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Neuroscience

分离和游离感觉神经元的文化活动从鸡胚

Published: September 24, 2014 doi: 10.3791/51991

Summary

细胞培养模型提供了环境条件的详细控制,从而提供一个强大的平台,以阐明神经元细胞生物学的许多方面。我们描述了一种快速,廉价和可靠的方法来从鸡胚分离,解离和培养的感觉神经元。还提供基质制剂和免疫细胞化学的细节。

Abstract

神经元是多层面的细胞中携带信息的各种功能,包括感觉,运动运动,学习和记忆至关重要。 体内研究神经元可以是具有挑战性的,因为它们的复杂性,其变化的动态环境,和技术的限制。由于这些原因, 在体外研究神经元可以证明是有益的解开神经元的复杂的奥秘。的细胞培养模型中良好定义的性质提供了对环境条件和变量的具体控制。在这里,我们介绍了如何分离,分解,并从鸡胚培养初级神经元。这种技术是快速,廉价,并且产生强劲增长的感觉神经元。该过程持续产生培养物被高度富集的神经元,并具有很少的非神经元细胞(小于5%)。原代神经元没有很好地附着在未经处理的玻璃或组织培养塑料,因此详细的程序来创建两个迪斯丁CT,定义良好的含有层粘连蛋白基质为神经镀进行说明。培养的神经元是高度适合于多种细胞和分子生物学技术,包括免疫共沉淀,活细胞的想象,RNA干扰,和免疫细胞化学实验。关于这些培养的​​神经元的双免疫程序进行了优化,并在此描述。

Introduction

神经元是复杂的细胞传递信息的各种功能,包括感觉,视觉,运动运动,学习,记忆至关重要。从其他细胞类型的独特,神经延长臂状突起,称为轴突,以形成必要的神经公路进行通信。在位于轴突生长的秘诀开发专门车厢,称为生长锥,浏览外线索的音乐会导致轴突到相应的目的地。背后生长锥的导航复杂的分子机制尚不完全清楚。为了更好地理解这些机制,研究人员已经用细胞培养模型,研究了定义,并简化在体外环境中的神经元。在文化学习1神经元,导致了我们的神经元细胞生物学的理解,包括显著进展:神经细胞的分化2,细胞骨架动力学,细胞内吞作用和贩运,枝晶规3,4,轴突再生5,和临床病症,如神经病6。此外,培养的神经元是高度适合于范围广泛的研究的技术,包括免疫细胞化学,细胞表面的共免疫沉淀,Western印迹,转染,RNA干扰,和实时成像等的生长锥运动缩时分析。因此,培养初级神经元是一种有效的方法来阐明神经元的细胞生物学的许多方面。

细胞培养模型提供与调查员对环境条件和变量详细的控制。例如,在其上的神经元被镀(并且在生长)的基质可以容易地操纵。这里,我们提供了用于产生两个不同的基质,一种具有低的层粘连蛋白-1的浓度和其它具有饱和的层粘连蛋白-1的浓度的详细说明。出人意料的是,不同浓度的相同的分子可具有显着影响对神经元的内部状态,以及它们的细胞表面成分。例如,整合的cAMP和表面水平的细胞内水平是在神经细胞铺于两个基质7,8显著不同。另外的研究表明,其它分子,包括纤连蛋白和硫酸软骨素蛋白多糖,影响细胞表面分子的表达和神经元运动7-11。此外,可溶性分子如神经营养因子和neurotropins也影响细胞膜的组成和神经运动12-16并且可以在细胞培养模型中很容易地和准确地操作。

在这里,我们描述的方法来分离和培养解离来自鸡胚的感觉神经元。这个过程已经被用来制造在神经生物学显著突破,包括轴突生长5,7,8,10,11,16-21和从设计到分离神经节细胞22中的程序进行了修改。有几个优点这种方法。首先,鸡背根神经节(DRG)开发的许多功能都得到很好的特点,包括出生,轴突延长的时间框架和蛋白质表达谱2,23-28,从而提供了赖以建立翔实的体外实验的指导性依据。第二,解离的神经元培养物使研究者能够更直接地学习的神经元相比,使用含有两个游离的神经元和非神经元细胞完好的DRG外植体(其包含神经元和非神经元细胞)和/或混合培养物的替代方法。第三,这里描述的方法很简单,价格低廉,适合于大学生。因此,这种技术可以用于研究以及用于教学目的。此外,该协议的微小变化应该让神经元并非来自病种付费等速度快,产量高的净化。例如,这个过程可以被修改以提供neuronally ENR从其它组织iched培养如胚胎前脑或脊髓。

免疫细胞化学的协议已经被优化用于这些分离的神经元培养物和这里进行了详细的说明。提供了一种用于对神经细胞粘附分子(NCAM)和β1整合素双重免疫细胞的步骤。从这些免疫细胞化学方法产生的数据已被用于检查空间构图和几个分子的强度在培养的神经元8,16。

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Protocol

1,盖玻片准备:酸洗和烘烤

  1. 至少提前2天清扫(步骤2),开始下面的步骤准备盖玻片。进行酸洗步骤以去除油脂,彻底清洁的盖玻片。
  2. 负载盖玻片瓷支架的垂直位置盖玻片,防止它们相互接触。淹没支架和盖玻片放入盛有2M的盐酸(HCl)的玻璃容器中组织学。或者,如果瓷支架是无法使用,散布〜20盖玻片水平地覆盖100毫米的玻璃陪替氏培养皿的底部,并浸没在2 M盐酸盖玻片。
  3. 置于玻璃容器(具有浸没在酸盖玻片)上摇杆表中通风柜并允许温和室温下摇动至少5小时。可替代地,酸洗涤盖玻片过夜在相同条件下。
  4. 用蒸馏水H 2 O的(DH 2 O)通过转让持有的瓷器装洗盖玻片用盖玻片2 M盐酸以充满DH 2 O干净的玻璃容器中的组织学另外,倒出2 M盐酸的玻璃培养皿盖玻片,并加注DH 2 O。
  5. 再次滗DH 2 O和加气站的玻璃容器用新鲜的DH 2 O洗重复共3快洗。
  6. 通过返回的玻璃容器(含盖玻片和DH 2 O)摇臂上开始长的洗涤方案。允许温和搅拌,在室温下10-30分钟。然后,倒出DH 2 O和补充新鲜DH 2 O重复共计至少10次洗涤。另外,隔夜继续冲洗。
  7. 放置洗涤盖玻片入炉预热到350℃。如果使用瓷支架,从DH移除保持器2 O-填充的玻璃容器,然后将用盖玻片夹持器直接入炉。如果使用的是玻璃培养皿,倒出DH 2 O和放置盖玻片用玻璃盘放入炉内ê。
  8. 烘烤盖玻片至少五小时或过夜,在350℃。
  9. 烘烤完成后,从细钳子瓷支架取出盖玻片,并放入无菌100毫米玻璃培养皿。离开盖玻片最初未放置在瓷座玻璃培养皿。

2,鸡解剖和按病种付费的隔离

  1. 删除肥沃,上演了从孵化器中(在37-38.5℃保持与温和的摇摆)白来航鸡的蛋。
    注:以前的研究中使用7-10天胚胎的按病种付费2,8,11-13,16的隔离。
  2. 发生在层流罩选择鸡蛋。进行在层流罩用的无菌溶液和仪器在无菌条件下在下面列出的所有步骤。在37℃水浴中预温的所有解决方案。
  3. 裂纹蛋和地点的内容成塑料百毫米培养皿。使用标准的镊子胚胎移植到另外100毫米的培养皿。
  4. 加入温暖F12HS10(火腿的F12,10毫米的HEPES,100单位/ ml青霉素,0.1毫克/毫升链霉素,10%胎牛血清)抛出与巴斯德吸管,以保持组织湿润。使用镊子在其背侧( 图1A)定位胚胎。
  5. 将含有胚胎组织上的层流罩双目立体视觉解剖显微镜百毫米塑料培养皿。用细镊子捏住发展到真皮层暴露心脏,肺等器官,使垂直正中切口,从尾巴到脖子。另外,进行一系列的小眼泪,露出内脏。
  6. 轻轻地用2台无菌细镊子:1)掌握颈部和b)掌握主动脉或其他组织立即优于心脏和拉向尾部,取出内脏的动物。
  7. 用巴斯德吸管来组织应用温水F12HS10。使用镊子,以去除任何剩余的心血管,呼吸或消化器官露出显影肋骨,脊柱和背根节( 图1B-1D)。
  8. 在解剖显微镜下,用细镊子沿腰脊柱,下到两侧肋骨,以进一步去除内脏和收集病种付费。通过从胚胎采摘完好病种付费病种付费领取。捏紧并切断了从到达对脊髓背根神经节和把握发展的神经到达从向周边反之亦然背根神经节的根部。
  9. 将完好的DRG到35毫米的培养皿中充满了温暖的F12HS10。通过用细镊子夹持除去任​​何多余的组织,如背侧或腹侧根部可能已附着的DRG,从完整的DRG在35mm培养皿。
  10. 为了获得病种付费优于腰部,取出胸宫颈癌放疗的腹侧半CAL脊柱。这是通过在显影脊柱的切口垂直于脊髓轴在上颈部区域和另一个切口在上部腰区进行。然后,使切口平行于沿右和脊柱的左右两侧的脊髓轴。从胚胎中,它暴露了暴露了脊髓( 图1E,1F)提起脊柱的腹侧一半。
  11. 为了能够轻松地访问病种付费,抓住脊髓用细镊子取出胸脊髓型颈椎病。使用镊子解除脊髓出了脊柱。作为近似,胸髓是在肋的水平和颈部区域优于肋。
  12. 收集完整的胸椎和颈椎病种付费用细镊子,并将其放置在温暖的F12HS10与其他病种付费。除去可能附着病种付费多余的组织。
  13. 冲洗了新的玻璃巴斯德吸管的内饰与F12HS10帮助防止病种付费粘吸管的墙壁。用移液管冲洗从小培养皿转移所有病种付费和F12HS10到无菌的15 mL锥形管,并立即进行第3步。
    注:其他胚胎可以解剖,以增加病种付费的数量。的DRG应保持在F12HS10在37℃,直到准备步骤3。

3,解离,充实和培养DRG神经元 - 第1部分

  1. 地点锥形管与完整的DRG进入离心机,轻轻旋转(200 XG)2-3分钟。确认病种付费下沉到试管底部。如果没有,再旋转。
  2. 用吸管,轻轻取出F12HS10,留下的DRG颗粒原状。加入2毫升1X钙,镁免费(CMF)的PBS,撞出病种付费的沉淀。再次旋转和删除CMF的PBS中,同时使DRG颗粒完好无损。重复,共洗涤三次这种洗涤步骤以去除在F12HS10胎牛血清,这会干扰胰蛋白酶消化在下一步骤。
  3. 加入2mL温暖的胰蛋白酶15毫升管含2ml CMF的PBS中,按病种付费。在37℃水浴代替管10-15分钟来消化的DRG成解离细胞。
  4. 在培养期间,使含有F12H +补充媒体(火腿的F12,10毫米的HEPES 100单位/ ml青霉素,0.1毫克/毫升链霉素,10毫微克/毫升NT3,10毫微克/毫升的NGF,200mM的L-谷氨酰胺和N 2)和温暖在37℃水浴。通常情况下,将10毫升的总媒体是足够的初级感觉神经元的4-5 35mm培养皿。也开始解冻层粘连蛋白-1涂布的盖玻片(步骤4)。
  5. 与P1000吸管胰蛋白酶溶液轻轻磨碎病种付费和目视检查的完好无病种付费的。继续研磨直至完整的DRG通过眼睛不再可见和/或允许在37℃水浴中再胰蛋白酶孵育,直到完整的DRG解离。为了保护DRG神经元免受损伤,避免研磨过程中产生气泡,并限制胰酶消化<30分钟。
  6. Centrifugê管含有游离病种付费,并在200 XG胰蛋白酶3-5分钟,形成的颗粒。如果需要的话,直到沉淀形成旋转更长的时间。
  7. 小心吸胰蛋白酶,而不破坏球。加入2mL F12HS10的沉淀。轻轻磨碎病种付费使用P1000的枪头。
  8. 转移15 mL锥形管的所有内容复制到100毫米培养皿。冲洗用8ml F12HS10的管,并将其转移到培养皿中,加入2ml在同一时间,总共10毫升。这个漂洗步骤有助于收集细胞,可能仍然附着到所述管的壁上。
  9. 放置百毫米培养皿(10毫升F12HS10及解离的DRG细胞)成加湿37℃培养箱中培养3小时。
    注:CO 2,不需要在孵化因为HEPES缓冲介质的pH在不存在的CO 2。在培养过程中,神经胶质细胞结合组织培养塑料和神经元的表面趋于松散坚持胶质床。

4,涂层酸洗和烤盖玻片与层粘连蛋白-1

  1. 解冻在冰上冷冻层粘连蛋白-1的无菌分装。
  2. 在无菌条件下,加入1毫升无菌1×PBS中的层粘连蛋白-1的50μl的等份。
  3. 用分光光度计在280nm处得到的层粘连蛋白-1的吸光度值。使用下面的公式该值来确定的层粘连蛋白-1的浓度。

ABS 280 =(浓度毫克/毫升)*(蛋白的吸光系数)
消光系数为层粘连蛋白-1是0.86。

  1. 在无菌条件下,稀释的层粘连蛋白-1用1X PBS中,得到的浓度为1mg / ml和20毫克/毫升。使用这两种施加浓度的层粘连蛋白-1的实现层粘连蛋白-1孵育7,8,10结合至盖玻片(30毫微克/厘米2和300毫微克/分别厘米2)的10倍的差异。
  2. 在层流罩,用细镊子将一个酸洗和烤çoverslip入之一35毫米培养皿的底部。根据需要重复,以获得所需的菜的数量。
  3. 若使盖玻片于UV光20-30分钟,以进一步确保灭菌。在此步骤期间保持盘盖关闭。
  4. 添加400μl的制备层粘连蛋白-1的每个玻璃盖玻片。用枪头扩散层粘连蛋白1,确保盖玻片的全覆盖。表面张力将使层粘连蛋白1留在盖玻片和未​​涂布在培养皿上,这是需要的底部。
  5. 放置盖子上盘和允许的层粘连蛋白-1温育2-3小时,在室温下(3小时是最佳的)。
  6. 后层粘连蛋白-1孵育,冲洗用无菌技术与无菌PBS在层流罩盖玻片。删除解决方案在盖玻片,加入400微升PBS。等待5-10分钟。重复共3冲洗。
  7. 最后一次冲洗后留下的PBS在盖玻片。冲洗时不要破坏表面张力,不允许盖玻片干。乐直到准备盖大道板块分离的神经元上coverlip。

5,解离,充实和培养DRG神经元 - 第2部分

  1. 孵育后,用10毫升无菌吸管轻轻漂洗含分离的DRG细胞的100mm培养皿的底部。操盘时〜45°角,拉〜7毫升F12HS10用吸管援助,然后轻轻驱逐7毫升到大约菜的三分之一。重复5倍,轻轻撞出神经元。
  2. 旋转盘和重复漂洗程序,对于另外六个冲洗,上的菜的另一个三分之一。再次重复步骤剩余菜的三分之一。以这种方式,轻轻冲洗培养皿的整个底部与F12HS10除去神经元。
  3. 使用相同的吸管,由100毫米的菜传输含F12HS10神经元至15锥形管。离心5-10分钟,以200g以沉淀细胞。
  4. 删除F12HS10,留下沉淀不受打扰。悬浮颗粒用2毫升温F12H +补充剂。
  5. 稀必要与F12H +补充细胞以获得期望的镀浓度(120,000个细胞/ ml的盖玻片涂覆有1μg/ ml的层粘连蛋白-1和40,000个细胞/毫升的盖玻片上涂覆有20微克/毫升的层粘连蛋白-1 8,16)。
  6. 从层粘连蛋白包被的盖玻片除去PBS中并立即将400μl的细胞上的盖玻片。精心调菜的潮湿,37℃细胞培养孵化器。允许温育至少1小时和最多3个小时,使神经元的粘附层粘连蛋白-1。
  7. 在无菌条件下,轻轻地涌入35mm培养皿含有神经元与1.6 F12H +补充毫升。
    请注意:这时,表面张力对盖玻片可破。神经元有足够的坚持层粘连蛋白1的盖玻片。
  8. 回到细胞培养箱中孵育过夜。进行实验,如免疫第二天。

6。我mmunocytochemistry

  1. 之前,免疫细胞化学,在37℃水浴中温暖固定液(4%多聚甲醛,30%蔗糖2X PBS)中。
    注:在固定的细胞中,用不同的试剂,如的netrin-1的Mn 2 +,音猬蛋白,脑信号蛋白,肝配蛋白和16,29-31。
  2. 慢慢松开1毫升的2毫升F12H +补充从培养皿中。轻轻地加入1毫升温固定液。允许在室温下孵育10-15分钟。
  3. 小心地取出固定液,加2毫升的PBS。应用解决方案,对菜的边缘,避免因应用程序的PBS固定细胞可能撞出。在室温下孵育5分钟。
  4. 重复的PBS洗涤,共洗涤5次。不要让细胞在免疫细胞中的任何一步干燥。
  5. 删除的PBS。申请1毫升封闭溶液(0.1%的Triton-X,1X PBS,5%正常山羊血清)。保温1小时,在室温下进行。或者,染色表面分子不要在封闭液8使用的Triton-X。
  6. 稀释一抗堵到每个制造商的建议解决方案。用1:500的抗NCAM并激活β1整合素16。除去封闭液,加入​​1毫升的第一抗体溶液孵育1小时,在室温或过夜,在4℃。
  7. 删除主要抗体溶液,加入2毫升的1X的PBS中。孵育在室温下5-10分钟。重复,共4 PBS洗涤。洗涤可以延长,如果需要的话。
  8. 在封闭溶液1,000:稀释的二级抗体1。除去PBS,加入1 ml的二级抗体溶液孵育1小时,在室温下进行。
    注:二级抗体是光敏感。保持溶液和细胞在黑暗中尽可能多地从该点向前。
  9. 去除二级抗体溶液和冲洗5×用1×PBS,如以前那样。
  10. 应用〜60-80微升Fluoromount的ğ到显微镜载玻片。用细镊子,轻轻抬起盖玻片出来的菜,下盖玻片成Fluoromount的G到显微镜载玻片。避免气泡产生。
  11. 店内水平滑动,在4℃下在黑暗中。经过12-24小时,Fluormount G将先聚合和盖玻片将被牢固地附着在载玻片上。后该聚合步骤的图像的细胞是完整的。

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Representative Results

这里所描述的协议使研究者培养解离胚胎感觉神经元具有很少( 例如 ,<5%)非神经元细胞7,8,10,16的富集群体。许多病种付费可从腰骶部,胸椎和颈椎区域获取。根据研究者的需要,从这些不同的解剖区域的DRG可以容易地分离。例如, 图1示出了鸡胚通过夹层与腰椎的DRG不同阶段的图像在图1C图1D图1E1F胸椎的DRG突出。

培养的细胞很容易被免疫细胞化学标记。这里,培养的细胞进行免疫染色的抗体对β1整合素和NCAM( 图2)。出人意料的是,我们已经能够看到荧光染色长达一年后这些IC卡的程序,如果在载片水平地保持在4℃,并在黑暗中。然而,需要国际刑事法院污渍的寿命由用户和每个抗体来确定。

根据神经元的密度,在延伸的突起的尖端生长锥也可以可视化( 图2D-2F)。神经镀在40000和120000个细胞/ ml的盖玻片上涂覆有20微克/毫升和1微克/毫升的层粘连蛋白-1分别的,有大量游离突起达26小时后镀。这些培养物可以用于具体分析生长锥中除了分析整个神经元。以前,这个程序已被用于评价生长锥速度和行为,如生长锥塌陷8,9,11,13,16。较低的接种密度对这些盖玻片导致死亡的神经元未附着在附着基。需要为每个实验的准确适当的浓度需要每个研究者进行优化。

图1阶段鸡胚解剖,获得病种付费。一)鸡胚趴在其背侧。在心脏(H),翼(W)和腿(L)被标记。在图像的顶部是朝向头部或优于(S)。在图像的底部是朝尾,或劣(Ⅰ)。 R =右侧的动物,L =左手动物的一面。所有后续的图像是相同的方向。 的内脏已经从胚胎取出在A的脊柱,肋骨和背根节被看见。为简单起见,一根肋骨被标记,三个具有代表性的按病种付费用黑圈标识和胸腰椎脊柱标记。 三)同一鸡胚图像为B用灰色框识别本地区HIG显示她在放大高倍腰椎脊柱(VC)的区域。三个11病种付费在这种观点的标识由虚线圆圈。按病种付费是圆的封装。这些功能可以很容易地获得完整的病种付费用钳子。 五)去除内脏和胸脊柱的腹侧半后,鸡胚。灰色框表示在楼F大的放大倍率),脊髓(SC)的区域被认为是其中的脊柱已经被移除显示区域。朝图像的底部,腰部脊柱(VC)仍然完好无损。 3 10,按病种付费是确定的虚线圆圈。的DRG分别设置肋之间找到。

图2
图2:培养初级感觉神经元免疫标记数控AM和β1整合,高浓度层粘连蛋白1的培养的鸡背根神经节神经元免疫阳性的NCAM(A)和β1整合素(B)C)的两个污点合并后的图像显示大多数细胞是积极为NCAM和β1整合。这些禽流感的神经元免疫阳性的这两个指标。然而,有一个小区,标有星号的是NCAM阴性和β1整合素阳性,用非神经元细胞。DF)的高倍培养的感觉神经元的一致的示出了从细胞体延伸的突起。D)的插图在白色框显示的生长锥在轴突的尖端更高的放大倍率。

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Discussion

在这里,我们提出了详细的协议进行分离培养分离从鸡胚感觉神经元。这个过程产生强劲增长的神经元的体外 7,8,10,16富集群体。众多的细胞和分子生物学技术可以应用到这些培养的​​神经元中,包括免疫细胞化学,在此所说明。该协议是最近使用的定量评估免疫标记激活整合素在感官生长锥8,16力度。在这些先前的研究中,软件程序被用于准确地创建了生长锥的顶端20微米的端部的轮廓。基于NCAM染色的大纲进行。 NCAM的神经元中的表达无处不在启用该软件程序,以确定在整个生长锥,而不是生长锥的有限部分。此生长锥的轮廓,然后确定为感兴趣的区域,并且REGI内的整联染色强度上的利益是由软件进行评估。在这种方式中,感兴趣的蛋白的强度可以容易地在一个特定的区域测定培养的感觉神经元内。

为了获得可靠的结果,提供了以下建议。首先,确保盖玻片盐酸孵化步骤1.4-1.6好后用清水洗净。否则,分子,如层粘连蛋白1将不会在盖玻片分散良好。其次,确认病种付费充分游离胰蛋白酶消化后(步骤3.5),否则细胞团块会形成,这将降低神经元的纯度。第三,它是最佳孵育的DRG细胞的步骤3.9的满3小时,得到神经元的更纯的群体。如果该温育步骤被缩短,则减少漂洗步骤5.1和5.2,以限制被后一个较短的温育时间脱落非神经细胞的数目。第四,确保表面张力被保持,同时施加的层粘连蛋白-1和dissociated神经元向盖玻片。如果表面张力消失,则溶液将延伸超出盖玻片和干燥。这会杀死神经元。第五,最佳细胞密度需要由每个研究者决定。先前的研究已经镀120,00神经细胞/ ml和在盖玻片上40000个神经元/毫升涂有1μg/ ml的层粘连蛋白-1和20微克/毫升的层粘连蛋白-1,分别8,16。这个浓度足够低,使调查人员无研究轴突末梢(结局尚未连接与另一个神经元)。六,免疫组化过程中,一定要轻轻冲洗细胞。删除或应用解决方案,也能迅速逐出盖玻片神经元。

这个程序的限制包括鸡背根神经节切除了几分有限的时间窗口。的DRG可以很容易地从胚胎天(E)7-10小鸡胚胎获得。而有可能早于E7获得的DRG,这是多少有些困难。 E11之后,更多的软骨反itions到骨,这使得剥离更困难。因此,研究,旨在对比胚胎与成人的神经元不会是理想的这小妞的模式,然而,以往的研究中使用的大鼠模型中的DRG 32岁的比较。但是应当注意的是,大鼠背根神经节解剖比较昂贵,不太可靠的和技术上比小鸡更具挑战性。还有一点要考虑的是培养胚胎DRG神经元随着时间的推移在文化变革的能力。例如,这些感觉神经元表达不同水平的受体的内48小时,取决于所选择的神经营养因子2,30的存在。

两个子类DRG神经元可以通过使用选择性神经营养因子在媒体2,12,30充实。例如,神经生长因子(NGF)和神经营养因子-3(NT-3),主要支持皮肤和本体感受神经元,分别33的生存。在本实验中使用的媒体同时具有NGF和NT3然而,这可以容易地修改,以选择为任一皮肤或本体感受感觉神经元。

分离的神经元是适合于众多的实时成像技术,包括生长锥运动和钙成像缩时想象。这里所用的介质是有利的活细胞成像,因为它不需要二氧化碳为介质的pH缓冲。因此,从活体细胞的数据采集可以在显微镜下进行了加 ​​热阶段,但不需要维持足够的CO 2水平。生长锥的速度,塌陷8,16,30和钙的含量17进行了研究,主要的活小鸡感觉神经元中分离这里描述的技术。此外,RNAi可有效地降低蛋白水平在培养的鸡DRG神经元34。

体外模型明确定义获得的分析结果可以被用作一个重要基础,设计实验在一个更复杂的体内模型中,例如,各种方法都在银的实验室35用于刺激轴突生长在神经胶质疤痕的体外模型。的各种试剂在体外试验中只有两个(炎症诱导和硫酸软骨素蛋白多糖的消化)能促进轴突再生。有趣的是, 在体内这两种治疗方法相结合的刺激戏剧性和功能轴突再生进入脊髓35。在这种情况下, 在体外实验提供了重要的工具来快速筛选试剂增加轴突生长。这成功地促进轴突生长的体外试剂也体内 ,这进一步支持了细胞培养实验值证明是成功的。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们要感谢艾莉森菲尔布鲁克,贝琳达Barbagallo和迈克尔·弗朗西斯对本文有见地的意见。研究报告本出版物是由R15区奖1R15NS070172-01A1授予​​M​​LL支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile small culture dishes (35 mm) Corning 430165
Sterile large culture dishes (100 mm) Falcon 353003
Sterile large Petri dishes (100 mm) VWR 89000-302
Glass Petri dish (100 mm) VWR D108962
Fine forceps Fine Science Tools 11251-10
Standard forceps Fine Science Tools 1100-12
Coverslips (22 x 22 mm) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
Porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media
HCl VWR VW3204-1 use at 2 M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution
Laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl
15 ml Conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10x Gibco 14200 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
PBS 10x Gibco 14080 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM
Penicillin/streptomyocin Sigma P0781 use 5 ml in 500 ml of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer
NGF RnD systems 256-GF Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
L-Glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Normal goat serum Life technologies PCN500
Microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated β1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

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References

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

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神经科学,第91,背根gangia,背根神经节,鸡,
分离和游离感觉神经元的文化活动从鸡胚
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Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

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