Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

doi: 10.3791/51985 Published: October 15, 2014

Summary

Pozitif kan kültürü hızlı bir Bakteri taneleri bir preparasyon, MALDI-TOF ile tanımlama, Gram boyama antibiyotik duyarlılık testi ve PCR-esaslı testi gibi uygulamalar için bir numune olarak kullanılabilir. Sonuçlar hızla kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için klinisyenler için tebliğ edilebilir.

Abstract

Kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Bakteriyemi muzdarip hastaların başarılı bir sonuç optimum antibiyotik tedavisine rehberlik enfeksiyöz ajan hızlı bir tanımlanmasına bağlıdır. Pozitif kan kültürü Gram leke analizi hızla yapılmış ve zaten önemli ölçüde antibiyotik rejimi etkileyebilir edilebilir. Bununla birlikte, enfeksiyöz ajanın doğru tespit hala en iyi hedef tedaviyi saptamak için gereklidir. Burada, disk difüzyon testi ile, MALDI-TOF MS, antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından tespit edilmesi veya otomatik AST sistemleri gibi çeşitli gerekli alt uygulama için bir numune olarak kullanılabilecek bir pozitif kan kültürü hızlı ve basit bir Bakteri taneleri bir preparasyonunu sunmak ve otomatik diagnostik testi PCR tabanlı. Kan kültürü, bakteriyel pelet üzerine doğrudan uygulanabilir bu farklı kimlik ve AST sistemlerinin performansı çok si olanperformansına Milar normal agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler izole elde. Geleneksel yöntemlere göre, bir bakteri pelet hızlı edinimi önemli ölçüde belirlenmesini ve AST hem rapor süresini azaltır. Böylece, aşağıdaki kan kültürü pozitifliği, MALDI-TOF ile tanımlama 8 içinde sırasıyla 18 saat, otomatikleştirilmiş AST sistemleri veya disk difüzyon deneyleri ile AST sonuçları ise daha az 1 saat içinde rapor edilebilir. Benzer bir şekilde, hızlı, PCR bazlı tahlilin sonuçları klinisyene bakteremi raporu müteakiben en az 2 saat iletilebilir. Birlikte, bu sonuçlar, kan kültürü bakteri pelet hızlı hazırlanması kimlik ve AST geri dönüş süresi ve dolayısıyla kan dolaşımı enfeksiyonları olan hastaların başarılı sonuç üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hastanede yatan hastalarda kan dolaşımı enfeksiyonları ve sepsis morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Böylece, enfeksiyonlar kan dolaşımına bağlı mortalite hastanede yatan hasta% 37 ila% 14 gözlenir ve yoğun bakım ünitelerinde hasta 1-3% 35 artabilir. Enfeksiyöz ajan hızlı kimlik optimum antimikrobiyal tedaviyi yönlendirmek ve antimikrobiyal tedavi 4,5'den başarılı sonucunu artırmak için çok önemlidir. Pozitif kan kültürü Gram lekelerin hızlı analiz zaten antimikrobiyal tedavinin 6,7 ama enfeksiyöz ajan doğru kimlik uyarlaması üzerinde önemli bir etkiye sahiptir hastalara iyi adapte antibiyotik tedavi sağlamak için gereklidir. Örneğin, farklı antibiyotik tedavi rejimleri enterokok ve Gram boyama ile ayırt etmek zordur streptokoklar ile bakteriyemi takip uygulanması gerekir. Benzer şekilde, türlere tanımlama levEl 8-laktamlara β karşı arttırılmış bir direnç kazandıran bir kromozom AMPc geni kodlayan, Gram negatif enterobakteriler tespit etmek için gereklidir.

Pozitif kan kültürü ile, geleneksel tanısal yaklaşım biyokimyasal testler, farklı seçici medya büyüme ve otomatik mikrobik tanımlama sistemleri dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar ile ilave inkübasyon öncesinde kimlik birkaç saat gerektirir farklı agar plakaları üzerinde bulaşıcı ajan, altkültürü etmektir. Geleneksel bir yaklaşım teşhis sonuçlarına süresi yaklaşık 1-3 gün taşımaktadır.

Mikroorganizmaların hızlı tespit edilmesi için matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF) teknolojisinin ortaya hızlı bir şekilde pozitif kan şirketinden de agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin mikroorganizmaların değil tanımlamak için yeni bir aleti kültürler (Şekil 1) 9-12. ThKan kültürlerinden bir enfeksiyon ajanı tanımlamak için MALDI-TOF E kullanımı önemli bir kaç dakika yerine geleneksel yöntemlerle gerekli saat ve gün sonuçlarına süresini azalttı. Croxatto ve ark. 13 tarafından ele alındığı şekilde, MALDI-TOF tanımlama etkinliği mikroorganizmaların saflık ve miktarı da dahil olmak üzere farklı parametrelere dayanır. Bu iki kriter kolaylıkla agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler elde edilen ayrı fakat MALDI-TOF kimlik müdahale edebilir bir çok selüler ve protein bileşenlerini içeren kan kültürü gibi kompleks örnekleri, bakteriyel zenginleştirme ve arıtması için bir ön tedavi analitik gerekmektedir.

Kan kültüründen çeşitli mikroorganizmaların izolasyon yöntemleri bakteriyel çıkarma 9,14, serum ayırıcı yöntemi 10 saponin ya da diğer hafif deterjanlar yöntemi dahil, bir çok çalışma kullanılmıştır, lizis santrifüj yöntemleri 12 (Şekil 2) 15 izin amonyum klorür eritrosit-lizis dayalı basit bir kan kültürü, bakteriyel pelet hazırlık geliştirmiştir. Bu kan kültürü pelet hazırlık aynı zamanda Gram boyama gibi diğer doğrudan aşağı uygulamalar için bir örnek sunmak, metisilin dirençli Staphylococcus aureus hızlı tespiti (MRSA) için POCT-PCR'lerine ve antibiyotik duyarlılık testi gibi otomatik PCR tabanlı tanı testleri AST otomatik sistemleri ve / veya agar plakaları üzerinde disk difüzyon deneyleri (Şekil 3) ile incelenmiştir.

Prod'hom ve arkadaşları tarafından açıklandığı gibi, bu çalışmada, kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması için farklı adımları açıklar. 15 (Şekil 4). Biz de de olacakkâtip kan kültürü pelet yapılabilir ana üç uygulama için protokoller: otomatik Enterobacteriaceae için sistemleri 16 ve stafilokok ve otomatik PCR-ile MALDI-TOF 15, kimlik (ID) ve antibiyotik duyarlılık testi (AST) tarafından Identification MRSA 17'nin saptanması için tanısal test göre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol geliştirilmiş ve rutin bir aracı olarak uygulamaya geçirilmeden önce kurumun araştırma ve geliştirme süreçleri ve etik kurallarını takip valide edilmiştir.

Amonyum Klorür Eritrosit parçalayan Usulü ile bir Kan Kültürü Bakteriyel Pelet 1. Hazırlık

  1. Daha sonra santrifüjleme için pozitif kan kültürünün hazırlanması.
    1. Kan kültürü kapağını sterilize edin. Şişenin kapağı üzerinde% 70 etanol ekleyin ve yakmak.
      NOT: Bir laminer akış kaputun altında bu adımı yapmayın.
    2. Laminar akış için şişe taşıyın. 20 G şırınga ile kan kültürü 5 ml toplayın.
    3. Steril su (H2O) 45 ml içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne kan kültür 5 ml ilave edilir ve örnek karıştırın.
  2. Liziz santrifüjleme ile kan kültürü bakteryel tanelerin hazırlanması.
    1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
    2. Remolaboratuar vakum pompası ile (özellikle H2O ve kan hücreleri içeren) süpernatant ettik.
    3. Solüsyonu (0.15 M NH4CI, 1 mM KHCO 3) yokedici ev yapımı amonyum klorür 1 ml pelletini. Kazıyarak ve tüp vorteks pelet bölmek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g'de santrifüjleyin.
    4. Ağırlıklı olarak kırmızı kan hücreleri enkaz içeren süpernatant atın.
      1. Topak hemorajik gerçekleşmemesi durumunda, başka bir artık kırmızı kan hücreleri lize etmek için ve pelet yıkamak için steril damıtık H 2 0 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 140 x g'de santrifüjleyin ve süpernatant atılır.
    5. H2O 200 ul pelletini
  3. Çeşitli seçici ve seçici olmayan agar ortamında kan kültürünün alt kültür.
    1. 20 G şırınga ile kan kültürü 1 ml toplayın.
    2. Kan kültürü int 1 damla aşılamakkan agar, çikolata agar, McConkey agar ve Schaedler agar dört kadran o.
    3. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de kan agarı ve çikolata agar plakaları inkübe, normal bir atmosferde Mc Conkey agar ve anaerobik koşullarda Schaedler agar.
    4. Farklı medya üzerinde bakteri büyümesini izleyin.
    5. Bakteriyel saflık için kontrol edin.

MALDI-TOF MS ile 2. Tanımlama

  1. Kan pelet doğrudan tanımlama.
    1. Transferi 1 MALDI hedef plaka üzerinde kan pelet ul ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın.
    2. 1 ul% 70 formik asit ile örnek Yerleşimi ve 42 ° C ısıtma platformu üzerinde kurumaya bırakın.
    3. MALDI matris 1 ul numuneyi, kaplama ve bir 42 ° C ısıtma platform üzerinde kurumasına izin (α-siyano-4-hidroksisinamik asetonitril-% 2.5 trifloroasetik asit,% 50 asit çözeltisi, doymuş).
    4. MAL geçinÜretici tarafından tarif edildiği gibi, bir MALDI-TOF MS sistemi DI-TOF MS analizi.
    5. Kimlik puanı (puan <2 ile örneğin) tür düzeyinde geçersiz ise, kan numunesinin pelet bir protein çıkarımı gerçekleştirin.
  2. Kan kültürü topağından proteini ekstraksiyon işleminden sonra tanımlanması.
    1. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g'de 70% etanol ve 1 ml santrifüj ile pelet 20 ul karıştırın.
    2. Süpernatant atılır ve% 70 formik asit ve 25 ul pelet% 100 asetonitril 25 ul ekle. Vortex şiddetle pelet tekrar süspansiyon. Vorteks önce pipet uçları ile onları parçalayarak sert pelet süspanse.
    3. Oda sıcaklığında 2 dakika için 13,000 x g'de santrifüjleyin. Aktarım 1, bir MALDI hedef plaka üzerinde yüzer ul (ekstre proteinleri ihtiva etmektedir) ve 42 ° C'de ısıtma platformunda kurumaya bırakın. 2.1.2 anlatıldığı gibi devam edin.

3. Bakteriyel IDENTIFBir Otomatik Mikrobiyal Sistemi ile ication ve Antibiyotik Duyarlılık Testleri

  1. Otomatik bir sistem ile bakteriyel mikrobiyal kimlik ve AST için bakteriyel süspansiyonun hazırlanması.
    1. Mikrobiyal otomatik sistem ile uyumlu steril% 0.45 NaCI çözeltisi 3 ml içeren plastik bir tüp hazırlanır.
    2. 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0,45 NaCl çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün.
      Not: Kan kültürü bakteri topağın hacminin 0,6-0,8 bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir.
  2. Üretici tarafından tarif edildiği şekilde tanımlanması için otomatik Gram-pozitif (GP) veya Gram-negatif (GN) kartları ve Gram pozitif koklar ve Gram-negatif bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi için otomatik AST kartları inoküle.
    NOT: identificatioMALDI-TOF MS kimlik skor değeri> 2 ise n GP veya GN kartlarla uygulanmaz. Kan agar (GP ve GN) ve MacConkey agarı (GN) plakaları üzerinde bakteri süspansiyonu alt-kültürleme ile bakteri süspansiyonu saflığını kontrol edin.

Disk Difüzyon Testi ile 4. Antibiyotik Duyarlılık Testleri

Disk difüzyon deneyi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST, Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org) Avrupa komitesi tarafından açıklanmıştır.

  1. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması disk difüzyon deneyi ile antimikrobiyal duyarlılık testleri.
    1. Steril% 0.9 NaCl çözeltisi, 3 ml ihtiva eden bir cam tüp hazırlanır.
    2. 0.5 McFarland bulanıklığa tekabül eden bir bakteri süspansiyonu elde etmek için% 0.9 NaCI çözeltisi içinde kan kültürü pelet yeterli hacim. Bir densitometer makine kullanarak bulanıklığı ölçün.
      NOT: Kan kültürü hacmiBakteriyel küçük topak, 0,6-0,8 arasında bir McFarland bulanıklık elde etmek için 50 ila 200 ul arasında değişir.
    3. Bakteriyel süspansiyonun vorteksleyin.
  2. Mueller-Hinton agar (MH) veya Mueller-Hinton agar-agar titiz organizmalar (TKF) üzerine bakteri süspansiyonu aşılanması (MH,% 5 at kanı defibrine ve 20 mg / β-nikotinamid adenin dinükleotid L ile takviye edilmiştir).
    1. Bakteriyel süspansiyon içinde bir steril pamuklu çubuk daldırma ve hafifçe cam tüpün iç duvarında çubukla çevirerek fazla sıvıyı çıkarın.
    2. Üç yönde silmeli veya otomatik bir plaka rotator ile MH / TKF agar levhasının tüm yüzeyi üzerine eşit şekilde yayılır bakteri süspansiyonu.
  3. Aşılanmış agar plakaları üzerinde antimikrobiyal disklerin uygulanması.
    1. El ile kurutuldu, aşılanmış agar plakalarının yüzeyi üzerine veya bir duyarlılık bir disk dağıtıcısı kullanılarak yakından diskleri uygulanır.
    2. Uygun tempe inkübe plakasıdüşene ve antimikrobiyal duyarlılık testi EUCAST disk difüzyon yöntemi tarif edildiği gibi atmosfer (Sürüm 3.0 Nisan 2013 www.eucast.org).

5. Otomatik MRSA Belirlenmesi için Tanı Testi PCR tabanlı

  1. Bir mikropipet kullanarak, 20 sn boyunca PCR tabanlı tanı test kiti ve vorteks otomatik MRSA ile sağlanan örnek reaktif şişenin içine kan kültürü pelet 50 ul aktarın.
  2. 1 ml'lik bir mikropipet kullanılarak kartuşun örnek portuna numuneyi dağıtmak. PCR sisteminin otomatik olarak kartuşunun takılması ve üretici tarafından tarif edildiği gibi tahlil başlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Prod'hom ve ark. 15 tarafından yapılan çalışmada, 78 hastadan 122 pozitif kan kültürü amonyum klorür liziz santrifüj ile elde edilen bakteriyel peletler MALDI-TOF MS ile analiz edilmiştir. 122 pozitif kan kültürü üzerinden, 95 (% 77.9) doğru cins düzeyinde tür düzeyinde ve bir (% 0.8) olarak tespit edilmiştir. Geri kalan 26 (% 21.3), kan kültürü topaklar, MALDI-TOF ile güvenilir bir kimlik verdi. Bunlar arasında, 21 13 streptokok ve 5 koagülaz-negatif stafilokok içeren gram pozitif bakteri. Önemli olarak, 13 tanımlanamayan streptokok üzerinden 10 genellikle zor lize kapsül sahiptir ve S. türünden pek ayırt Streptococcus pneumoniae idi MALDI-TOF MS ile mitis, grubunu temsil eder. Beş Gram-negatif bakteriler, dört zor Lyse iki Klebsiella pneumoniae ve iki Haemop de dahil olmak üzere, bakteri türleri kapsüllenmiş aralarında, MALDI-TOF ile tespit edilmemiştirhilus influenzae. Bu nedenle, MALDI-TOF ile doğru tespiti agar plakaları 11 üzerinde yetiştirilen bakteri kolonilerinin tespiti geleneksel elde tanımlama% 84,1 ile karşılaştırıldığında etkili bir performans gösteren kan kültürü peleti% 78,7, olarak elde edildi.

Bakteri tanımlama (İD) ve AST için için otomatik mikrobiyal sisteminin performansı küme ve Gram-negatif bakterilerde Gram pozitif koklar için pozitif kan kültürü 278, bakteri peletlerinden üzerinde test edilmiştir. Bu sonuçlar, uygun bir ortamda 16 pozitif kan kültür alt kültürü, aşağıdaki agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler ikinci mikrobiyal otomatik sistem kart ile elde edilen geleneksel sonuçlarla karşılaştırılmıştır. MALDI-TOF MS ile bakteryel tanelerin tanımlanması başarısız olduğunda, mikrobiyal ifade sistemi kimlik kartları ile doğrudan tanımlama kullanılabilir. MALDI-TOF MS, doğru tanımlama ile bir nihai kimlik karşılaştırıldığındamikrobiyal tanımlama sistemi kimlik kartları Enterobacteriaceae% 99, stafilokok 74%, non-fermentatif Gram-negatif bakterilerin% 71 ve diğer Gram-pozitif koklar% 33 gözlenmiştir. Bakteriyel pelet% 8 hayır kimlik verdi oysa misidentifikasyon toplam olguların% 11 gözlenmiştir. 87 Enterobacteriaceae ve 133 de dahil olmak üzere 220 ​​stafilokoklar bakteri peletlerinin toplam otomatik mikrobiyal sistemi AST GN26 ile AST ve AST 580 kartları 16 için analiz edilmiştir. Sonuçlar çok önemli bir hata (VME) ve önemli bir hata (ME) gibi bir yanlış dirençli olarak yanlış duyarlı tanımlanan yorumsal anlaşması sonuçları için ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından verilen tanımlara göre analiz edildi. Agar plakaları yetiştirilen kolonilerden aşılamadan karşılaştırıldığında kan kültürü pelet doğrudan aşılama elde AST% 0.1 VME ve Enterobakteriler için% 0,3 ME, ve% 0.7 VME ve stafilokoklar için% 0.1 ME gösterdi. AST ve böylelikle performansınKan kültürü pelet ile doğrudan aşılanan kartları FDA tarafından kabul performans kriterleri ile uyum içindedir.

Spa hedefleme PCR-bazlı nükleik asit amplifikasyon teknolojisi, MRSA testinin performansı, MecA ve SCC genlerin, doğrudan, MALDI-TOF MS tarafından belirlenen 17 Staphylococcus aureus kan kültürü bakteri peletler üzerine uygulanmıştır. 106 olguda dayanarak, metisilin direncinin tespiti% 99 duyarlılık ve% 100 özgüllük sergiledi. İlginçtir, medyan süre kan kültürü pozitif gelen nükleik asit amplifikasyon teknolojisi sonuçlarını rapor olarak benzer sonuçlar 97 dakika (aralık eşit olduğunu bildirmek için MALDI-belirlenmesinden medyan süresi ise 201 dakika (aralık 100-430) eşit 25- 250).

Şekil 1
Şekil 1. öncesi ve sonrası MALDI-dönemi. Bir O / numunenin N altkültürü bulunur konvansiyonel tanı yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, MALDI-TOF MS kimlik teşhis laboratuvarına numuneler teslimini takiben birkaç dakika içinde yapılabilir. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 2
Şekil MALDI-TOF MS kimlik örnekleme gelen kan kültürü işleme 2. iş akışı. Kan kültürlerinde olduğunda, bir bakteri topağı liziz santrifüj amonyum klorür ile hazırlanır. Bu pelet, bundan sonra, bakteriyel, MALDI-TOF MS tarafından doğrudan belirlenmesi için kullanılır. MALDI-TOF MS kimlik 60 dakika FO sonra 30 gün içinde elde edilebilir llowing kan kültürü pozitifliği. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Bu tür MRSA tespiti için bakım test PCR'ler noktası (POCT-PCR) gibi otomatik sistemler ve / veya disk difüzyon deneyleri ve hızlı PCR tabanlı test kullanılarak Gram boyama, MALDI-TOF MS tanımlama, AST olmak üzere Şekil 3. Birçok aşağı uygulamaları, Kan kültürü, bakteriyel pelet üzerinde doğrudan yapılabilmektedir. bakteri, kan kültürü peletlerinden Doğrudan test anlamlı kan dolaşımı enfeksiyonlarından muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek için önemli olan kimliği ve AST sonuçlarını rapor-dönüş süresini azaltmak. 5fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4. amonyum klorit parçalama santrifüj protokolü pozitif kan kültür sıvılarında bir zenginleştirilmiş ve saflaştırılmış bakteri pelet hazırlanmasını sağlar. Escherichia coli pozitif kan kültürü Gram boyama, koagülaz-negatif stafilokok capitis, ve Streptococcus dysgalactiae önce ve hazırlanması sonra gerçekleştirilen Bakteriyel küçük topak, kan kültürü. Kümeleri ve zincirlerinde streptococci stafilokok klasik morfolojileri daha kolay kan kültürü bakteri peleti daha doğal kan kültürü suyu içinde görülmektedir. Ölçek 25 bar um =.= "_blank"> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Geleneksel pozitif kan kültürü tanı yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, amonyum klorür parçalama santrifüj yaklaşımı kullanarak bakteriyel pelet hızlı edinimi 24 saat ve 48 saat 24 ile AST rapor süresi (Şekil 1 ve 16'dan kimlik rapor süresini azaltmak 3).

Uygun antibiyotik tedavisi hızlı bir giriş kan dolaşımı enfeksiyonları muzdarip hastaların sonuçlarını iyileştirmek esastır. Böylece, yaklaşık 8 ila 16 saat içinde elde edilen hızlı bir AST ardından 1 saat içinde enfeksiyöz ajanların erken tanımlanması septik hastaların klinik yönetiminde önemli bir etki gösterir. Gram boyamanın hızlı raporlama zaten antimikrobiyal tedavisi ve böylece hasta morbidite ve mortalite 6,7 azalma ile büyük bir etkisi ile ilişkili olmuştur. Kan kültürü, bakteriyel pelet Gram boyama duyarlılığını artırmak için yapılabilir zaman bl Gram boyamaood kültür brotu negatif veya zayıf pozitif (Şekil 4). Ancak doğal kan kültürü bulyonunda yapılan Gram boyama gibi zincirler, kümeler halinde stafilokok veya streptokok gibi tipik morfolojileri gözlemlemek için tavsiye edilir. Gram boyama olguların 8 20% sadece ek bir etkisi vardı oysa kan dolaşımı enfeksiyonu 202 olguya yeni bir prospektif çalışmada, kan kültürü peletlerinden MALDI-TOF MS kimlik olguların% 35.1 olarak antibiyotik tedavisinin bir etkisi gösterdi. Böyle AmpC üreten Enterobacteriaceae olarak artmış antibiyotik direnci ile ilişkili bakteriler MALDI-TOF MS ile tespit edilmiştir İlginçtir, klinik yönetimi Gram boyama ve MALDI-TOF MS kimlik raporlama arasında etkisi maksimum fark gözlenmiştir. Benzer şekilde, Martiny ve ark. MALDI-TOF MS hızlı kimlik retrospektif bir damızlık ise olguların% 13.4 antibiyotik tedavisinin adaptasyonunu tutturmak olabileceğini göstermiştiry Stoneking ve arkadaşları tarafından yapıldı. bakteriyemi neden olan mikroorganizmaların hızlı bir kimlik ya ilk rejime veya antibiyotik 18,19 spektrumunu azaltarak kapsamında olmayan ek bir antibiyotik idare tarafından olguların% 77'sinde ampirik tedavi ayarlayarak yardımcı olabilir önerdi . Ayrıca, bu tür nükleik asit amplifikasyon teknolojisi, MRSA olarak hızlı bir PCR bazlı bir tahlilin kullanımı S. şu kan kültürü peletlerden MALDI-TOF MS ile tanımlama aureus, S. olan hastalar için en az 4 saat, en uygun antibiyotik terapisi sağlamak üzere bırakıldı aureus bakteriyemi 17. Penisilin alerjisi olan hastalar hariç zaman, nükleik asit amplifikasyon teknolojisi kullanımının, MRSA gibi% 26.1 den% 8.1 glisopeptitlere gibi anti-MRSA antibiyotikler kötüye önemli bir azalma sağladı. Bununla birlikte bu veriler, Gram boyama, MALDI-TOF MS üzerinde tanımlanması ve hızlı, PCR bazlı, bir hızlı ardışık raporlamakan kültürü peletlerden ssay önemli antibiyotik tedavisi ve bu nedenle klinik yönetimi yanı sıra kan dolaşımı enfeksiyonları olan hastaların sonucunun gelişmesine edilir.

MALDI-TOF MS agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin saf üzerinde gerçekleştirilen geleneksel MALDI-TOF MS ile elde edilen% 84.1 bir tanımlama hızına göre çok iyi bir performans kan kültürü peletleri% 78.7 doğru tanımlamayı izin verdi. Daha kan dolaşımı enfeksiyonlarının% 50 gibi Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve enterokok gibi bakteriyel türleri tarafından meydana getirilmektedir. Bu bakteriler, verimli bir şekilde de olumlu kan kültürü bakteri peletler üzerine direk olarak uygulanan, MALDI-TOF MS kimlik iyi performansını etkileyen MALDI-TOF MS ile tespit edilir. MALDI-TOF MS tarafından, bazı bakteri türlerinin tanımlanması için düşük performans kan kültürü peletleri üzerinde gerçekleştirilen esas olarak benzer faktörlere bağlı olarakagar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin saf olan geleneksel tanımlanması için gözlenenden daha. Örneğin, bu tür Streptokok mitis grubu ve koagülaz-negatif stafilokok ait gibi çeşitli mikrobiyal türler yakından ilişkili ve MALDI-TOF MS ile düşük bir hassasiyet ile tespit vardır. Ayrıca, Gram-pozitif bakterilerin bakteri hücre duvarının özel bir bileşim veya Klebsiella pneumoniae gibi bakteri türlerinde gözlendiği yoğun bir kapsülün olmanın bir liziz verimliliğini ve dolayısıyla, MALDI-TOF MS kimlik performansını düşürebilmektedir. Son olarak, anaerobik bakterilerin tanımlanması için, MALDI-TOF MS düşük performans MALDI-TOF veri tabanında bulunan bu bakterilerin bir eksik ve kötü temsil kaynaklanmaktadır.

Saf kolonilerden geleneksel kimlik kıyasla kan kültürü peletlerden, MALDI-TOF MS kimlik küçük düşük performans bunun kalan kan proteini c olabilir,omponents veya lizis-uygulanan santrifüj işlemi sonrasında elde edilen bakteri yetersiz bir miktarının verilmesini içerir. Aynı şekilde, bakteriyel büyümeye müdahale olabilir izole edilmiş koloni ile bu tür proteinlerin, kan hücreleri ve kan bileşenleri gibi orta kalan kan kültür bileşenlerinin neden olabilir kıyasla kan kültürü pelet doğrudan aşılanmıştır otomatik sistem mikrobiyal kartları ile gözlenen farklar mikrobiyal sistem kartları otomatik ve tanımlama ve AST hem de önemli bir etkiye sahip olabilir. Ayrıca, otomatik mikrobik sistemlerde elde AST sonuçları da geleneksel yaklaşımlara kıyasla önemli çelişkileri sunmak için bilinen bazı antibiyotiklerin sonuçlarını doğrulamak için kan kültürü, bakteriyel pelet doğrudan uygulanan disk difüzyon deneyleri tarafından kontrol edilmesi gerekir. Ancak, kan kültürü pelet ile otomatik mikrobiyal sistem kartlarının doğrudan aşılama Enterobacteriaceae ve staphy hem de mükemmel bir kimliği ve AST performansı sunarlococci.

Böylece, pozitif kan kültürlerinin amonyum klorür lizis santrifüj ile elde bakteriyel pelet doğrudan bu geleneksel yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış TAT'nin kimliği ve AST gibi temel sonuçlarının hızlı bir raporlama sağlayan birkaç aşağı uygulamalarını gerçekleştirmek için valide edilmiştir. Ayrıca, bu gibi geniş spektrumlu β-laktamaz (penisilinler ve sefalosporinler), test gibi ek uygulamalar pozitif kan kültürü lisis benzer santrifüj ile doğrulanmıştır ayrıca bu çalışmada tarif edilen protokol ile elde edilen bakteryel tanelerin üzerine uygulanabilir olduğunu düşündürmektedir 20 metodolojileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz laboratuvarda tekniklerini uygulamak için onların yardım için Lozan Üniversitesi Hastanesi Merkezi bakteriyoloji laboratuarının teknisyenleri teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 G needle Terumo, Leuven, Belgium NN-2038R
50 ml Falcon tube BD, Franklin Lakes, NJ, USA 352070 50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure Merck, Darmstadt, Germany 101145
Potassium hydrogen carbonate Fluka, St. Louis, MO, USA  60340
Formic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  F0507 Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Fluka, St. Louis, MO, USA  70990 Acute toxicity
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  271004 Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA  T6508 Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27202 automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21342 automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 22233 automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 21341 automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 413391 automated microbial AST system
Xpert MRSA Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA  GXMRSA-100N-10 nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXIV-4-D nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument Bruker Daltonics, Bremen, Germany BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC Bruker Daltonics, Bremen, Germany 280799 MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 27208
MALDI Sepsityper kit 50 Bruker Daltonics, Bremen, Germany 8270170
Mac Conkey agar Biolife, Milano, Italy 4016702
Mueller-Hinton agar Oxoid, Hampshire, England CM0337 Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF agar Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France 43901 Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254071 blood agar
BD chocolate agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254089 chocolate agar
BD schaedler agar BD, Franklin Lakes, NJ, USA 254084 Schaedler agar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
  2. Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
  3. Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
  4. Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
  5. Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
  6. Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
  7. Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
  8. Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
  9. Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
  10. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
  11. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
  12. Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
  13. Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
  14. Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
  15. Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
  16. Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
  17. Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. (2013).
  18. Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
  19. Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
  20. Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).More

Croxatto, A., Prod'hom, G., Durussel, C., Greub, G. Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing. J. Vis. Exp. (92), e51985, doi:10.3791/51985 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter