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Neuroscience

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Published: September 24, 2014 doi: 10.3791/51991
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Assumption College

Summary

세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.

Abstract

뉴런은 감각, 운동 모터, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능을위한 필수적인 정보를 전달 다각적 세포이다. 생체 내에서 뉴런을 공부하는 것은 그들의 복잡성, 그들의 다양하고 역동적 인 환경 및 기술적 한계에 도전 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 시험 관내에서 신경 세포를 연구하는 신경 세포의 복잡한 신비를 푸는 유익한 증명할 수 있습니다. 세포 배양 모델의 잘 정의 된 자연 환경 조건과 변수를 통해보다 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 여기에서 우리는, 분리 해리, 그리고 병아리 배아에서 배양 주 뉴런하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 급속 저렴하고 견고 감각 신경 성장 생성한다. 절차는 지속적으로 높은 신경 세포에 충실 문화를 생산하고 거의 비 신경 세포 (5 % 미만)이 있습니다. 차 뉴런 따라서 자세한 절차는이 디스탱을 만들, 치료 유리 또는 조직 배양 플라스틱에 잘 고착되지 않습니다CT, 신경 도금 잘 정의 된 라미닌 함유 하층 설명한다. 배양 된 신경 세포 공동 면역 침전, 라이브 셀 상상, RNAi를하고, 면역 세포 등 다양한 세포 및 분자 기술에 매우 의무가 있습니다. 이 배양 된 신경 세포를 두 번 면역 세포 화학에 대한 절차 최적화 여기에 설명되어있다.

Introduction

뉴런은 감각, 비전, 모터 운동, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능에 필수적인 정보를 전달 복잡한 세포입니다. 다른 세포 유형에서 독특한는 뉴런 통신에 필수적인 신경 도로를 형성하도록, 아암 형상 프로세스라는 축삭을 연장. 성장 축삭의 끝에있는 개발 전문 구획 동안의 적절한 대상으로 축삭을 이끌 세포 외 신호의 콘서트를 탐색, 성장 콘을했다. 성장 콘 탐색의 기초가 복잡한 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 더 나은 이러한 메커니즘을 이해하기 위해, 연구자들은 정의의 단순화 된 체외 환경에서 뉴런을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 사용하고 있습니다. 신경 세포의 분화 2, 세포 골격 역학, 엔도 시토 시스와 인신 매매, 덴 드라이트 (dendrite) : 문화 1에서 공부 뉴런을 포함, 신경 세포 생물학에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 주도하고있다규제 3,4, 축삭 재생 5, 및 신경 병증 6 임상 조건. 또한, 배양 된 신경 세포는 면역 세포, 세포 표면 공동 - 면역 침전, 웨스턴 블롯, 형질 감염, RNAi에, 이러한 성장 콘 운동성 인터벌 분석과 같은 라이브 영상을 포함한 연구 기법의 넓은 범위에 높은 의무이다. 따라서, 차 뉴런을 배양하여 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 규명 할 수있는 강력한 방법이다.

세포 배양 모델은 환경 조건 및 변수를 세부적으로 제어 수사관을 제공합니다. 예를 들어, 신경 도금 (시 및 성장)이되는 하층이 쉽게 조작 할 수있다. 여기서 우리는 두 가지 하층 낮은 라미닌-1 농도가 하나 라미닌-1의 농도를 포화와 다른 생성에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 놀랍게도, 동일한 분자의 다른 농도 극적인 효과를 가질 수있다뉴런의 내부 상태뿐만 아니라 세포 표면에 조성물. 예를 들어, 인테그린의 캠프 및 표면 수준의 세포 내 수준이 두 하층 7,8에 도금 뉴런에서 크게 다르다. 추가 연구는 피브로넥틴 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 충격 세포 표면 분자의 발현 및 신경 운동성 7-11을 포함하는 다른 분자를 보여 주었다. 또한, 예컨대도 세포막 조성물 및 신경 운동성 12-16 영향 용이하고 정확하게 세포 배양 모델에서 조작 할 수 neurotrophins 및 neurotropins 수용성 분자.

여기에, 우리는 방법을 분리 및 문화 병아리 배아에서 감각 신경 해리에 대해 설명합니다. 이 절차는 축삭의 파생물 5,7,8,10,11,16-21을 포함하여 신경 생물학에서 중요한 돌파구를 만들기 위해 사용되었으며, 신경절 세포 (22)을 분리하도록 설계 절차에서 수정되었습니다. 이 있습니다이 방법의 몇 가지 이점. 먼저, 병아리 후근 신경절 (DRG) 개발 많은 기능도 탄생 축삭 연장을위한 시간 프레임을 포함한 것을 특징으로하며, 단백질 발현, 따라서 관내 실험에서 유익한 구축 할시에 유익한 기초를 제공 2,23-28 프로필. 둘째, 연결을 문화가 조사가보다 직접적으로 해리 신경 세포와 비 신경 세포를 모두 포함 (신경 세포와 비 신경 세포를 포함) 그대로 DRG 외식 및 / 또는 혼합 문화를 사용하는 다른 방법에 비해 신경 세포를 연구 할 수 있도록 해리. 셋째, 여기에 설명 된 절차는 간단 저렴하고 학부생 의무가 있습니다. 따라서,이 기술은 연구뿐만 아니라 교육 목적으로 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜의 사소한 변화는 DRGs 이외의 소스에서 신경 세포의 빠르고 높은 수율 정화를 허용해야합니다. 예를 들어,이 과정은 ENR neuronally 제공하도록 변형 될 수있다전뇌 배아 또는 척수 등의 다른 조직으로부터 배양 iched.

면역 세포 화학 프로토콜이 해리 신경 배양을 위해 최적화되어 있고 여기에 상세하게 설명된다. 신경 세포 부착 분자 (NCAM) 및 β1 인테그린 대한 이중 면역 세포 화학을위한 절차가 제공된다. 이러한 면역 조직 화학적 방법에서 생성 된 데이터는 배양 된 신경 세포에서 8,16 공간적 패터닝 여러 분자의 강도를 검사하는데 사용되어왔다.

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Protocol

1 커버 슬립 준비 : 산 세척 및 구워

  1. 최소 2 일 전에 해부 (2 단계)로 된 커버를 준비하려면 다음 단계를 시작합니다. 오일과 철저하게 청소 된 커버를 제거 할 수있는 산 세척 단계를 수행합니다.
  2. 수직으로 된 커버를 배치하고 서로 닿지에서 그들을 방지 도자기 홀더에로드 된 커버. 2 M 염산 (HCL)로 채워진 유리 조직 학적 용기에 홀더와 커버 슬립을 담근다. 도자기 홀더를 사용할 수없는 경우 또는, 100mm 유리 페트리 접시의 바닥을 커버하고 2 M 염산에 커버 슬립 잠수함 20 커버 슬립 수평 ~ 퍼졌다.
  3. 흄 후드에서 로커 테이블 (산에 침수 된 커버와 함께) 유리 용기를 놓고 실온에서 적어도 5 시간 동안 락을 부드러운 수 있습니다. 또한, 산 세척 하룻밤 동일한 조건으로 된 커버.
  4. 도자기 홀더로드 전송하여 증류수 H 2 O DH (2 O)로 된 커버를 세척dH보다 2 O. 가득 깨끗한 유리 조직학 컨테이너에 2 M 염산에서 커버 슬립과 함께 또한, 커버 슬립 유리 페트리 접시에서 2 M 염산을 가만히 따르다 및 dH보다 2 O.로 리필
  5. 다시 dH보다 2 O 경사 분리와 신선한 dH보다 2 O. 유리 용기를 리필하여 세척 3 빠른 세척 총 반복합니다.
  6. 로커에 (커버 슬립와 dH보다 2 O) 유리 용기를 반환하여 더 이상 세척 요법을 시작합니다. 실온에서 10 ~ 30 분 동안 교반과에 대한 허용합니다. 그런 다음, dH보다 2 O를 가만히 따르다 신선한 dH보다 2 O. 추가 적어도 10 세척 총 반복합니다. 또한, 하룻밤 세척을 계속합니다.
  7. 350 °의 C로 예열로에 세척 된 커버를 놓습니다. 도자기 홀더를 사용하는 경우, dH보다에서 2 O 채워진 유리 용기를 홀더를 제거하고 직접 용광로로 된 커버와 홀더를 배치합니다. 유리 페트리 접시를 사용하는 경우, dH보다 2 O를 가만히 따르다 및 furnac로 된 커버와 유리 접시를 배치전자.
  8. 적어도 다섯 시간 밤새 350 ° C에 대한 커버 슬립 굽는다.
  9. 굽​​기가 완료되면, 미세 집게로 도자기 홀더에서 커버 슬립을 제거하고 멸균 100mm 유리 페트리 접시에 놓습니다. 원래 유리 페트리 접시에서 도자기 홀더에 배치되지 않은 커버 슬립을 둡니다.

2 병아리 해부 및 DRGs의 분리

  1. 비옥 제거 (부드러운 락으로 37-38.5 ° C에서 개최) 인큐베이터에서 화이트 레그혼 종 병아리 달걀을 벌였다.
    참고 : 이전의 연구는 DRGs 2,8,11-13,16의 분리를 위해 배아 일 7-10 사용했다.
  2. 층류 후드에서 선택한 계란을 넣습니다. 멸균 솔루션과 악기 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다. 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 모든 솔루션을 제공합니다.
  3. 플라스틱 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 또 다른 100mm 페트리 접시에 배아를 전송하는 표준 집게를 사용합니다.
  4. 따뜻한 F12HS10 추가 (햄 F12, 10 mM의 HEPES, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 소 태아 혈청 0.1 mg)을 웨트 티슈를 유지 파스퇴르 피펫 가진 접시한다. 그 몸 윗면 (그림 1A)에 배아를 위치 집게를 사용합니다.
  5. 층류 후드에서 양안 입체의 해부 현미경에 배아 조직을 포함 100mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. 심장, 폐 등의 장기를 노출하는 현상 진피를 집어 목 꼬리에서 수직 중간 선 절개를하여 미세 집게를 사용합니다. 대안 적으로, 내부 기관을 노출 작은 눈물 일련의 확인.
  6. 부드럽게 멸균 미세 집게 2 세트 사용) 목을 잡고 b)는 꼬리를 향해 심장에 바로 위에있는 대동맥 또는 기타 조직을 잡고 끌어가,동물 eviscerating.
  7. 조직에 파스퇴르 피펫 따뜻한 F12HS10을 적용합니다. 개발 갈비뼈, 척추 및 DRGs (그림 1B-1D)를 노출 남아있는 심장 혈관, 호흡기 나 소화 기관을 제거하는 집게를 사용하십시오.
  8. 해부 현미경, 상기 리브 열등 요추 척추의 양쪽을 따라 DRGs를 장기를 제거하고 수집하는 미세 집게를 사용합니다. 배아에서 그대로 DRGs를 따 버릴에 의해 DRGs를 수집합니다. 핀치와 척수를 향해 DRG에서 도달하고 주변 또는 그 반대 방향으로 DRG에서 도달 개발 신경을 잡고 뿌리를 절단.
  9. 따뜻한 F12HS10 가득 35mm 배양 접시에 그대로 DRGs를 놓습니다. 미세 집게로 집어 35mm 접시에 그대로 DRGs에서, 같은 DRGs에 부착했을 수 지느러미 또는 복부 뿌리로, 초과 조직을 제거합니다.
  10. 요추 우수 DRGs를 얻으려면, 흉부 및 cervi의 복부의 절반을 제거칼 척추. 이것은 상부 경추 영역에서 척수 축과 상부 요추의 다른 절단 직교 현상 척주에서 절단함으로써 행해진 다. 그 후, 상처가 오른쪽 및 척주의 왼쪽 측면을 따라 척수 축에 평행하게. 드러내는에게 척수 (그림 1E-1 층) 노출 배아에서 척추의 복부 절반을 올립니다.
  11. DRGs에 쉽게 액세스 할 수 있도록하려면, 미세 집게로 척수를 잡고 흉추 및 경추 척수를 제거합니다. 척추에서 척수를 들어 올릴 집게를 사용합니다. 근사화로서, 흉추 척수 리브의 수준이며 치경부는 리브 우수하다.
  12. 미세 집게로 그대로 흉부와 경부 DRGs를 수집하고 다른 DRGs 따뜻한 F12HS10에 배치합니다. DRGs을 준수 할 수 초과 조직을 제거합니다.
  13. 도움 F12HS10와 새로운 유리 파스퇴르 피펫의 내부를 씻어피펫의 벽에 달라 붙는 것을 DRGs를 방지 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 원뿔 관에 작은 배양 접시에서 모든 DRGs 및 F12HS10를 전송하고 바로 3 단계로 진행하기 위해 세척 피펫을 사용합니다.
    NOTE : 추가 배아 DRGs의 수를 증가시키기 위해 해부된다. DRGs는 3 단계에 대한 준비가 될 때까지 37 ° C에서 F12HS10에 보관해야합니다.

3 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 1 부

  1. 그대로 DRGs 원심 분리기에 부드럽게와 장소 원뿔 관은 2 ~ 3 분 (200 XG)를 회전. DRGs 튜브의 바닥에 침몰 한 것을 확인합니다. 그렇지 않다면, 다시 스핀.
  2. 피펫을 사용하여 부드럽게 방해받지 DRG 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. DRGs의 펠렛을 빠지 1 배 칼슘과 마그네슘 무료 (CMF) PBS의 2 ML을 추가합니다. 다시 스핀 그대로 DRG 펠렛을 유지하면서 CMF PBS를 제거합니다. 다음 단계에서 트립신 소화 방해하는 F12HS10의 소 태아 혈청을 제거하기 위해 세척 세의 총이 세척 과정을 반복.
  3. 2 ml의 CMF PBS와 DRGs를 포함하는 15 ML 튜브로 가온 트립신 2 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 해리 세포로 DRGs를 소화하는 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브.
  4. 배양하는 동안, F12H + 보충 함유 미디어를 만들 (햄의 F12, 10 mM의 HEPES 100 단위 / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 NG / ㎖ NT3, 10 NG / ML NGF, 200 MM의 L-글루타민 및 N2)와 따뜻한 37 ° C의 물을 욕조에. 일반적으로, 전체 미디어의 10 ml의 기본 감각 뉴런의 4-5 35mm 요리에 충분하다. 또한 해동 라미닌 한 코팅 된 커버 (4 단계)에 대한을 시작합니다.
  5. 시각적으로 부드럽게 씹다 P1000 피펫 트립신 용액 DRGs하고 그대로 DRGs의 부재에 대한 검사. 그대로 DRGs가 더 이상 눈으로 볼 때까지 분쇄를 계속 및 / 또는 그대로 DRGs가 해리 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 이상 트립신 배양을 위해 할 수 있습니다. , 손상 DRG 신경 세포를 보호 분쇄하는 동안 공기 방울을 방지하고 <30 분에 트립신 소화를 제한합니다.
  6. Centrifug해리 DRGs를 함유 펠렛을 형성하기 위해 3 ~ 5 분 동안 200 XG에서 트립신 E 튜브. 펠릿이 형성 될 때까지 필요한 경우 더 이상 봐.
  7. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 트립신을 대기음. 펠렛 F12HS10 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 P1000 피펫 팁 DRGs를 씹다.
  8. 100mm 배양 접시에 15 ML 원뿔 관에서 모든 내용을 전송합니다. 10 ㎖의 총 시간에, 2 ml의 8 ML의 F12HS10 함께 튜브를 세척하여 배양 접시에 옮긴다. 이러한 세정 단계는 튜브의 벽에 부착 남아있는 세포를 수집 할 수 있습니다.
  9. 100mm 배양 접시에 놓습니다 (10 ml의 F12HS10와 및 DRG 세포를 해리) 3 시간 동안 가습 37 ° C 배양기에.
    NOTE : HEPES는 CO 2의 부재 매체의 pH를 완충하기 때문에 CO 2 인큐베이터에 필요한 것은 아니다. 배양 중에 신경 교세포 느슨하게 폐해 침대에 부착하는 경향이 조직 배양 플라스틱 및 신경 세포의 표면에 결합한다.

4 코팅 산 세척라미닌-1와 구운 Coverslips는

  1. 얼음에 냉동 라미닌-1의 멸균 분주 해동.
  2. 멸균 조건 하에서, 라미닌 (1)의 50 μL 분취를 멸균 1X PBS 1 ㎖를 추가한다.
  3. 280 nm에서 라미닌 1의 흡광도 값을 획득하는 분광 광도계를 사용한다. 라미닌 (1)의 농도를 결정하기 위해 다음의 수학 식에이 값을 사용한다.

ABS 280 = (농도 ㎎ / ㎖) * (단백질의 흡광 계수)
라미닌 1의 흡광 계수는 0.86이다.

  1. 멸균 조건 하에서, 1 ㎎ / ㎖, 20 ㎎ / ㎖의 농도를 얻었다 1X PBS로 라미닌 1 희석. 라미닌-1 배양 7,8,10 후 커버 슬립 (30 NG / cm 2 및 300 NG / 각각 cm 2)에 결합의 10 배의 차이를 달성하기 위해 라미닌-1이 두 적용 농도를 사용합니다.
  2. 층류 후드에서, 하나의 산 세정하고, 구운 C를 배치 미세 겸자를 사용한 35mm 배양 접시의 바닥에 overslip. 필요한 접시의 수를 얻기 위해 필요한만큼 반복한다.
  3. 추가 살균을 위해 20-30 분 동안 UV 광에 커버 슬립 대상. 이 단계에서 접시 뚜껑을 유지합니다.
  4. 각각의 유리 커버 슬립을 준비 라미닌-1의 400 μl를 추가합니다. 커버 슬립의 전체 범위를 보장하기 위해 라미닌-1을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 표면 장력은 라미닌-1은 커버 슬립에 남아 필요 배양 접시의 바닥에 전염되지 수 있습니다.
  5. 접시에 뚜껑을 놓고 라미닌-1은 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 배양 할 수 있도록 (3 시간 최적입니다).
  6. 라미닌 인큐베이션 한 후, 층류 후드에서 멸균 PBS로 무균 기술을 이용하여 커버 슬립을 헹군다. 커버 슬립에 솔루션을 제거하고 PBS 400 μl를 추가합니다. 5 ~ 10 분을 기다립니다. 세 린스의 총 반복합니다.
  7. 마지막 헹굼 후 커버 슬립에 PBS를 남겨주세요. 세척시 표면 장력을 아프게하지 마십시오 된 커버가 건조 할 수 없습니다. 르준비가 될 때까지의 집결지 뚜껑 coverlip에 신경을 해리 판에.

5 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 2 부

  1. 배양 후, 부드럽게 해리 DRG 세포를 함유 100mm 접시의 바닥 린스 10 ㎖의 멸균 피펫을 사용한다. 부드럽게 약 3 분의 접시에 7 ㎖의 추방 ~ 피펫 도움으로 F12HS10의 7 ML을 당겨, 45 ° 각도 ~에서 요리를 잡습니다. 부드럽게 신경을 빠지, 배를 반복합니다.
  2. 접시를 돌려 요리의 또 다른 3 분에, 또 다른 여섯 린스를 들어, 절차를 세척 반복합니다. 접시의 3 분의 나머지에 대해 다시 절차를 반복. 이러한 방식으로, 신경 세포를 부드럽게 제거 F12HS10로 접시의 전체 바닥을 헹군다.
  3. 같은 피펫을 사용하여 15 원뿔 튜브에 100mm 접시에서 F12HS10 포함하는 신경 세포를 전송합니다. 세포 펠렛 200g에 5 ~ 10 분 동안 원심 분리기.
  4. 방해받지 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. 따뜻하게 F12H + 보충 2 ㎖로 재현 탁 펠렛.
  5. 원하는 도금 농도 (20 μg / ml의 라미닌 1 8,16으로 코팅 된 커버 1 μg / ml의 라미닌 1 40,000 세포 / ml로 코팅 된 커버 120,000 세포 / ml)를 수득 F12H + 보조제와 같은 필요한 세포를 희석.
  6. 라미닌 - 코팅 된 커버에서 PBS를 제거하고 즉시 커버 슬립에 세포를 400 μl를 배치합니다. 조심스럽게 가습, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 뉴런은 라미닌-1을 준수 할 수 있도록 3 시간에 적어도 1 시간까지 배양 할 수 있습니다.
  7. 무균 조건에서 부드럽게 F12H + 보충 1.6 ml의 신경 세포를 포함하는 35mm 요리를 홍수.
    참고 :이 때, 커버 슬립에 장력이 나눌 수 있습니다 표면. 신경 세포는 적절하게 커버 슬립에 라미닌-1에 부착했다.
  8. 보육 밤새 배양 세포를 돌려줍니다. 다음과 같은 일 면역 세포와 같은 실험을 수행합니다.

(6) Immunocytochemistry

  1. 면역 세포에 앞서, 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 정착 용액 (4 % 파라 포름 알데히드, 30 % 자당 2 배 PBS).
    참고 : 세포를 고정하기 전에, 같은 netrin-1, 미네소타 2 +, 소닉 고슴도치, semaphorin 및 ephrin 16,29-31 등 다양한 시약으로 처리합니다.
  2. 천천히 배양 접시에서 F12H + 보충의 2 ML 1 ㎖를 제거합니다. 부드럽게 따뜻하게 정착 용액 1 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 동안 실온에서 배양 할 수 있습니다.
  3. 조심스럽게 정착 솔루션을 제거하고 2 ㎖의 PBS를 추가합니다. PBS의 응용 프로그램으로 인해 고정 된 세포의 수 빠지을 피하고, 접시의 가장자리를 향해 솔루션을 적용합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
  4. 5 세척 총 PBS 세척을 반복합니다. 세포가 면역 세포의 단계에서 건조 할 수 없습니다.
  5. PBS를 제거합니다. 솔루션 차단 1 ㎖ 적용 (0.1 % 트리톤-X를, 1X PBS, 5 % 정상 염소 혈청). 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 다르게는, 표면 분자 얼룩이용액 팔을 차단 트리톤-X를 사용하지 마십시오.
  6. 제조의 추천되고 차단 솔루션에 기본 항체를 희석. NCAM에 대한 항체 (500)와 β1 인테그린 (16)을 활성화 : 1 사용합니다. 차단 솔루션을 제거 차 항체 용액 1 ㎖를 추가하고 실온에서 또는 하룻​​밤 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
  7. 차 항체 용액을 제거하고 1X PBS 2 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어. 4 PBS 세척의 총 반복합니다. 필요한 경우 세척은 확장 할 수 있습니다.
  8. 1 차 항체를 희석 : 1000을 차단 솔루션에. , PBS를 1 ㎖의 제거보기 차 항체 용액을 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    참고 : 2 차 항체 광 감응성. 이 시점에서 최대한 어두운 용액과 세포를 유지.
  9. 차 항체 용액을 제거하고 이전에 수행으로, 1X PBS로 5 배를 씻어.
  10. Fluoromount의 ~ 60 ~ 80 μl를 적용현미경 슬라이드 위에 G. 미세 집게를 사용하여 부드럽게 현미경 슬라이드에 Fluoromount G에 접시와 하부 커버 슬립에서 커버 슬립을 들어 올립니다. 공기 방울을 피하십시오.
  11. 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 수평으로 슬라이드. 12 ~ 24 시간 후, Fluormount G는 중합하고 coverslip에 단단히 현미경 슬라이드에 첨부됩니다. 이 중합 단계 이후에 이미지의 세포가 완료됩니다.

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Representative Results

여기에 설명 된 프로토콜은 문화에 거의 (예를 들어, <5 %) 비 신경 세포 7,8,10,16와 해리 배아 감각 뉴런의 풍부한 인구를 수사 할 수 있습니다. 수많은 DRGs는 요천 추부, 흉부 및 경부 지역에서 얻을 수 있습니다. 연구자의 필요에 따라 이러한 독특한 해부학 적 영역에서 DRGs를 쉽게 분리 할 수​​있다. 예를 들어, 그림 1은도 1C 및 1D 및도 1E와 1 층에서 흉부 DRGs 강조 요추 DRGs와 절개의 다양한 단계를 통해 병아리 배아의 이미지를 보여줍니다.

배양 된 세포는 쉽게 면역 세포에 의해 표시된다. 여기에서, 배양 된 세포는 β1 인테그린 및 NCAM (그림 2)에 대한 항체와 면역 염색된다. 놀랍게도, 우리는이 후 최대 일년에 형광 염색을 시각화 할 수있었습니다ICC 절차, 슬라이드는 4 ° C에서와 어둠 속에서 수평으로 유지 한 경우. 그러나, ICC 얼룩의 수명은 사용자에 의해 항체 당 결정해야합니다.

신경 세포의 밀도에 따라 확장하는 신경 돌기의 끝에서 성장 콘은 (그림 2D-2F) 시각화 할 수 있습니다. 뉴런은 20 μg / ml의 라​​미닌 일 각각 1 μg / ㎖로 코팅 된 커버에 40000과 120000 세포 / ml에서 도금, 26 시간 게시물 도금까지 수많은 무료 신경 돌기가있다. 이러한 배양은 특히 전체 신경 세포를 분석 이외에 성장 콘 분석에 사용될 수있다. 이전에는이 ​​절차는 성장 콘 속도와 같은 성장 콘 붕괴 8,9,11,13,16과 같은 행동을 평가하는 데 사용되었다. 하층을 준수하지 아르 죽은 신경 세포에서 이러한 커버 슬립 결과에 낮은 도금 밀도. 각 실험에 필요한 정확한 적절한 밀도는 조사원마다 최적화 될 필요가있다.

닭 배아 해부 그림 1 단계는 DRGs를 얻었다. A) 병아리 배아의 등쪽에 누워. 심장 (H)는, 날개 (W)과 다리 (L)이 표시되어 있습니다. 이미지의 상단 머리, 또는 우수 (S)을 향해있다. 이미지의 하단에는 테일 또는 열등한 (I)를 향해있다. R 동물 = 오른쪽, L 동물의 = 왼쪽. 이후의 모든 이미지는 내부 장기는 척추 A.에서 배아에서 제거 된) 같은 방향입니다. B에, 갈비와 DRGs는 볼 수 있습니다. 단순화를 위해, 한 리브 표시되어, 세 대표 DRGs은 검은 색 원으로 확인하고 흉부 및 요추 척추가 표시되어 있습니다. C) 같은 병아리 배아 이미지를 B로 영역을 식별하는 회색 상자 HIG에 표시D. D에 그녀의 배율) 요추 척추 (VC) 지역의 높은 배율. 이보기에서 열한 DRGs의 세 가지가 점선 원으로 식별됩니다. DRGs 라운드 캡슐화합니다. 이러한 기능은 집게. E) 내부 장기와 흉부 척추의 복부 절반의 제거 후 병아리 배아에 그대로 DRGs를 얻을 쉽게합니다. 회색 상자가 척추가 제거 된 곳 지역에서 볼 수 F. F에서 높은 배율) 척수 (SC)에서 표시 영역을 나타냅니다. 이미지의 아래쪽을 향해, ​​요추 척추 (VC)은 그대로입니다. 3 10의 DRGs는 점선 원으로 식별됩니다. DRGs 리브의 각 세트 사이에 발견된다.

그림이
그림 2 배양 차 감각 뉴런 NC에 immunolabeledAM 및 β1 인테그린. 병아리 DRG 뉴런 라미닌-1의 높은 농도에서 배양이 NCAM (A)와 β1 인테그린 (B). C)이 얼룩의 합병 이미지에 대한 면역 양성 있습니다 대부분의 세포가 NCAM 및 β1 인테그린 모두 긍정적 알 수있다. 이러한 조류 감각 신경이 마커 모두 면역 양성입니다. 흰색 그러나, NCAM 네거티브 및 β1 인테그린 긍정적 비 신경 세포. DF) 배양 감각 뉴런의 고배율과 일치 별표로 표시 셀, 전지 본체로부터 연장 신경 돌기가. D가 보여줍니다) 인셋 박스는 신경 돌기의 끝에서 성장 콘의 높은 배율을 보여줍니다.

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Discussion

여기에서 우리는 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 배양은 병아리 배아에서 감각 신경 해리. 이 절차는 시험 관내 7,8,10,16의 고성장 신경 세포의 풍부한 인구를 생성합니다. 다수의 세포 및 분자 기술들은 여기에 설명 된 면역 세포를 포함하여 이들 배양 된 신경에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 최근 정량적 감각 성장 콘 8,16에서 immunolabeled 인테그린 활성화의 강도를 평가하기 위해 사용되었다. 이러한 선행 연구에서, 소프트웨어 프로그램이 정확하게 성장 원추의 원위 단부 20 미크론의 윤곽을 생성하기 위해 사용되었다. 개요는 NCAM 염색을 기반으로 만들어졌다. 뉴런의 NCAM 유비쿼터스 표현은 전체 성장 원추보다는 성장 원추의 제한된 부분을 식별하기 위해 소프트웨어 프로그램을 사용 가능. 이러한 성장 원뿔 윤곽이어서 관심 영역과 그 REGI 내 인테그린 염색 강도로 확인되었다관심에 소프트웨어에 의해 평가되었다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 강도를 용이하게 배양 감각 뉴런 내의 특정 영역에서 측정 될 수있다.

신뢰성있는 결과를 얻기 위해, 다음의 권고가 제공된다. 첫째, 커버 슬립이 잘 단계 1.4 ~ 1.6의 염산 배양 한 후 물로 세척되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면, 이러한 라미닌-1과 같은 분자는 coverslip에 잘 분산되지 않습니다. 둘째, 그렇지 않으면 세포의 덩어리가 형성되고이 신경 세포의 순도를 감소, DRGs 적절 트립신 소화 한 후 (단계 3.5)을 분해되어 있는지 확인합니다. 셋째, 뉴런의 순수한 인구를 얻기 전체 3 시간 동안 단계 3.9 DRG 세포를 배양하는 데 적합하다. 이 배양 공정이 단축되면, 짧은 배양 시간 후에 벗겨져 비 신경 세포의 수를 제한하는 단계 5.1 및 5.2을 린스 감소. 라미닌 1 disso인가하면서 넷째, 그 표면 장력이 유지되도록커버 슬립에 처 럼 뉴런. 표면 장력이 손실 된 경우, 용액을 건조 및 커버 슬립을 넘어 연장한다. 이 신경 세포를 죽이는 것이다. 다섯째, 최적의 셀 밀도는 각 조사자에 의해 결정되어야한다. 이전의 연구 / ㎖ 라미닌 (1) 및 20 μg / ml의 라미닌 한 각각 8,16, 1 μg 코팅 뉴런 120,00 / ㎖ 및 커버 슬립에 40,000 뉴런 / ㎖를 도금했다. 이 농도는 연구자가 무료 축삭 종말 (또 다른 신경 세포와 연결하지 않은 엔딩을) 공부를 할 수있는 것만으로는 부족합니다 낮았다. 여섯째, 면역 세포 화학 동안 부드럽게 세포를 씻어 것이 확실합니다. 분리 또는 커버 슬립에서 뉴런을 제거 할 수 있습니다 너무 빨리 솔루션을 적용.

이 절차의 제한 병아리 DRG 절제술의 다소 제한 시간 창을 포함한다. DRGs 쉽게 배아 일 (E) 7-10 병아리 배아로부터 수득 될 수있다. 그것은 이전 E7보다 DRGs를 얻을 수 있지만, 그것은 다소 도전이다. E11 후, 더 많은 연골 트랜스뼈 itions이는 절개가 더 어려워집니다. 따라서, 성인 신경 세포에 비해 배아 비교하는 것을 목표로 연구는이 여자 모델에 적합하지 않을 것이다, 그러나 이전의 연구는 DRGs 32의 나이 비교를 위해 쥐 모델을 사용하고 있습니다. 그것은 쥐 DRG 해부 덜 강력한, 더 비싼 병아리보다 기술적으로 더 많은 도전임을 주목해야한다. 고려해야 할 또 다른 점은 문화 속에서 시간이 지남에 변경 배양 된 배아 DRG 뉴런의 기능입니다. 예를 들어, 이러한 선택은 감각 뉴런 neurotrophins 2,30의 존재에 따라 48 시간 이내에 수용체의 다른 레벨을 표현한다.

DRG 뉴런의 두 서브 클래스는 미디어 2,12,30에 선택적 neurotrophins의 사용에 의해 강화 될 수있다. 예를 들어, 신경 성장 인자 (NGF) 및 뉴로 트로 핀 -3 (NT3)은 주로 피부와 고유 감각 뉴런, 각각 (33)의 생존을 지원한다. 이 실험에 사용 된 미디어는 NGF와 NT3 모두가그러나,이 쉽게 피부 또는 고유 감각 감각 뉴런에 대해 하나를 선택하도록 변경 될 수있다.

해리 신경 성장 원뿔 운동과 칼슘 이미징의 인터벌 상상 등 다양한 라이브 영상 기술 의무가 있습니다. 이 매체의 pH를 완충 용 CO 2를 필요로하지 않기 때문에 여기서 사용 된 매체는 생균 촬상 유리하다. 따라서, 생균의 데이터 획득은 가온 스테이지 현미경이 수행 가능하지만, 충분한 CO 2 수준의 유지를 필요로하지 않는다. 콘 성장 속도, 붕괴 8,16,30, 및 칼슘 수준 17은 여기에 기재된 기술에 의해 단리 라이브 차 병아리 감각 뉴런에서 연구되어왔다. 또한, RNAi를 성공적으로 배양 된 병아리 DRG 뉴런 34 단백질 수준을 감소시킬 수있다.

시험 관내 모델에서 잘 정의 얻은 통찰력 실험을 설계하는 필수적인 기초로서 사용될 수있다더 복잡한 모델에서 생체. 예를 들어, 다양한 접근은 아교 흉터의 시험 관내 모델에서 축삭 파생물을 자극하는 실버 랩 (35)에 사용되었다. 체외에서 테스트 시약의 다양한 만이 (염증 유도 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 소화) 축삭의 재생을 촉진 할 수있다. 흥미롭게도, 생체 내에서이 두 가지 치료의 조합은 척수 35로 극적인 및 기능 축삭의 재생을 자극. 이 경우, 시험 관내 실험은 축삭의 파생물을 증가 시약에 대한 빠른 속도로 화면에 중요한 도구를 제공했다. 성공적으로 시험 관내에서 축삭 성장을 촉진 시약은 또한 상기 세포 배양 실험의 값을 지원 생체 내에서 성공적인 입증.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는이 논문에 대한 통찰력있는 의견을 앨리슨 Philbrook, 벨린다 Barbagallo 마이클 프랜시스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 MLL에게 수여 R15 AREA 상 1R15NS070172-01A1에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile small culture dishes (35 mm) Corning 430165
Sterile large culture dishes (100 mm) Falcon 353003
Sterile large Petri dishes (100 mm) VWR 89000-302
Glass Petri dish (100 mm) VWR D108962
Fine forceps Fine Science Tools 11251-10
Standard forceps Fine Science Tools 1100-12
Coverslips (22 x 22 mm) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
Porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media
HCl VWR VW3204-1 use at 2 M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution
Laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl
15 ml Conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10x Gibco 14200 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
PBS 10x Gibco 14080 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM
Penicillin/streptomyocin Sigma P0781 use 5 ml in 500 ml of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer
NGF RnD systems 256-GF Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
L-Glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Normal goat serum Life technologies PCN500
Microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated β1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

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References

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신경 과학 문제 91 지느러미 루트 gangia DRG 닭고기, 조류 라미닌-1 배아 차
병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화
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Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. … More

Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

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