Summary
Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.
Abstract
Las neuronas son las células multifacéticos que llevan la información esencial para una variedad de funciones incluyendo la sensación, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. El estudio de las neuronas in vivo puede ser un reto debido a su complejidad, sus variados y dinámicos ambientes, y las limitaciones técnicas. Por estas razones, el estudio de las neuronas in vitro puede resultar beneficioso para desentrañar los complejos misterios de neuronas. La naturaleza bien definida de modelos de cultivo celular ofrece un control detallado de las condiciones ambientales y variables. Aquí se describe cómo aislar, se disocian, y las neuronas de cultivo primario de embriones de pollo. Esta técnica es rápida, de bajo costo, y genera robustamente creciente neuronas sensoriales. El procedimiento produce consistentemente culturas que son altamente enriquecido para las neuronas y tiene muy pocas células no neuronales (menos de 5%). Neuronas primarias no se adhieren bien al vidrio sin tratar o de cultivo de plástico de tejido, por lo tanto, los procedimientos detallados para crear dos Distinct, sustratos que contiene laminina-bien definido para chapado neuronal se describen. Neuronas cultivadas son altamente susceptibles de múltiples técnicas celulares y moleculares, incluyendo co-inmunoprecipitación, imaginación de células vivas, RNAi, y inmunocitoquímica. Procedimientos para la doble inmunocitoquímica en estas neuronas cultivadas se han optimizado y descrito aquí.
Introduction
Las neuronas son las células complejas que llevan la información esencial para una variedad de funciones, incluyendo la sensibilidad, la visión, el movimiento del motor, el aprendizaje y la memoria. Único de otros tipos de células, las neuronas extienden procesos como brazos, llamadas axones, para formar carreteras neuronales esenciales para la comunicación. Durante compartimentos de desarrollo especializada ubicados en las puntas de los axones en crecimiento, llamada conos de crecimiento, navegar a través de un concierto de señales extracelulares para liderar el axón hasta su destino apropiado. Los mecanismos moleculares que subyacen a la navegación intrincados cono de crecimiento no se entienden completamente. Para entender mejor estos mecanismos, los investigadores han utilizado modelos de cultivo celular para estudiar las neuronas en un entorno in vitro definido y simplificado en. Neuronas que estudian en la cultura 1 ha dado lugar a avances significativos en nuestra comprensión de la biología de las células neuronales incluyendo: la diferenciación neuronal 2, la dinámica del citoesqueleto, la endocitosis y el tráfico, dendritaregulación de 3,4, la regeneración axonal 5, y las condiciones clínicas tales como neuropatías 6. Además, las neuronas cultivadas son altamente susceptibles a una amplia gama de técnicas de investigación incluyendo la inmunocitoquímica, las células superficie de co-inmunoprecipitación, inmunotransferencia de tipo Western, transfección, RNAi y de imágenes en vivo tales como el análisis de la motilidad timelapse cono de crecimiento. Por lo tanto, el cultivo de neuronas primarias es un enfoque poderoso para dilucidar numerosos aspectos de la biología celular de las neuronas.
El modelo de cultivo celular proporciona a los investigadores con un control detallado de las condiciones ambientales y variables. Por ejemplo, los sustratos sobre los que se sembraron las neuronas (y crecen a) puede ser fácilmente manipulada. Aquí, se proporcionan instrucciones detalladas para la generación de dos sustratos distintos, uno con una baja concentración de laminina-1 y el otro con saturar las concentraciones de laminina-1. Sorprendentemente, diferentes concentraciones de la misma molécula pueden tener efectos dramáticosen el estado interno de las neuronas, así como su composición de la superficie celular. Por ejemplo, los niveles intracelulares de cAMP y superficiales niveles de integrinas son significativamente diferentes en las neuronas chapada en estos dos sustratos 7,8. Estudios adicionales han demostrado que otras moléculas, incluyendo fibronectina y proteoglicanos de sulfato de condroitina, el impacto de la expresión de moléculas de superficie celular y la motilidad neuronal 7-11. Además, las moléculas solubles, tales como las neurotrofinas y neurotropins también impacto composición de la membrana celular y la motilidad neuronal 12-16 y puede ser manipulado fácilmente y con precisión en un modelo de cultivo celular.
Aquí se describen los métodos para aislar y cultura disocian neuronas sensoriales de los embriones de pollo. Este procedimiento se ha utilizado para hacer avances significativos en la neurobiología, incluyendo axón resultado 5,7,8,10,11,16-21 y fue modificada a partir de un procedimiento diseñado para aislar células ganglionares 22. Hayvarias ventajas de este enfoque. En primer lugar, muchas características de chick ganglio de la raíz dorsal (DRG) de desarrollo están bien caracterizados incluyendo el marco de tiempo para el nacimiento, la extensión del axón, y los perfiles de expresión de la proteína 2,23-28, proporcionando así una base instructiva sobre la cual construir informativa en experimentos in vitro. En segundo lugar, los cultivos neuronales disociadas permiten que el investigador para estudiar más directamente las neuronas en comparación con enfoques alternativos utilizando explantes de DRG intactas (que contienen neuronas y células no neuronales) y / o cultivos mixtos que contienen tanto las neuronas disociadas y células no neuronales. En tercer lugar, el procedimiento descrito aquí es sencillo, barato y susceptible de estudiantes universitarios. Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para la investigación, así como para fines de enseñanza. Además, variaciones menores de este protocolo deben permitir la purificación rápida, de alto rendimiento de las neuronas de fuentes distintas de los GRD. Por ejemplo, este procedimiento puede ser modificado para proporcionar neuronalmente ENRculturas iched de otros tejidos como el cerebro anterior de embriones o de la médula espinal.
La inmunocitoquímica protocolos han sido optimizados para estos cultivos neuronales disociadas y se describen en detalle aquí. Se proporciona el procedimiento para el doble inmunocitoquímica contra la molécula de adhesión celular neural (NCAM) y las integrinas β1. Los datos generados a partir de estos métodos inmunocitoquímicos se han utilizado para examinar el patrón espacial y la intensidad de varias moléculas en las neuronas cultivadas 8,16.
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Protocol
1. Cubreobjetos Preparación: Acid Wash y Hornear
- Por lo menos 2 días antes de la disección (paso 2), comenzará los siguientes pasos para preparar cubreobjetos. Lleve a cabo el paso de lavado ácido para eliminar aceites y cubreobjetos limpiar a fondo.
- Cubreobjetos de carga en el soporte de la porcelana que posiciona verticalmente cubreobjetos y evita que se toquen entre sí. Sumerja titular y cubreobjetos en un recipiente de vidrio lleno histología con ácido clorhídrico 2 M (HCl). Alternativamente, si soporte de porcelana no está disponible, se extendió ~ 20 cubreobjetos horizontalmente para cubrir la parte inferior de 100 mm de vidrio placa de Petri y sumergir cubreobjetos en HCl 2 M.
- Colocar recipiente de vidrio (con cubreobjetos sumergidos en ácido) en la mesa basculante en campana de extracción y permitir balanceo suave durante al menos 5 horas a temperatura ambiente. Alternativamente, lavado con ácido cubreobjetos durante la noche bajo las mismas condiciones.
- Lave cubreobjetos con H 2 O destilada (DH 2 O) mediante la transferencia de titular de porcelana cargadocon cubreobjetos de HCl 2 M a un recipiente de vidrio limpio histología lleno de dH 2 O. Alternativamente, se decanta HCl 2 M de vidrio placa de Petri con cubreobjetos y rellene con dH 2 O.
- Lave por decantación dH 2 O de nuevo y volver a llenar recipiente de vidrio con dH 2 O. fresco Repita para un total de 3 lavados rápidos.
- Comience régimen de lavado ya devolviendo recipiente de vidrio (con cubreobjetos y dH 2 O) en el eje de balancín. Permitir agitación suave durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se decanta dH 2 O y añadir dH 2 O. fresco Repita para un total de al menos diez lavados. Alternativamente, continuar lavando durante la noche.
- Coloque cubreobjetos se lavaron en el horno precalentado a 350 ° C. Si utiliza soporte de porcelana, retire titular de dH 2 O recipiente de vidrio lleno-y luego colocar soporte con cubreobjetos directamente en el horno. Si se utiliza un plato de Petri de vidrio, decantar dH 2 O y colocar el plato de cristal con cubreobjetos en el furnace.
- Hornee cubreobjetos durante al menos cinco horas o durante la noche a 350 ° C.
- Después de la cocción, retire cubreobjetos de titular de porcelana con pinzas finas y colocar en estéril 100 mm de cristal placa de Petri. Deja cubreobjetos que no fueron colocados originalmente en soporte de la porcelana en la placa de Petri de vidrio.
2. polluelo disección y aislamiento de los GRD
- Quitar fértil, puesta en escena White Leghorn pollo huevo de la incubadora (que tuvo lugar en 37 a 38,5 ° C con agitación suave).
NOTA: Los estudios anteriores han utilizado el día embrionario 10.7 para el aislamiento de los GRD 2,8,11-13,16. - Coloque el huevo seleccionado en campana de flujo laminar. Llevar a cabo todos los procedimientos que figuran a continuación en condiciones asépticas en la campana de flujo laminar con soluciones e instrumentos estériles. Pre-caliente todas las soluciones en un baño a 37 ° C.
- Grieta de huevo y colocar contenido en un plástico 100 mm placa de Petri. El uso de fórceps estándar para la transferencia de embriones a otra 100 mm placa de Petri.
- Añadir F12HS10 caliente (F12 de Ham, HEPES 10 mM, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg ml estreptomicina, suero bovino fetal al 10% /) al plato con pipeta Pasteur para mantener el tejido húmedo. El uso de fórceps para posicionar embrión en su lado dorsal (Figura 1A).
- Coloque mm plástico 100 placa de Petri que contiene tejido embrionario en un microscopio de disección estereoscópica binocular en campana de flujo laminar. Utilice unas pinzas finas para hacer una incisión en la línea media vertical, desde la cola hasta el cuello apretando la dermis en desarrollo para exponer el corazón, los pulmones y otros órganos. Por otra parte, hacer una serie de pequeños desgarros para exponer los órganos internos.
- Utilizan suavemente 2 juegos de pinzas finas estériles para: a) comprender el cuello y b) captar la aorta u otro tejido inmediatamente superior a la del corazón y tirar hacia la cola,eviscerar el animal.
- Aplicar F12HS10 caliente con pipeta Pasteur al tejido. El uso de fórceps para quitar cualquier cardiovasculares, órganos respiratorios o digestivos restantes para exponer los nervios en desarrollo, la columna vertebral y los GRD (Figuras 1B-1D).
- Bajo el microscopio de disección, utilizar unas pinzas finas para eliminar adicionalmente órganos y recoger los GRD a lo largo de ambos lados de la columna vertebral lumbar, inferior a las costillas. Recoger GRD desplumando GRD intactas desde el embrión. Pinch y cortar las raíces que llegan desde el DRG hacia la médula espinal y el nervio de agarre en desarrollo que se extiende desde la DRG hacia la periferia o viceversa.
- Coloque GRD intactas en una placa de cultivo de 35 mm lleno de F12HS10 caliente. Eliminar cualquier exceso de tejido, tal como el dorsal o raíces ventrales que pueden haber adherido a los GRD, a partir de los GRD intactos en 35 mm plato pellizcando con unas pinzas finas.
- Para obtener GRD superiores a la región lumbar, retire la mitad ventral del tórax y cervila columna vertebral cal. Esto se realiza haciendo un corte en la columna vertebral en desarrollo perpendicular al eje de la médula espinal en la región cervical superior y otro corte en la región lumbar superior. Entonces, hacen cortes paralelos al eje de la médula espinal a lo largo de los lados derecho e izquierdo de la columna vertebral. Levante la mitad ventral de la columna vertebral del embrión, lo que expone a las revelaciones de la médula espinal (Figuras 1E-1F).
- Para permitir el acceso fácil a los GRD, retire la médula espinal torácica y cervical agarrando la médula espinal con unas pinzas finas. Utilice las pinzas para levantar la médula espinal de la columna vertebral. Como una aproximación, la médula espinal torácica está en el nivel de costillas y la zona cervical es superior a las costillas.
- Recoger torácica intacta y GRD cervicales con unas pinzas finas y colocarlas en F12HS10 cálido con otros GRD. Retire el exceso de tejido que puede adherirse a los GRD.
- Enjuague interior de una nueva pipeta Pasteur de vidrio con F12HS10 para ayudarprevenir GRD se pegue a las paredes de la pipeta. Use la pipeta enjuagados para transferir todos los GRD y F12HS10 desde pequeña placa de Petri a un tubo cónico de 15 ml estéril y proceder de inmediato al paso 3.
NOTA: Adicional embriones pueden ser diseccionados para aumentar el número de los GRD. GRD deben mantenerse en F12HS10 a 37 ° C hasta que esté listo para el paso 3.
3. disociación, Enriquecimiento y cultivo DRG neuronas - Parte 1
- Tubo cónico Place con GRD intactas en centrífuga y suavemente gire (200 xg) durante 2-3 min. Confirme que los GRD se han hundido hasta el fondo del tubo. Si no, girar de nuevo.
- Con una pipeta, retire suavemente F12HS10, dejando pellet DRG sin ser molestados. Añadir 2 ml de 1x calcio y magnesio libre (CMF) PBS, desalojando el sedimento de los GRD. Haga girar de nuevo y eliminar CMF PBS, dejando el sedimento DRG intacta. Repita este paso de lavado para un total de tres lavados para eliminar el suero bovino fetal en F12HS10, que pudiera interferir con la digestión de tripsina en el siguiente paso.
- Añadir 2 ml de tripsina se calentó a tubo de 15 ml que contiene 2 ml de CMF PBS y GRD. Coloque el tubo de 37 ° C baño de agua durante 10 a 15 min para digerir los GRD en células disociadas.
- Durante la incubación, hacer F12H + suplemento que contiene medios (F12 de Ham, 10 mM HEPES 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10 ng / ml NT-3, 10 ng / ml de NGF, 200 mM de L-glutamina y N2) y cálido en 37 ° C baño de agua. Típicamente, 10 ml de medio total es suficiente para 4-5 35 mm platos de neuronas sensoriales primarias. También comenzará descongelación laminina-1 para cubreobjetos de recubrimiento (paso 4).
- GRD suavemente triturar en solución de tripsina con pipeta p1000 e inspeccione visualmente la ausencia de GRD intactas. Continuar trituración hasta GRD intactas ya no son vistos por los ojos y / o permitir por más tiempo de incubación de tripsina en baño a 37 ° C hasta que se disocian GRD intactas. Para proteger a las neuronas de DRG de los daños, evitar las burbujas de aire durante la trituración y limitar la digestión de tripsina a <30 min.
- Centrifuge tubo que contiene GRD disociados y tripsina a 200 xg durante 3-5 minutos para formar pellets. Girar más si es necesario hasta que se forma de pellets.
- Aspirar cuidadosamente tripsina sin interrumpir pellet. Añadir 2 ml de F12HS10 para sedimentar. Tritura suavemente GRD con una punta de pipeta p1000.
- Transferir todo el contenido de 15 ml tubo cónico en 100 mm cultura plato. Enjuague el tubo con 8 ml F12HS10 y transferirlo a la placa de cultivo, 2 ml a la vez para un total de 10 ml. Esta etapa de aclarado ayuda a recoger las células que puedan haber quedado adherido a las paredes del tubo.
- Coloque 100 mm plato de cultivo (con 10 ml F12HS10 y disociada células DRG) en un humidificado 37 ° C incubadora durante 3 h.
NOTA: CO 2 no es necesario en la incubadora porque HEPES amortigua el pH del medio en ausencia de CO 2. Durante la incubación, las células gliales se unen a la superficie de cultivo de tejidos de plástico y neuronas tienden a adherirse libremente a la cama glial.
4. Coating Acid Washedy Cubreobjetos al horno con laminina-1
- Descongele alícuotas estériles de laminina-1 congelado en el hielo.
- En condiciones estériles, añadir 1 ml de PBS 1x estéril para 50 l alícuota de laminina-1.
- Utilice un espectrofotómetro para obtener un valor de absorbancia de la laminina-1 a 280 nm. Utilice este valor en la siguiente ecuación para determinar la concentración de laminina-1.
ABS = 280 (concentración mg / ml) * (coeficiente de extinción de proteína)
El coeficiente de extinción para laminina-1 es 0,86.
- En condiciones estériles, diluir laminina-1 con 1X PBS para obtener las concentraciones de 1 mg / ml y 20 mg / ml. Utilice estas dos concentraciones aplicadas de laminina-1 para lograr una diferencia de diez veces de la laminina-1 unido a la cubreobjetos (30 ng / cm 2 y 300 ng / cm 2, respectivamente) después de la incubación 7,8,10.
- En una campana de flujo laminar, utilice unas pinzas finas para colocar c un lavado con ácido y al hornooverslip en la parte inferior de una placa de cultivo de 35 mm. Repita según sea necesario para obtener el número de platos necesarios.
- Someter los cubreobjetos a la luz UV durante 20 a 30 minutos para asegurar aún más la esterilización. Mantenga la tapa plato fuera durante este paso.
- Añadir 400 l de laminina-1 preparado a cada cubreobjetos de vidrio. Usar puntas de pipeta para difundir laminina-1 para garantizar la plena cobertura de cubreobjetos. La tensión superficial permitirá laminina-1 permanezca en cubreobjetos y se propaga sobre el fondo de la placa de cultivo, que se requiere.
- Coloque la tapa sobre el plato y permitir que la laminina-1 incubar durante 2-3 horas a temperatura ambiente (3 h es óptimo).
- Después de la laminina-1 incubación, enjuague cubreobjetos utilizando una técnica aséptica con PBS estéril en campana de flujo laminar. Retire la solución en cubreobjetos y añadir 400 l de PBS. Espere 5-10 min. Repita para un total de 3 lavados.
- Deja PBS sobre cubreobjetos después del último aclarado. No romper la tensión superficial durante el enjuague y no permita que los cubreobjetos se sequen. Letapa ave en hasta el momento de placa de neuronas disociadas en el coverlip.
5. disociación, Enriquecimiento y cultivo DRG neuronas - Parte 2
- Después de la incubación, utilizar una pipeta estéril de 10 ml para enjuagar suavemente la parte inferior del plato 100 mm que contiene células DRG disociadas. Mantenga plato en ~ 45 ° ángulo, tire ~ 7 ml de F12HS10 con ayuda de la pipeta, luego expulsar suavemente 7 ml en aproximadamente un tercio de plato. Repita 5 veces, desplazando suavemente neuronas.
- Girar plato y repetir el aclarado procedimiento, por otros seis enjuagues, en otro tercio del plato. Repita el procedimiento de nuevo para permanecer tercio del plato. De esta manera, enjuagar suavemente toda la parte inferior del plato con F12HS10 para eliminar las neuronas.
- Usando misma pipeta, transferir neuronas F12HS10 contiene de 100 mm plato a 15 tubo cónico. Centrifugar durante 5-10 minutos a 200 g para sedimentar las células.
- Retire F12HS10, dejando pellet sin ser molestados. Resuspender pellet con 2 ml de F12H + suplementos calentado.
- Diluir las células como sea necesario con suplementos F12H + para obtener la concentración deseada de chapado (120.000 células / ml para cubreobjetos recubiertos con células / ml de laminina-1 y 40.000 1 g / ml para cubreobjetos recubiertos con 20 mg / ml de laminina-1 8,16).
- Retire PBS de cubreobjetos recubiertas con laminina y colocar inmediatamente 400 l de células en cubreobjetos. Transferir cuidadosamente a un plato humidificado, 37 ° C incubadora de cultivo celular. Dejar incubar durante al menos 1 hora y hasta 3 horas para permitir que las neuronas se adhieran a la laminina-1.
- En condiciones estériles, inundar suavemente 35 mm platos que contienen las neuronas con 1,6 ml de F12H + suplementos.
NOTA: En este momento, la tensión superficial en cubreobjetos puede romperse. Las neuronas se han adherido adecuadamente a la laminina-1 en cubreobjetos. - Células retorno a la incubadora y se incuba durante la noche. Realizar experimentos tales como la inmunocitoquímica al día siguiente.
6.mmunocytochemistry
- Antes de inmunocitoquímica, solución fijadora caliente (paraformaldehído al 4%, el 30% de sacarosa 2X PBS) en 37 ° C baño de agua.
NOTA: Antes de fijar las células, el tratamiento con diversos reactivos, tales como netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin y efrina 16,29-31. - Lentamente quite 1 ml de los 2 ml de F12H + suplementos de placa de cultivo. Añadir suavemente 1 ml de solución de fijación calentado. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 10-15 min.
- Retire con cuidado la solución de fijación y añadir 2 ml de PBS. Aplique la solución hacia el borde del plato, evitando posible desprendimiento de células fijadas debido a la aplicación de PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Repita de lavado PBS durante un total de 5 lavados. No permita que las células se sequen durante cualquier etapa de inmunocitoquímica.
- Retire PBS. Aplicar 1 ml de solución de bloqueo (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de suero normal de cabra). Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Alternativamente, para teñir moléculas de superficie, No utilice Triton-X en solución de bloqueo 8.
- Diluir anticuerpos primarios en solución de bloqueo por recomendación de fabricación. Utilice 1: 500 para anticuerpos contra NCAM y activado β1 integrinas 16. Eliminar la solución de bloqueo, añadir 1 ml de solución de anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Retire la solución de anticuerpo primario y añadir 2 ml de 1X PBS. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente. Repita para un total de 4 lavados con PBS. Los lavados se pueden extender, si es necesario.
- Diluir anticuerpo secundario 1: 1000 en solución de bloqueo. Retirar PBS, añadir 1 ml de solución de anticuerpo secundario e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
NOTA: Secundaria anticuerpos son sensibles a la luz. Mantener las soluciones y las células en la oscuridad tanto como sea posible a partir de este punto en adelante. - Retire la solución de anticuerpo secundario y enjuague 5x con 1x PBS, como se hizo anteriormente.
- Aplicar ~ 60-80 l de FluoromountT en un portaobjetos de microscopio. Con unas pinzas finas, levante suavemente el cubreobjetos de plato e inferior cubreobjetos en Fluoromount T en portaobjetos de microscopio. Evite las burbujas de aire.
- Tienda desliza horizontalmente a 4 ° C en la oscuridad. Después de 12-24 horas, Fluormount T polimeriza y cubreobjetos estará firmemente unido a portaobjetos de microscopio. Celdas de imagen después de esta etapa de polimerización se ha completado.
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Representative Results
El protocolo descrito aquí permite a los investigadores a la cultura una población enriquecida de neuronas sensoriales embrionarias disocian con muy pocas células (por ejemplo, <5%) no neuronales 7,8,10,16. Numerosos GRD pueden ser obtenidos de la lumbosacra, regiones torácica y cervical. Dependiendo de las necesidades del investigador, los GRD de estas regiones anatómicas distintas se pueden aislar fácilmente. Por ejemplo, la Figura 1 muestra imágenes del embrión de pollo a través de varias etapas de disección con los GRD lumbar resaltado en las figuras 1C y 1D y GRD torácicos en las Figuras 1E y 1F.
Las células cultivadas son fácilmente etiquetados por inmunocitoquímica. Aquí, las células cultivadas se inmunotiñeron con anticuerpos contra la integrina β1 y NCAM (Figura 2). Sorprendentemente, hemos sido capaces de visualizar la tinción fluorescente de hasta un año después de que estosProcedimientos de la CPI, si los portaobjetos se mantienen horizontalmente a 4 ° C y en la oscuridad. Sin embargo, la longevidad de las manchas de la CPI necesita ser determinado por el usuario y por anticuerpo.
Dependiendo de la densidad de las neuronas, los conos de crecimiento en las puntas de las neuritas que se extienden también pueden ser visualizadas (Figuras 2D-2F). Las neuronas en placas a 40.000 y 120.000 células / ml en cubreobjetos recubiertos de 20 mg / ml y 1 mg / ml de laminina-1 respectivamente, tienen numerosas neuritas gratuitas hasta después de chapado de 26 horas. Estos cultivos se pueden utilizar para analizar específicamente los conos de crecimiento además de analizar toda la neurona. Anteriormente, este procedimiento se ha utilizado para evaluar la velocidad del cono de crecimiento y comportamientos, como el crecimiento del cono colapso 8,9,11,13,16. Densidades de chapado más bajos en estos cubreobjetos resultados en las neuronas muertas que no se adhieren a los sustratos. La densidad apropiada exacta necesaria para cada experimento debe ser optimizado por el investigador.
Figura 1. Etapas de la disección de embriones de pollo para obtener los GRD. A) El polluelo embrión miente en su lado dorsal. El corazón (H), alas (W) y las piernas (L) están etiquetados. La parte superior de la imagen es hacia la cabeza, o superiores (S). La parte inferior de la imagen es hacia la cola, o inferior (I). R = lado derecho del animal, L = lado izquierdo del animal. Todas las imágenes posteriores están en la misma orientación. B) Los órganos internos se han eliminado del embrión en A. La columna vertebral, se ven las costillas y GRD. Para simplificar, una costilla se etiqueta, tres GRD representativos se identifican mediante círculos negros y la torácica y la columna vertebral lumbar está etiquetado. C) Imagen de embrión de pollo Igual que B con un cuadro gris que identifica la región mostrada en higsu ampliación en D. D) Un mayor aumento de la región lumbar de columna vertebral (VC). Tres de los once GRD en esta vista se identifican por círculos de trazos. GRD son redondos y encapsulado. Estas características hacen que sea fácil de obtener GRD intactas con fórceps. E) Un embrión de pollo después de la extracción de los órganos internos y la mitad ventral de la columna vertebral torácica. Cuadro gris indica la región se muestra a mayor aumento en F. F) la médula espinal (SC) se ve en la región en la que se ha eliminado la columna vertebral. Hacia la parte inferior de la imagen, la columna vertebral lumbar (VC) está todavía intacto. 3 de 10 GRD se identifican mediante círculos de trazos. GRD se encuentran entre cada conjunto de costillas.
Figura 2. neuronas sensoriales primarias cultivadas immunolabeled para NCAM y β1 integrinas. Polluelo neuronas cultivadas DRG en altas concentraciones de laminina-1 son immunopositive para NCAM (A) y la integrina β1 (B). C) imagen fusionada de dos manchas revela mayoría de las células son positivas tanto para NCAM y la integrina β1. Estas neuronas sensoriales aviares son immunopositive para ambos de estos marcadores. Sin embargo, no es una célula, marcada por un asterisco que es NCAM negativo y positivo β1 integrina, de acuerdo con una célula no neuronal. DF) Mayor aumento de una neurona sensorial cultivaron muestra neuritas que se extienden desde el cuerpo celular. D) Insertado en blanco caja muestra un aumento mayor de cono de crecimiento en la punta de una de las neuritas.
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Discussion
Aquí presentamos protocolos detallados para el aislamiento y cultivo disociados neuronas sensoriales de un embrión de pollo. Este procedimiento genera una población enriquecida de neuronas robusto crecimiento in vitro 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares y moleculares se pueden aplicar a estas neuronas cultivadas, incluyendo inmunocitoquímica, que se describe aquí. Este protocolo se utilizó recientemente para evaluar cuantitativamente la intensidad de las integrinas activadas inmunomarcadas en los conos de crecimiento sensoriales 8,16. En estos estudios previos, se utilizó un programa de software para crear con precisión el contorno de la distal 20 micras final del cono de crecimiento. El contorno se realizó basándose en la tinción de NCAM. La expresión ubicua de NCAM en las neuronas activar el programa de software para identificar todo el cono de crecimiento en lugar de una parte limitada del cono de crecimiento. A continuación, este contorno del cono de crecimiento fue identificado como una región de interés y de la intensidad de la tinción integrina dentro de ese REGIen de interés se evaluó por el software. De esta manera, la intensidad de una proteína de interés se puede medir fácilmente en una región específica dentro de las neuronas sensoriales cultivadas.
Con el fin de obtener resultados fiables, se proporcionan las siguientes recomendaciones. En primer lugar, asegúrese de que cubres están bien lavadas con agua después de la incubación HCl en pasos 01.04 a 01.06. De lo contrario, moléculas tales como laminina-1 no se disperse bien en el cubreobjetos. En segundo lugar, confirman que los GRD se disocian adecuadamente (paso 3.5) tras la digestión con tripsina, de lo contrario grupos de células se formarán y esto disminuirá la pureza neuronal. Tercero, es óptimo para incubar células DRG en el paso 3.9 para un 3 hr completo para obtener una población pura de las neuronas. Si se acorta este paso de incubación, a continuación, disminuir el enjuague pasos 5.1 y 5.2 para limitar el número de células no neuronales que son desalojadas después de un tiempo de incubación más corto. En cuarto lugar, asegurarse de que la tensión superficial se mantiene mientras se aplica laminina-1 y Dissoneuronas ciadas a los cubreobjetos. Si se pierde la tensión superficial, la solución se extenderá más allá del cubreobjetos y seco. Esto matará a las neuronas. En quinto lugar, la densidad celular óptima debe ser determinada por cada investigador. Estudios anteriores han chapado 120,00 neuronas / ml y 40.000 neuronas / ml en cubreobjetos recubiertos con 1 mg / ml de laminina-1 y 20 g laminina-1, respectivamente 8,16 / ml. Esta concentración fue lo suficientemente baja como para permitir a los investigadores a estudiar las terminaciones de los axones (terminaciones libres que aún no había conectado con otra neurona). En sexto lugar, durante la inmunocitoquímica, asegúrese de enjuagar suavemente las células. La eliminación o la aplicación de soluciones demasiado rápido puede desalojar a las neuronas de la cubreobjetos.
Las limitaciones de este procedimiento incluyen la ventana de tiempo limitado un poco de pollo disección DRG. GRD se puede obtener fácilmente a partir del día embrionario (E) 7-10 embriones de pollo. Si bien es posible obtener los GRD antes de E7, es algo difícil. Después de E11, más cartílago transexposi- a los huesos y esto hace que la disección más difícil. Por lo tanto, los estudios que tienen como objetivo comparar embrionario frente a los adultos las neuronas no sería ideal para este modelo de pollo, sin embargo, los estudios anteriores han utilizado el modelo de rata para la comparación edad en GRD 32. Cabe señalar que la disección DRG de rata es más caro, menos robusto y técnicamente más difícil que polluelo. Otro punto a considerar es la capacidad de las neuronas DRG embrionarias cultivadas a cambiar con el tiempo en la cultura. Por ejemplo, estas neuronas sensoriales expresan diferentes niveles de receptores dentro de 48 horas dependiendo de la presencia de 2,30 seleccione neurotrofinas.
Dos subclases de DRG neuronas pueden ser enriquecidas por el uso de las neurotrofinas selectivos en los medios 2,12,30. Por ejemplo, factor de crecimiento nervioso (NGF) y la neurotrofina-3 (NT-3) apoyan principalmente la supervivencia de neuronas propioceptivas cutáneas y 33, respectivamente. Los medios utilizados en este experimento tiene tanto NGF y NT3Sin embargo, esto puede ser fácilmente modificado para seleccionar, ya sea para las neuronas sensoriales cutáneas o propioceptivos.
Neuronas disociadas son susceptibles de numerosas técnicas de imagen en vivo, incluyendo timelapse imaginación de la motilidad cono de crecimiento y proyección de imagen de calcio. Los medios de comunicación se utiliza aquí es ventajoso para imágenes de células vivas, ya que no requiere de CO 2 para el buffer de pH de los medios de comunicación. Por lo tanto, la adquisición de datos a partir de células vivas se puede realizar en un microscopio con un escenario calentado, pero no requiere mantenimiento de adecuados niveles de CO 2. Los niveles de crecimiento velocidad de cono, de colapso 8,16,30, 17 y de calcio se han estudiado en las neuronas sensoriales primarios de pollo vivos aislados mediante la técnica descrita aquí. Además, el ARNi puede reducir con éxito los niveles de proteína en pollo cultivadas DRG neuronas 34.
Los conocimientos obtenidos a partir bien definido en modelos in vitro se pueden utilizar como una base fundamental para diseñar experimentosen un modelo más complejo in vivo. Por ejemplo, se han utilizado diversos enfoques en el laboratorio de plata 35 para estimular axón en un modelo in vitro de la cicatriz glial. De la variedad de reactivos probados in vitro, sólo dos (inducción de la inflamación y la digestión de los proteoglicanos de sulfato de condroitina) podrían promover la regeneración axonal. Curiosamente, una combinación de estos dos tratamientos in vivo estimula la regeneración de axones dramática y funcional en la médula espinal 35. En este caso, los experimentos in vitro proporcionan una importante herramienta para cribar rápidamente para los reactivos que aumentaron axón. Los reactivos que promovieron con éxito el crecimiento de axones in vitro también tuvieron éxito en vivo, lo que apoya aún más el valor de los experimentos de cultivo celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo y Michael Francis para perspicaces comentarios sobre este documento. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por un premio R15 ÁREA 1R15NS070172-01A1 adjudicado a MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
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