOF. Bland dessa 21 var grampositiva bakterier, inklusive 13 streptokocker och 5 koagulasnegativa stafylokocker. Viktigt är 10 ut ur 13 oidentifierad streptokocker var Streptococcus pneumoniae som ofta har en svår lyserar kapsel och är knappast skiljas från arter av S. mitis grupp som använder MALDI-TOF MS. Fem gram-negativa bakterier identifierades inte med MALDI-TOF, bland vilka fyra svår lyserar inkapslade bakteriearter inklusive två Klebsiella pneumoniae och två Haemophilus influenzae. Således var korrekt identifiering av MALDI-TOF erhölls i 78,7% av blododlings pellets, vilket motsvarar en effektiv prestanda jämfört med 84,1% av identifiering som erhållits från konventionell identifiering av bakteriekolonier som odlas på agarplattor 11.

Prestanda för automatiserade mikrobiella system för bakteriell identifiering (ID) och för AST testades på 278 bakteriella pellets av positiv blododling för grampositiva kocker i kluster och gramnegativa bakterier. Dessa resultat jämfördes med konventionella resultat som erhållits med de automatiserade mikrobiella systemet kort från kolonier som odlas på agarplattor efter subkultur av positiv blododling på lämpliga medier 16. Direkt identifiering med hjälp av mikrobiella identifieringssystem ID-kort kan användas när identifieringen av den bakteriella pelleten med MALDI-TOF MS har misslyckats. Jämfört med en slutlig identifiering med MALDI-TOF MS, en korrekt identifikation medmikrobiella identifieringssystem ID-kort observerades hos 99% av Enterobacteriaceae, 74% av stafylokocker, 71% av icke-fermentativa gramnegativa bakterier och 33% av andra grampositiva kocker. En felidentifiering observerades hos 11% av de totala fallen medan 8% av bakteriella pellets gav ingen identifikation. Sammanlagt 220 bakteriella pellets inklusive 87 Enterobacteriaceae och 133 stafylokocker analyserades för AST med automatiserad mikrobiell systemet AST GN26 och AST 580 kort 16. Resultaten analyserades enligt definitionerna av US Food and Drug Administration (FDA) för tolknings avtal resultat, som definierade en falsk mottaglig som en mycket större fel (VME) och ett falskt resistent som ett stort fel (ME). AST erhållits från direkt ympning av blododling pellets jämfört med ympning från kolonier odlas på agarplattor visade 0,1% VME och 0,3% ME för Enterobacteriaceae och 0,7% VME och 0,1% ME för stafylokocker. Sålunda utförandet av ASTkort ympade direkt med blododlings pellets är i överensstämmelse med de prestationskriterier som godkänts av FDA.

Prestanda för PCR-baserad nukleinsyraamplifiering teknik MRSA-test med inriktning på spa, mecA och SCC generna var direkt tillämpas Staphylococcus aureus blododlings bakteriella pellets identifierats av MALDI-TOF MS 17. Baserat på 106 fall detekteringen av meticillinresistens uppvisade en 99% känslighet och en 100% specificitet. Intressant att mediantiden rapportera nukleinsyraamplifiering tekniska resultat från blododling positivitet var lika med 201 min (intervall 100-430), medan mediantiden från MALDI-TOF identifiering rapportera liknande resultat var lika med 97 min (intervall 25- 250).

Figur 1
Figur 1 före och efter MALDI-TOF-eran. Jämfört med konventionella diagnostiska metoder som omfattar ett O / N subkultur av provet, kan MALDI-TOF MS identifiering ske inom minuter efter prov leverans till diagnostiska laboratoriet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2 Arbetsflöde för blododling bearbetning från provtagning till MALDI-TOF MS identifiering. När blododlingar är positiva, är en bakteriell pellet framställd genom ammoniumklorid lys centrifugering. Denna bakteriella pellet används sedan för direkt identifiering av MALDI-TOF MS. MALDI-TOF MS identifiering kan erhållas inom 30 till 60 minuter fo llowing blododling positivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Många nedströms applikationer, inklusive Gram färgning, MALDI-TOF MS identifiering, AST hjälp av automatiserade system och / eller disk diffusionsanalyser och snabba PCR-baserade tester såsom vårdplatsen testning PCR (POCT-PCR) för påvisande av MRSA kan utföras direkt på blododling bakteriepelleten. Direkt testning från bakterieblododlings pellets avsevärt minska turn-around tid att rapportera ID och AST resultat som är avgörande för att förbättra resultatet av patienter som lider av blodinfektioner. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. ammoniumklorid lys centrifuge protokoll möjliggör framställningen av en berikad och renat bakteriepelleten från positiva blododlings buljonger. Gram färgning av positiv blododling av Escherichia coli, koagulasnegativa Staphylococcus capitis och Streptococcus dysgalactiae utföras före och efter beredning av blodkultur bakteriell pellet. De klassiska morfologier av stafylokocker i kluster och streptokocker i kedjor är lättare observeras i den inhemska blododlingsbuljongen än i blododling bakteriepelleten. Scale bar = 25 | im.= "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jämfört med konventionella positiva blododlings diagnostiska metoder, den snabba förvärv av en bakteriell pellets med hjälp av ammoniumklorid lys centrifuge strategi minska tiden för att rapportera identifiering med 16 till 24 timmar och tiden för att rapportera AST från 24 till 48 timmar (figur 1 och 3).

Snabbt införande av lämplig antibiotikabehandling är avgörande för att förbättra resultatet av patienter som lider av blodinfektioner. Således tidig identifiering av smittämnen inom 1 timme följt av en snabb AST erhållits i ca 8 till 16 timmar utgör en stor inverkan i klinisk behandling av septiska patienter. Den snabba rapportering av Gram-färgning har redan i samband med en stor inverkan på antimikrobiell terapi och därmed med en minskning av patientens sjuklighet och dödlighet 6,7. Gram-färgning av blododling bakteriella pelleten kan göras för att öka känsligheten när Gram färgning av blood odlingsbuljong är negativt eller svagt positivt (Figur 4). Dock är Gram-färgning utförs på den inhemska blododlingsbuljong rekommenderas att observera typiska morfologier såsom stafylokocker i kluster eller streptokocker i kedjor. I en nyligen prospektiv studie utförd på 202 fall av blodomloppet infektion, MALDI-TOF MS identifiering av blododlings pellets visade genomslag i antibiotikabehandling i 35,1% av fallen, medan gramfärgning hade bara en extrainsats i 20% av fallen 8. Intressant nog var den största skillnaden i effekt mellan Gram färgning och MALDI-TOF MS identifierings rapportering om klinisk behandling observeras när bakterier som följer med ökad antibiotikaresistens såsom AmpC-producerande Enterobacteriaceae identifierades genom MALDI-TOF MS. Likaså Martiny et al. Har visat att MALDI-TOF MS snabb identifiering kan fästa anpassning av antibiotikabehandling i 13,4% av fallen, medan en retrospektiv study utförs av Stoneking et al. föreslog att en snabb identifiering av mikroorganismer som orsakar bakteriemi kan hjälpa att justera empirisk behandling i 77% av fallen, antingen genom att administrera ytterligare en antibiotika som inte omfattas av den ursprungliga regim eller genom att minska spektrum av antibiotika 18,19 . Dessutom är användning av en snabb PCR-baserad analys såsom nukleinsyraamplifiering teknologi MRSA följande S. aureus identifiering genom MALDI-TOF MS från blododlings pellets tillåtet att ge den mest lämplig antibiotikabehandling på mindre än 4 timmar till patienter som lider av S. aureus bakteriemi 17. Exklusive patienter med penicillinallergi, användningen av nukleinsyraamplifiering teknik MRSA tillät en betydande minskning av anti-MRSA antibiotika missbruk som glykopeptider från 26,1% till 8,1%. Tillsammans antyder dessa data att en snabb sekventiell rapportering av Gram-färgning, MALDI-TOF MS identifiering och snabba PCR-baserad enssay från blododlings pellets avsevärt förbättra antibiotikabehandling och därmed den kliniska förvaltningen samt resultaten av patienter som lider av blodinfektioner.

MALDI-TOF MS får en 78,7% korrekt identifiering av blododlings pellets, vilket är en mycket bra prestanda jämfört med en hastighet av 84,1% identifiering erhållits genom konventionell MALDI-TOF MS utförs på rena kolonier odlas på agarplattor. Mer att 50% av blodinfektioner orsakas av bakteriearter, såsom Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa och enterokocker. Dessa bakterier effektivt identifieras av MALDI-TOF MS som sannolikt positivt påverka de goda resultaten av MALDI-TOF MS identifiering utföras direkt på blododlings bakteriella pellets. Den låga prestanda för identifiering av vissa bakteriearter med MALDI-TOF MS utförs på blododlings pellets beror främst på liknande faktorerän de som observerats för den konventionella identifiering från rena kolonier odlas på agarplattor. Exempelvis flera mikrobiella arter såsom streptokocker tillhör mitis gruppen och koagulasnegativa stafylokocker är nära besläktade och identifieras med låg noggrannhet med MALDI-TOF MS. Dessutom en speciell komposition av den bakteriella cellväggen hos grampositiva bakterier eller närvaron av en tät kapsel observerades i bakteriearter såsom Klebsiella pneumoniae minskar signifikant lys effektivitet och därmed utförandet av MALDI-TOF-MS-identifiering. Slutligen är den låga prestandan hos MALDI-TOF MS för identifiering av anaeroba bakterier främst på grund av en ofullständig och dålig representation av dessa bakterier i MALDI-TOF-databas.

Den lilla reducerad prestanda för MALDI-TOF MS identifiering av blododlings pellets jämfört med konventionell identifiering från rena kolonier kan bero på kvarvarande blodprotein components eller att en otillräcklig mängd av bakterier erhållna efter lys-centrifugering. Likaså de skillnader som observerats med de automatiserade mikrobiella systemet kort ympade direkt med blododlings pellets jämfört med dem som ympas med isolerade kolonier kan orsakas av kvarvarande blododlingskomponenter såsom proteiner, blodkroppar och blodmedel föreningar som kan störa bakterietillväxt i automatiserad mikrobiell systemet kort och kan ha en betydande inverkan på både identifikation och AST. Dessutom AST resultat som automatiserade mikrobiella system måste kontrolleras av disk diffusionsanalyser också utförda direkt på blododlings bakteriella pellets för att validera resultaten av vissa antibiotika som är kända för att uppvisa betydande skillnader jämfört med konventionella metoder. Men direkt inokulering av automatiserade mikrobiella systemet kort med blododlings pellets ger en utmärkt ID och AST prestanda för både Enterobacteriaceae och Staphylococci.

Således har den bakteriella pelleten som erhålls genom ammoniumklorid lys centrifugering av positiva blododlingar validerats för att direkt utföra flera nedströms tillämpningar möjliggör en snabb rapportering av viktiga resultat, t.ex. ID och AST i en signifikant reducerad TAT jämfört med konventionella metoder. Dessutom har ytterligare applikationer såsom förlängd spektrum β-betalaktamaser (ESBL) testning validerats på liknande lys centrifugering av positiv blododling metodiker 20 tyder på att de också kunde tillämpas på bakteriepellet som erhålls med det protokoll som beskrivs i detta arbete.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar de tekniker för bakteriologi laboratorium vid University Hospital Center i Lausanne för deras hjälp att genomföra de tekniker i laboratoriet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter