Summary
Cellekultur modellene gir detaljert kontroll over miljøforhold og dermed gi en kraftig plattform for å belyse mange aspekter av nevronale cellebiologi. Vi beskriver en hurtig, billig og pålitelig metode for å isolere, dissosierer, og kultur sensoriske neuroner fra kyllingembryo. Detaljer om grunnen forberedelse og immunocytochemistry tilbys også.
Abstract
Nerveceller er mangefasetterte celler som bærer informasjon avgjørende for en rekke funksjoner, inkludert følelse, motorikk, læring og hukommelse. Studerer nevroner in vivo kan være utfordrende på grunn av sin kompleksitet, sine varierte og dynamiske miljøer, og tekniske begrensninger. Av disse grunner, kan studere nerveceller in vitro være gunstig å løse de komplekse mysterier nevroner. Den godt definerte art cellekulturmodeller gir detaljert kontroll med miljøforhold og variabler. Her beskriver vi hvordan du isolerer, distansere, og kultur primære nerveceller fra kyllingembryo. Denne teknikken er rask, billig, og genererer robustly voksende sensoriske nerveceller. Fremgangsmåten produserer konsekvent kulturer som er sterkt anriket på neuroner og har svært få ikke-neuronale celler (mindre enn 5%). Primære nevroner ikke holder seg godt til ubehandlet glass eller vev kultur plast, derfor detaljerte prosedyrer for å lage to Distinct, er veldefinert laminin-inneholdende substratet for neuronal plette beskrevet. Dyrkede nevroner er svært mottagelig for flere cellulære og molekylære teknikker, inkludert co-immunoprecipitation, levende celle innbiller seg, RNAi, og immunocytochemistry. Prosedyrer for dobbel immunocytochemistry på følgende dyrkede nerveceller har blitt optimalisert og beskrevet her.
Introduction
Neuroner er komplekse celler som bærer informasjon som er viktig for en rekke funksjoner, inkludert følelse, syn, motorbevegelse, læring og hukommelse. Unike fra andre celletyper, neuroner strekker arm-lignende prosesser, kalt axoner, for å danne nødvendige nevrale motorveier for kommunikasjon. Under utvikling spesialisert avdelinger plassert på tuppen av voksende axoner, kalt vekst kjegler, navigere gjennom en konsert av ekstracellulære signaler for å lede axon til dens passende destinasjon. Den intrikate molekylære mekanismene som ligger bak veksten kjegle navigasjon er ikke fullt ut forstått. For bedre å forstå disse mekanismene, har etterforskerne brukt cellekultur modeller for å studere nervecellene i et definert og forenklet in vitro miljø. Studerer nevroner i kultur en har ført til betydelige fremskritt i vår forståelse av nervecellebiologi inkludert: neuronal differensiering 2, cytoskeletal dynamikk, endocytose og trafficking, Dendrittregulering 3,4, aksonal regenerasjon 5, og kliniske tilstander som neuropathies seks. I tillegg, dyrkede neuroner er svært mottagelig for et bredt spekter av forskning teknikker inkludert immunocytokjemi, celleoverflate co-immunoutfelling, Western blot, transfeksjon, RNAi, og direkte avbildning slik som timelapse analyse av vekst kjegle motilitet. Således dyrkning primære neuroner er en kraftig metode for å belyse en rekke sider ved cellebiologi av neuroner.
Cellekulturmodell gir etterforskere med detaljert kontroll over miljøforhold og variabler. For eksempel kan substratet på hvilke neuroner er belagt (og vokse over) lett manipuleres. Her vi gi detaljerte instruksjoner for å generere to forskjellige substrater, en med lav laminin-1-konsentrasjon, og den andre med mettende konsentrasjoner av laminin-1. Overraskende, kan forskjellige konsentrasjoner av det samme molekylet har dramatiske effekterpå den interne tilstand av nerveceller, så vel som deres celleoverflate sammensetning. For eksempel, intracellulære nivåer av cAMP og overflate nivåer av inte er vesentlig forskjellige i nevroner belagt på disse to grunnen 7,8. Ytterligere studier har vist at andre molekyler, inkludert fibronektin og chondroitin sulfat proteoglykaner, påvirker ekspresjonen av celleoverflatemolekyler og neuronal motilitet 7-11. I tillegg er løselige molekyler som neurotrophins og neurotropins også påvirke cellemembranen sammensetning og neuronal motilitet 12-16 og kan lett og nøyaktig manipuleres i en cellekulturmodell.
Her beskriver vi metoder for å isolere og kultur dissociated sensoriske nerveceller fra kyllingembryo. Denne prosedyren har blitt brukt til å gjøre betydelige gjennombrudd i nevrobiologi, inkludert axon utvekst 5,7,8,10,11,16-21 og ble endret fra en prosedyre utviklet for å isolere ganglion celler 22. Det finnesflere fordeler med denne tilnærmingen. Først er mange funksjoner i chick rygg rotganglion (DRG) utvikling godt karakterisert inkludert tidsramme for fødselen, axon forlengelse, og protein uttrykk profiler 2,23-28, og dermed gi en instruktiv grunnlaget for å bygge informativ in vitro eksperimenter. For det andre, dissosiert neuronale kulturer tillate undersøkeren til mer direkte å studere neuroner sammenlignet med alternative metoder ved bruk av intakte DRG-eksplantater (som inneholder neuroner og ikke-neuronale celler) og / eller blandede kulturer inneholdende både dissosiert nevroner og ikke-nevronale celler. Tredje, den prosedyren som er beskrevet her er enkel, billig og mottagelig for studenter. Derfor kan denne teknikken brukes til forskning, så vel som for undervisningsformål. Videre bør mindre variasjoner av denne protokollen tillater rask, høy avkastning rensing av nerveceller fra andre enn DRGs kilder. For eksempel kan denne prosedyren bli endret for å gi neuronally enriched kulturer fra andre vev slik som embryonisk forhjerne eller ryggmargen.
Immunocytochemistry protokoller har blitt optimalisert for disse dissociated nevrale kulturer og er beskrevet i detalj her. Fremgangsmåten for dobbelt immunocytokjemi mot neural celleadhesjonsmolekyl (NCAM) og β1 integriner er gitt. Data som genereres fra disse immuncytokjemisk metoder har blitt brukt til å undersøke den romlige mønster og intensitet av flere molekyler i dyrkede nerveceller 8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cover Forberedelse: Acid Wash og Bake
- Minst to dager før disseksjon (trinn 2), begynner de følgende skritt for å forberede Dekk. Utfør syre vasketrinn for å fjerne oljer og grundig rene dekkglass.
- Belastningsdekk i porselen holder som vertikalt posisjonerer Dekk og hindrer dem fra å berøre hverandre. Senk holderen og dekkglass i glass histologi beholder fylt med 2 M saltsyre (HCl). Alternativt, hvis porselen innehaveren ikke er tilgjengelig, spre ~ 20 Dekk horisontalt for å dekke bunnen på 100 mm glass petriskål og senk Dekk i 2 M HCl.
- Plasser glassbeholder (med dekkglass neddykket i syre) på vippebord i avtrekksskap og tillate skånsom gynge i minst 5 timer ved romtemperatur. Alternativt Dekksyrevask natten under samme forhold.
- Vask Dekk med destillert H 2 O (dH 2 O) ved å overføre porselen holder lastetmed dekkglass fra 2 M HCl til et rent glass histologi beholder fylt med dH 2 O. Alternativt dekanter 2 M HCl fra glass petriskål med dekkglass og fyll med dH 2 O.
- Vask ved dekantering dH 2 O igjen og påfylling glassbeholder med fersk dH 2 O. Gjenta til totalt tre vaskinger raske.
- Begynn lenger vask regime ved å returnere glass fartøy (med dekkglass og dH 2 O) på rocker. Tillat for skånsom omrøring i 10-30 minutter ved romtemperatur. Deretter dekanter dH 2 O og legge frisk dH 2 O. Gjenta til totalt minst ti gangers vask. Alternativt, fortsett å skylle over natten.
- Plasser vasket Dekk inn ovn forvarmet til 350 ° C. Hvis du bruker porselen holderen, fjern holderen fra dH 2 O fylte glassbeholder og deretter plassere holder med dekk direkte inn i ovnen. Hvis du bruker et glass petriskål, dekanter dH 2 O og plasser glassfat med Dekk inn i ovn;e.
- Bake Dekk i minst fem timer eller over natten ved 350 ° C.
- Etter steking er fullført, fjerner dekkglass fra porselen holder med fine tang og fyll i sterile 100 mm glass petriskål. La Dekk som ikke ble opprinnelig plassert i porselen holder i glasset petriskål.
2. Chick Dissection og isolering av DRGs
- Fjern fruktbare, iscenesatt Hvit Livorno chick egg fra inkubator (holdt på 37 til 38,5 ° C med milde rocking).
MERK: Tidligere studier har brukt embryonale dag 7-10 for isolering av DRGs 2,8,11-13,16. - Plasser valgt egg i laminær hette. Gjennomføre alle prosedyrene nedenfor under aseptiske forhold i laminær hette med sterile løsninger og virkemidler. Pre-varme alle løsninger i et 37 ° C vannbad.
- Sprekk egg og plassere innholdet i en plast 100 mm petriskål. Bruk standard pinsett til å overføre embryoet til en annen 100 mm petriskål.
- Legg varm F12HS10 (Hams F12, 10 mM HEPES, 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10% føtalt bovint serum) å antenne med Pasteur pipette for å holde vevet våt. Bruk pinsett til å plassere embryo på sin dorsal side (figur 1A).
- Plasser 100 mm plast petriskål som inneholder embryonale vev på en kikkert Stereo disseksjonsmikroskop i laminær hette. Bruk fin pinsett for å gjøre en vertikal midtlinjen snitt fra hale til hals ved å knipe utviklings dermis å avdekke hjerte, lunge og andre organer. Alternativt lage en serie av små rifter å avsløre indre organer.
- Forsiktig bruke to sett med sterile fin pinsett til: a) holde halsen og b) ta tak i aorta eller andre vev nærmest overordnet det hjertet og trekk mot halen,eviscerating dyret.
- Påfør varm F12HS10 med Pasteur pipette til vev. Bruk pinsett for å fjerne eventuelle gjenværende kardiovaskulære, respiratoriske eller fordøyelsesorganer for å avsløre utviklings ribbeina, ryggraden og DRGs (Tall 1B-1D).
- Under dissekere mikroskop, bruker fine tang å ytterligere fjerne organer og samle DRGs langs begge sider av lumbar virvelsøylen, dårligere til ribbeina. Samle DRGs ved plukker intakte DRGs fra embryo. Knip og skille røttene som kommer fra DRG mot ryggmargen og fatte utviklings nerve som går fra DRG mot periferien eller vice versa.
- Plasser intakte DRGs inn en 35 mm kultur tallerken fylt med varmt F12HS10. Fjern eventuelle overflødig vev, slik som den dorsale eller ventrale røtter som kan ha fulgt DRGs, fra de intakte DRGs i 35 mm fatet ved å knipe med fin pinsett.
- For å få DRGs overlegen til korsryggen, fjerne ventral halvparten av thorax og cervical ryggsøylen. Dette gjøres ved å gjøre et kutt i den tredje virvelsøylen vinkelrett på ryggmargen aksen i den øvre cervikale region og et annet snitt i den øvre lumbalregionen. Deretter gjøre kutt parallelt med ryggmargs aksen langs høyre og venstre side av ryggsøylen. Løft ventral halvparten av virvelsøylen fra embryo, som eksponerer utsetter ryggmarg (Tall 1E-1F).
- For å gi enkel tilgang til DRGs, fjerne thorax og cervical ryggmargen ved å ta tak i ryggmargen med fin pinsett. Bruk pinsett til å løfte ryggmargen av virvelsøylen. Som en tilnærming er det thorax ryggmargen på nivå med ribben og den cervikale område er overlegne i forhold til ribbene.
- Samle intakt thorax og cervical DRGs med fin pinsett og legg dem i varmt F12HS10 med andre DRGs. Fjern overflødig vev som kan følge DRGs.
- Skyll interiøret i et nytt glass Pasteur pipette med F12HS10 å hjelpehindre DRGs fester seg til veggene i pipette. Bruk skylles pipette til å overføre alle DRGs og F12HS10 fra små petriskål til en steril 15 ml konisk rør og umiddelbart videre til trinn tre.
MERK: Ytterligere embryoer kan bli dissekert for å øke antall DRGs. DRGs bør holdes i F12HS10 ved 37 ° C til den er klar for trinn 3.
3. dissosiasjon, berikende, og dyrking DRG nevroner - Del 1
- Plass konisk rør med intakte DRGs i sentrifuge og forsiktig rotere (200 xg) i 2-3 min. Bekreft at DRGs har sunket til bunnen av røret. Hvis ikke, spinne på nytt.
- Ved hjelp av en pipette, forsiktig fjerne F12HS10, forlater DRG pellet uforstyrret. Tilsett 2 ml 1x kalsium og magnesium gratis (CMF) PBS, løsner pelleten av DRGs. Spinne igjen og fjerne CMF PBS samtidig la DRG pellet intakt. Gjenta dette vasketrinn for totalt tre vaskinger for å fjerne føtalt bovint serum i F12HS10, noe som ville forstyrre trypsin fordøyelse Neste skritt.
- Tilsett 2 ml varmet trypsin til 15 ml tube som inneholder 2 ml CMF PBS og DRGs. Plasser røret på 37 ° C vannbad i 10-15 min for å fordøye DRGs i dissosierte celler.
- Under inkubasjon foreta F12H + supplement inneholdende medium (Hams F12, 10 mM HEPES 100 enheter / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin og N2) og varm i 37 ° C vannbad. Vanligvis 10 ml totalmaterialet er tilstrekkelig for 4-5 35 mm skåler av primære sensoriske nevroner. Også begynne tining laminin-en for belegg Dekk (trinn 4).
- Forsiktig Knus DRGs i trypsin løsning med P1000 pipette og visuelt inspisere for fravær av intakte DRGs. Fortsett utgnidning til intakte DRGs blir ikke lenger sett ved øyet og / eller tillate lengre trypsin inkubasjon i 37 ° C vannbad til intakte DRGs er dissosiert. For å beskytte DRG nevroner fra skade, unngå luftbobler under utgnidning og begrense trypsin fordøyelsen til <30 min.
- Sentrifugee rør som inneholder dissosierte DRGs og trypsin ved 200 xg i 3-5 minutter for å danne pellets. Spin lenger om nødvendig inntil pelleten dannes.
- Aspirer trypsin nøye uten å forstyrre pelleten. Tilsett 2 ml F12HS10 til pellet. Forsiktig finfordel DRGs med en P1000 pipette.
- Overføre alt innhold fra 15 ml konisk rør inn 100 mm kultur parabolen. Skyll røret med 8 ml F12HS10 og overføre det til dyrkningsskål, 2 ml i en tid på totalt 10 ml. Dette rensetrinnet bidrar samle celler som kan ha forblitt festet til veggene av røret.
- Plasser 100 mm dyrkningsskål (med 10 ml F12HS10 og dissosiert DRG-celler) i en fuktet 37 ° C inkubator i 3 timer.
MERK: CO 2 er ikke nødvendig i kuvøse fordi HEPES buffere media pH i fravær av CO 2. I løpet av inkubasjonen, gliaceller binde seg til overflaten av vevskultur plast og har en tendens til neuroner løst holde glial seng.
4. Coating Acid Washedog bakt Dekk med Laminin-en
- Tine sterile porsjoner av frossen laminin-en på is.
- Under sterile betingelser, tilsett 1 ml steril 1 x PBS til 50 ul alikvot av laminin-1.
- Bruk en spektrofotometrisk absorbans for å oppnå en verdi på laminin-1 ved 280 nm. Bruk denne verdi i den følgende ligning for å bestemme konsentrasjonen av laminin-1.
ABS 280 = (konsentrasjon mg / ml) * (ekstinksjonskoeffisient av protein)
Den ekstinksjonskoeffisient for laminin-en er 0.86.
- Under sterile betingelser, fortynn laminin-1 1X med PBS for å oppnå konsentrasjoner på 1 mg / ml og 20 mg / ml. Bruk av disse to anvendte konsentrasjoner av laminin-1 for å oppnå en ti gangers forskjell av laminin-1 bundet til dekkglass (30 ng / cm 2 og 300 ng / cm 2, henholdsvis) etter inkubering 7,8,10.
- I en laminær hette, bruker fin pinsett til å plassere en syre-vasket og bakt coverslip inn i bunnen av en 35 mm dyrkningsskål. Gjenta som er nødvendig for å oppnå antall retter nødvendig.
- Emne Dekkglass til UV-lys for 20-30 min å ytterligere sikre sterilisering. Hold fatet lokket av under dette trinnet.
- Legg 400 mL av forberedt laminin-en til hvert glass dekkglass. Bruk pipette å spre laminin-en for å sikre full dekning av dekkglass. Overflatespenning vil tillate laminin-1 til å forbli på dekkglass og ikke spres ut mot bunnen av dyrkningsskål, som er nødvendig.
- Plassere lokket på fatet og tillate laminin-1 inkuberes i 2-3 timer ved værelsestemperatur (3 timer er optimalt).
- Etter laminin-en inkubasjon, skyll Dekk ved bruk av aseptisk teknikk med steril PBS i laminær hette. Fjern løsning på dekkglass og tilsett 400 mL PBS. Vent 5-10 min. Gjenta for totalt tre skyllinger.
- Forlate PBS på dekk etter siste skylling. Ikke bryte overflatespenningen under skylling og ikke tillate Dekk å tørke ut. Leave lokk på til den er klar til tallerkenen dissosiert nevroner på coverlip.
5. dissosiasjon, berikende, og dyrking DRG nevroner - Del 2
- Etter inkubasjon bruke en 10 ml steril pipette til forsiktig skylle bunnen av 100 mm skål som inneholder dissosierte DRG-celler. Hold rett på ~ 45 ° vinkel, trekker ~ 7 ml F12HS10 med pipette bistand, deretter forsiktig utvise 7 ml på ca 1/3 av tallerken. Gjenta 5x, forsiktig løsner nevroner.
- Rotere fatet og gjenta skylling prosedyre, for ytterligere seks skyllinger, på en annen 1/3 av parabolen. Gjenta prosedyren på nytt for resterende 1/3 av tallerken. På denne måten forsiktig skylle hele bunnen av fatet med F12HS10 å fjerne nerveceller.
- Bruke samme pipette, overføre F12HS10 inneholder nevroner fra 100 mm fatet til 15 konisk tube. Sentrifuger i 5-10 min på 200 g til pellet celler.
- Fjern F12HS10, forlater pellet uforstyrret. Resuspender pellet med 2 ml varmet F12H + kosttilskudd.
- Fortynn cellene som er nødvendige med F12H + kosttilskudd for å oppnå ønsket pletteringskonsentrasjon (120 000 celler / ml for dekkglass belagt med 1 pg / ml laminin-1 og 40 000 celler / ml for dekkglass belagt med 20 pg / ml laminin-1 8,16).
- Fjern PBS fra laminin-belagt Dekk og umiddelbart plassere 400 mL av celler på dekkglass. Overføre fatet forsiktig til en fuktet 37 ° C cellekulturinkubator. La blandingen inkuberes i minst 1 time, og opp til 3 timer for å tillate neuroner å følge laminin-1.
- Under sterile forhold, forsiktig flom 35 mm retter som inneholder nevroner med 1,6 ml F12H + kosttilskudd.
MERK: På denne tiden, overflatespenning på dekkglass kan brytes. Nerveceller har tilstrekkelig overholdt laminin-1 på dekkglass. - Returnere celler til inkubator og ruge over natten. Utføre eksperimenter slike som immunocytochemistry neste dag.
6. Jegmmunocytochemistry
- Før immunocytokjemi og varm fikserløsning (4% paraformaldehyd, 30% sukrose 2X PBS) i 37 ° C vannbad.
MERK: Før fikse celler, behandle med ulike reagenser, for eksempel netrin-1, Mn 2 +, Sonic pinnsvin, semaphorin, og Efrin 16,29-31. - Sakte fjerne en ml av de 2 ml F12H + kosttilskudd fra kultur parabolen. Tilsett 1 ml varmet fiksativ løsning. Tillat å inkubere ved romtemperatur i 10-15 min.
- Fjern forsiktig fiksativ løsning og tilsett 2 ml PBS. Påfør løsning mot kanten av fatet, unngå mulig løsner faste celler på grunn av bruk av PBS. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Gjenta vask PBS for en total av 5 vaskinger. Ikke la cellene til å tørke under noen trinn i immunocytochemistry.
- Fjern PBS. Påfør 1 ml blokkeringsløsning (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normalt geiteserum). Inkuber i 1 time ved romtemperatur. Alternativt å farge overflatemolekyler, Ikke bruk Triton-X i blokkering løsning åtte.
- Fortynne primære antistoffer i blokkering løsning per produksjon anbefaling. Bruk 1: 500 for antistoffer mot NCAM og aktivert β1 inte 16. Fjern blokkeringsløsning, tilsett 1 ml av primære antistoff-løsning og inkuberes i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Fjern primær antistoff løsning og tilsett 2 ml med 1X PBS. Inkuber i 5 til 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta til totalt 4 PBS-vasker. Vasker kan utvides ved behov.
- Fortynne sekundært antistoff 1: 1000 i blokkering løsning. Fjern PBS, tilsett 1 ml sekundært antistoff-løsning og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Sekundære antistoffer er lysfølsom. Hold løsninger og celler i mørket så mye som mulig fra dette tidspunktet. - Fjern sekundært antistoff løsning og skyll 5x med 1x PBS, som gjort tidligere.
- Påfør ~ 60-80 mL av FluoromountG på et objektglass. Bruke fin pinsett, forsiktig løft dekk ut av fatet og lavere dekk inn Fluoromount G på objektglass. Unngå luftbobler.
- Lagres glir horisontalt ved 4 ° C i mørket. Etter 12-24 timer, vil Fluormount G polymerisere og dekkglass vil være godt festet til objektglass. Bilde celler etter denne polymerisasjon trinnet er fullført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen er beskrevet her gjør etterforskere til kultur en beriket befolkning på dissociated embryonale sensoriske nevroner med svært få (f.eks <5%) ikke-nevronale celler 7,8,10,16. Mange DRGs kan fås fra lumbosacral, thorax og cervical regioner. Avhengig av behovene til etterforsker, kan DRGs fra disse forskjellige anatomiske regioner være lett isolert. For eksempel, Figur 1 viser bilder av kylling embryo gjennom ulike stadier av disseksjon med lende DRGs uthevet i figur 1C og 1D og thorax DRGs i figurene 1E og 1F.
Dyrkede celler er lett merket med immunocytochemistry. Her blir dyrkede celler immunostained med antistoffer mot integrinet β1 og NCAM (figur 2). Overraskende, har vi vært i stand til å visualisere fluorescerende farging for inntil ett år etter at disseICC-prosedyrer, dersom skinnene var holdt horisontalt ved 4 ° C og i mørket. Men trenger lang av ICC flekker som skal bestemmes av brukeren og per antistoff.
Avhengig av tettheten av nevroner, kan vekst kjegler på tips for å utvide neurites også visualiseres (Tall 2D-2F). Neuroner belagt på 40 000 og 120 000 celler / ml på dekkglass belagt med 20 pg / ml og 1 ug / ml laminin-1 henholdsvis, har tallrike frie neurites opp til 26 timer post plating. Disse kulturer kan anvendes for spesifikt å analysere vekst kjegler i tillegg til å analysere hele neuron. Tidligere har denne prosedyren blitt brukt til å evaluere vekst kjegle hastighet og atferd, slik som vekst kjegle kollaps 8,9,11,13,16. Lavere plating tettheter på disse dekk resulterer i død nevroner som ikke levd opp til undergrunnen. Den nøyaktige passende tetthet som er nødvendig for hvert forsøk må optimaliseres per søkeren.
Figur 1. stadier av embryonale chick disseksjon for å få DRGs. A) Chick embryo liggende på ryggsiden. Hjertet (H), er vingene (W) og ben (L)-merket. Toppen av bildet ligger mot hodet, eller overlegne (S). Den nedre del av bildet er mot halen, eller mindreverdig (I). R = høyre side av animalsk, L = venstre side av dyret. Alle etterfølgende bilder er i samme retning. B) De indre organene er fjernet fra embryo i A. virvelsøylen, er ribbeina og DRGs sett. For enkelhets skyld, en rib er merket, er tre representative DRGs identifisert av svarte sirkler og thorax og lumbale ryggsøylen er merket. C) Samme kylling embryo bilde som B med en grå boks som identifiserer regionen vist ved HiGhennes forstørrelse i D. D) Høyere forstørrelse av lumbar ryggraden (VC) region. Tre av de elleve DRGs i denne visningen er identifisert med stiplede sirkler. DRGs er runde og innkapslet. Disse funksjonene gjør det enkelt å få tak intakte DRGs med pinsett. E) En kyllingembryo etter fjerning av indre organer og ventral halvparten av thorax ryggraden. Grå boks angir regionen vist ved høyere forstørrelse i F. F) Ryggmargs (SC) er sett i området der virvelsøylen er fjernet. Mot bunnen av bildet, er det lumbale virvelsøylen (VC) fortsatt er intakt. 3 av 10 DRGs er identifisert med stiplede sirkler. DRGs er funnet mellom hvert sett med ribbeina.
Figur 2. Dyrkede primære sensoriske nevroner immunolabeled for NCAM og β1 inte. Chick DRG nerveceller dyrket på høye konsentrasjoner av laminin-en er immunopositive for NCAM (A) og β1 inte (B). C) sammenslåtte bildet av to flekker avslører de fleste cellene er positive for både NCAM og β1 inte. Disse avian sensoriske neuroner er immunopositive for begge av disse markørene. Det er imidlertid en celle, som er merket med en stjerne som er NCAM negative og positive β1 integrin, i samsvar med en ikke-nevronale celler. DF) Høyere forstørrelse av en kultivert sensorisk neuron viser neurites strekker seg fra cellelegemet. D) Innsatt i hvitt boksen viser høyere forstørrelse av vekst kjegle på tuppen av en neurite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi detaljerte protokoller for isolering og dyrking dissociated sensoriske nerveceller fra en kylling embryo. Denne prosedyren genererer en beriket befolkning på robust voksende nevroner in vitro 7,8,10,16. Mange cellulære og molekylære teknikker kan anvendes på disse dyrkede nevroner, inkludert immunocytokjemi, som er beskrevet her. Denne protokollen ble nylig brukt til kvantitativt vurdere intensiteten av immunolabeled aktivert inte i sensoriske vekst kjegler 8,16. I disse tidligere studiene ble et program som brukes til nøyaktig å lage en skisse av den distale enden 20 mikron av veksten kjegle. Skissen ble laget basert på NCAM farging. Den allestedsnærværende ekspresjonen av NCAM i nerveceller aktivert programmet for å identifisere hele veksten kjegle i stedet for en begrenset del av vekst kjegle. Denne veksten kjegle omriss ble deretter identifisert som et område av interesse og den integrin fargeintensitet innenfor denne region av interesse ble vurdert av programvaren. På denne måte, kan intensiteten av et protein av interesse kan lett måles i en bestemt region innenfor dyrkede sensoriske nevroner.
For å oppnå pålitelige resultater, er følgende anbefalingene gitt. Først må du kontrollere at dekkglass er godt vasket med vann etter HCl inkubasjon i trinn 01.04 til 01.06. Ellers vil molekyler slik som laminin-1 ikke dispergere godt på dekkglass. For det andre bekrefter at DRGs er tilstrekkelig dissosiert (trinn 3.5) etter trypsin fordøyelsen, ellers klumper av celler vil danne og dette vil redusere neuronal renhet. For det tredje er det optimalt å inkubere DRG-celler i trinn 3.9 for en full 3 timer for å oppnå et renere populasjon av neuroner. Hvis denne inkuberingstrinnet er forkortet, og deretter redusere skylling trinn 5.1 og 5.2 for å begrense antallet av ikke-neuronale celler som er forflyttet etter en kortere inkuberingstid. Fjerde, sikre at overflatespenningen opprettholdes mens søknad laminin-1 og ble løstnader nevroner til Dekkglass. Dersom overflatespenningen er tapt, vil løsningen utover dekkglass og tørr. Dette vil drepe nervecellene. Femte, trenger optimal celletetthet som fastsettes av hver etterforsker. Tidligere studier har belagt 120,00 nerveceller / ml og 40.000 nevroner / ml på dekkglass belagt med 1 pg / ml laminin-1 og 20 pg / ml laminin-1, henholdsvis 8,16. Denne konsentrasjonen var lav nok til at etterforskerne å studere gratis axon avslutninger (avslutninger som hadde ennå ikke er knyttet til en annen nervecelle). Sjette, under immunocytokjemi, være sikker på å forsiktig skylle celler. Fjerne eller bruke løsninger for raskt kan løsne nerveceller fra dekkglass.
Begrensninger av denne prosedyren inkludere noe begrenset tidsvindu av chick DRG disseksjon. DRGs kan lett fås fra embryoniske dag (E) 7-10 kyllingembryo. Mens det er mulig å oppnå DRGs tidligere enn E7, er det noe vanskelig. Etter E11, mer brusk transitions til benet og dette gjør det vanskeligere disseksjon. Dermed studier som tar sikte på å sammenligne embryonale versus voksne nevroner ville ikke være ideelt for denne dama modellen, men har tidligere studier brukt rottemodellen for alder sammenligning i DRGs 32. Det bør bemerkes at rotte DRG disseksjon er mer kostbart og mindre robust og teknisk mer utfordrende enn chick. Et annet punkt å vurdere er muligheten av dyrkede embryonale DRG nevroner å endre seg over tid i kultur. For eksempel, disse sensoriske nevroner uttrykke forskjellige nivåer av reseptorer i 48 timer avhengig av nærværet av utvalgte neurotrophins 2,30.
To subklasser av DRG nevroner kan bli beriket av bruk av selektive neurotrophins i media 2,12,30. For eksempel, nervevekstfaktor (NGF) og Neurotrophin-3 (NT3) primært støtte overlevelsen av kutane og proprioseptive neuroner, henholdsvis 33. Mediene som brukes i dette eksperimentet har både NGF og NT3, Men dette kan enkelt endres til å velge for enten hud eller proprioseptive sensoriske nerveceller.
Dissosiert nevroner er mottagelig for en rekke live-bildeteknikker inkludert timelapse skaping av vekst kjegle motilitet og kalsium bildebehandling. Mediene brukes her er en fordel for live cell imaging fordi det ikke krever CO 2 for pH bufring av media. Dermed kan datainnsamling fra levende celler utføres på et mikroskop med et oppvarmet scenen, men krever ikke vedlikehold av tilstrekkelig CO 2 nivåer. Vekst kjegle hastighet, kollaps 8,16,30, og kalsiumnivåer 17 har blitt studert i levende primær chick sensoriske nevroner isolerte på grunn av teknikken beskrevet her. I tillegg kan RNAi kunne redusere proteinnivåer i dyrkede chick DRG nevroner 34.
Innsiktene fra veldefinerte in vitro-modeller kan brukes som et viktig grunnlag for å utforme eksperimenteri en mer kompleks in vivo-modell. For eksempel ble forskjellige tilnærminger benyttes i Silver lab 35 for å stimulere utvekst axon i en in vitro modell av glial arret. Av mangfoldet av reagenser testet in vitro, kunne bare to (betennelse induksjon og fordøyelsen av chondroitin sulfate proteoglykaner) fremme axon regenerering. Interessant, en kombinasjon av disse to behandlinger in vivo stimulerte dramatisk og funksjonelle axon regenerering inn i ryggmargen 35. I dette tilfellet, in vitro eksperimenter gitt et viktig verktøy for å raskt screene for reagenser som økte axon utvekst. Reagensene som med hell markedsført axon vekst in vitro også vist seg vellykket in vivo, noe som ytterligere støtter verdien av cellekultureksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Alison Philbrook, Belinda Barbagallo og Michael Francis for innsiktsfulle kommentarer på dette papiret. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av en R15 AREA award 1R15NS070172-01A1 tildelt MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
