Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering og dyrkning af dissocierede sensoriske neuroner Fra kyllingeembryoer

Published: September 24, 2014 doi: 10.3791/51991
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Natural Sciences, Assumption College

Summary

Cellekulturmodeller give detaljerede kontrol over miljøforhold og dermed give en stærk platform til at belyse mange aspekter af neuronal cellebiologi. Vi beskriver en hurtig, billig og pålidelig metode til at isolere, dissociere og kultur sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Nærmere oplysninger om substrata forberedelse og immuncytokemi er også til rådighed.

Abstract

Neuroner er mangesidede celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, motorisk bevægelse, læring og hukommelse. At studere neuroner in vivo kan være en udfordring på grund af deres kompleksitet, deres varierede og dynamiske miljøer, og tekniske begrænsninger. Af disse grunde kan studere neuroner in vitro vise sig gavnlig at optrævle de komplekse mysterier neuroner. Den veldefineret karakter cellekulturmodeller giver detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. Her beskriver vi, hvordan du isolerer, dissociere og kultur primære neuroner fra kyllingefostre. Denne teknik er hurtig, billig, og genererer robust voksende sensoriske neuroner. Proceduren konsekvent fremstiller kulturer, der er stærkt beriget med neuroner og har meget få ikke-neuronale celler (mindre end 5%). Primære neuroner ikke klæber godt til ubehandlet glas eller vævskulturplast derfor detaljerede procedurer for at skabe to Distinct, er veldefinerede laminin-holdige substrater til neuronal plettering beskrevet. Kulturperler neuroner er meget modtagelig til flere cellulære og molekylære teknikker, herunder co-immunopræcipitation, levende celler forestille, RNAi, og immuncytokemi. Procedurer for dobbelt immunocytokemi på disse dyrkede neuroner er blevet optimeret og beskrevet her.

Introduction

Neuroner er komplekse celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, vision, motor bevægelse, læring og hukommelse. Unik fra andre celletyper neuroner strækker arm-lignende processer, kaldet axoner til dannelse af væsentlige neurale veje for kommunikation. Under udvikling specialiserede rum placeret på spidsen af ​​voksende axoner, kaldet vækstkegler, navigere gennem en koncert af ekstracellulære stikord til at lede Axon til dens korrekte destination. De indviklede molekylære mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle navigation er ikke fuldt forstået. For bedre at forstå disse mekanismer, har forskere brugt cellekulturmodeller at studere neuroner i en defineret og forenklet in vitro-miljø. Studere neuroner i kultur 1 har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af neuronal cellebiologi herunder: neuronal differentiering 2, cytoskeletale dynamik, endocytose og menneskehandel, dendritcellerregulering 3,4, axonal regenerering 5, og kliniske tilstande, såsom neuropatier 6. Desuden dyrkede neuroner er meget modtagelig for en bred vifte af forskning teknikker herunder immuncytokemi celleoverflade co-immunfældning, western blot, transfektion, RNAi og levende billeddannelse såsom Timelapse analyse af vækst kegle motilitet. Således dyrkning primære neuroner er en kraftfuld metode til at belyse mange aspekter af cellebiologi af neuroner.

Cellekulturen modellen giver efterforskerne med detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. For eksempel kan substrater, som neuroner udplades (og vokse på) nemt manipuleres. Her giver vi detaljerede instruktioner til at generere to særskilte substrater, den ene med en lav laminin-1-koncentration og den anden med mættende koncentrationer af laminin-1. Overraskende kan forskellige koncentrationer af det samme molekyle have dramatiske virkningerden indre tilstand af neuroner samt deres celleoverflade sammensætning. For eksempel intracellulære niveauer af cAMP og overflade niveauer af integriner er væsentligt forskellige i neuroner belagt på disse to substrater 7,8. Yderligere undersøgelser har vist, at andre molekyler, herunder fibronectin og chondroitinsulfat-proteoglycaner, virkninger på ekspression af celleoverflademolekyler og neuronal motilitet 7-11. Desuden opløselige molekyler, såsom neurotrophiner og neurotropins også påvirke sammensætningen cellemembranen og neuronal motilitet 12-16 og kan være let og præcist manipuleres i en cellekultur-model.

Her beskriver vi metoder til at isolere og kultur dissocieret sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Denne procedure er blevet anvendt til at foretage betydelige gennembrud i neurobiologi, herunder axon udvækst 5,7,8,10,11,16-21 og blev ændret fra en procedure, designet til at isolere gangliecellerne 22. Der erflere fordele ved denne fremgangsmåde. Først mange funktioner i chick Dorsalrodsganglieceller (DRG) udvikling godt karakteriseret, herunder tidsrammen for fødslen, Axon udvidelse, og protein udtryk profiler 2,23-28, hvilket giver en lærerig grundlag for at bygge oplysende in vitro forsøg. For det andet adskilles neuronkulturer tillader investigator mere direkte studere neuroner i forhold til alternative fremgangsmåder ved hjælp af intakte DRG-eksplantater (som indeholder neuroner og ikke-neuronale celler) og / eller blandede kulturer indeholdende både dissocierede neuroner og ikke-neuronale celler. For det tredje, den her beskrevne procedure er ligetil, billig og modtagelig for bachelorstuderende. Derfor kan denne teknik anvendes til forskning samt til undervisningsformål. Desuden bør mindre ændringer af denne protokol giver hurtig, højt udbytte oprensning af neuroner fra andre end DRG kilder. For eksempel kan denne procedure modificeres til at give neuronalt Enriched kulturer fra andre væv, såsom embryonale forhjernen eller rygmarven.

Immuncytokemi protokoller er blevet optimeret for disse dissocierede neuronale kulturer, og er beskrevet i detaljer her. Proceduren for dobbelt immuncytokemi mod neural celleadhæsionsmolekyle (NCAM) og β1-integriner er tilvejebragt. Data genereret fra disse immunocytokemiske metoder er blevet anvendt til at undersøge den rumlige mønster og intensitet af flere molekyler i dyrkede neuroner 8,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coverslip Forberedelse: Acid Wash og bage

  1. Mindst 2 dage før dissektion (trin 2), begynder de følgende trin til at forberede dækglas. Udfør syrevasken trin for at fjerne olier og grundigt rene dækglas.
  2. Load dækglas i porcelæn holder, lodret positionerer dækglas og forhindrer dem i at røre hinanden. Sænk holderen og dækglas i glas histologi container fyldt med 2 M saltsyre (HCI). Alternativt, hvis indehaver porcelæn ikke er tilgængelig, spredt ~ 20 dækglas vandret for at dække bunden 100 mm glas petriskål og nedsænkes dækglas i 2 M HCI.
  3. Placer glasbeholder (med dækglas nedsænket i syre) på rocker bordet i stinkskab og tillade blid rocking mindst 5 timer ved stuetemperatur. Alternativt syre vask dækglas natten over under de samme betingelser.
  4. Vask dækglas med destilleret H2O (dH2O) ved at overføre indehaveren porcelæn loadedmed dækglas fra 2 M HCl til et rent glas histologi beholder fyldt med dH 2 O. Alternativt dekanteres 2 M HCI fra glas petriskål med dækglas og fyld med dH 2 O.
  5. Vask ved dekantering dH2O igen og genpåfyldning glasbeholder med frisk dH 2 O. Gentag for i alt 3 hurtige vaske.
  6. Begynd længere vask regime ved glasbeholder (med dækglas og dH 2 O) vender tilbage på rocker. Tillad forsigtig omrøring i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Derefter dekanteres dH2O og tilføje frisk dH 2 O. Gentag for i alt mindst ti vaskninger. Alternativt kan fortsætte vask natten over.
  7. Placer vasket dækglas i ovn forvarmet til 350 ° C. Hvis du bruger holder porcelæn, fjerne holderen fra dH2O fyldt glasbeholder og derefter placere holder med dækglas direkte ind i ovnen. Hvis du bruger et glas petriskål, dekanteres dH2O og placer glasfad med dækglas i furnace.
  8. Bag dækglas i mindst fem timer eller natten over ved 350 ° C.
  9. Efter bagning er færdig, skal du fjerne dækglas fra holderen porcelæn med fine pincet og anbringes i sterile 100 mm glas petriskål. Lad dækglas, der ikke oprindeligt var placeret i holderen porcelæn i glasset petriskål.

2. Chick Dissektion og Isolering af DRG

  1. Fjern frugtbar, iscenesat Hvid Italiener chick æg fra inkubatoren (afholdt ved 37-38,5 ° C med blid vuggende).
    BEMÆRK: Tidligere undersøgelser har brugt embryonale dag 7-10 til isolering af DRG 2,8,11-13,16.
  2. Sted valgt æg i laminar flow hætte. Udføre alle procedurer, der er anført nedenfor under aseptiske forhold i laminar flow hætte med sterile løsninger og instrumenter. Pre-varme alle løsninger i et 37 ° C vandbad.
  3. Knæk æg og placere indhold i en plastik 100 mm petriskål. Brug standard pincet til at overføre embryonet til et andet 100 mm petriskål.
  4. Tilføj varm F12HS10 (Hams F12, 10 mM HEPES, 100 enheder / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10% føtalt bovint serum) at uddele med Pasteur-pipette til at holde vævet vådt. Brug pincet til at positionere foster på rygsiden (figur 1A).
  5. Placer 100 mm plast petriskål indeholdende fostervæv på en kikkert stereovision dissektionsmikroskop i laminar flow hætte. Brug fine pincet til at lave en lodret midtliniesnit fra hale til hals ved at knibe udviklingslandene dermis at blotlægge hjerte, lunge og andre organer. Alternativt kan lave en række små tårer at afsløre de indre organer.
  6. Bruge forsigtigt 2 sæt sterile fine tænger til: a) gribe hals og b) at gribe aorta eller andet væv umiddelbart over hjertet og træk mod halen,udtagning dyret.
  7. Påfør varm F12HS10 med pasteurpipette til væv. Brug pincet til at fjerne alle resterende kardiovaskulære, respiratoriske eller fordøjelsesorganer at eksponere udviklingslandene ribben, rygsøjle og DRG (figur 1B-1D).
  8. Under dissektionsmikroskop, brug fin pincet til yderligere at fjerne organer og indsamle DRG langs begge sider af lumbal rygsøjle, ringere end ribbenene. Saml DRG ved plukning intakte DRG fra embryoet. Knib og skille rødderne, der når fra DRG mod rygmarven og tage fat i at udvikle nerve, der strækker sig fra DRG mod periferien eller omvendt.
  9. Placer intakte DRG i en 35 mm dyrkningsskål fyldt med varmt F12HS10. Fjern overskydende væv, såsom dorsale eller ventrale rødder, der kan have levet op til DRG, fra de intakte DRG i 35 mm skål ved at knibe med fine pincet.
  10. For at få DRG overlegen til lænden, skal du fjerne den ventrale halvdel af thorax og Cervical rygsøjlen. Dette gøres ved at lave et snit i udviklingen rygsøjlen vinkelret på rygmarven akse i det øvre cervikale region og et andet snit i den øvre lænden. Derefter foretage nedskæringer parallelt til rygmarven akse langs højre og venstre side af rygsøjlen. Løft den ventrale halvdel af rygsøjlen fra embryonet, der udsætter de blotlægger rygmarv (figur 1E-1F).
  11. At give nem adgang til DRG, fjern thorax og livmoderhalskræft rygmarven ved at gribe rygmarven med fine pincet. Brug pincet til at løfte rygmarven ud af rygsøjlen. Som en tilnærmelse, thorax rygmarven er på niveau med ribben og den cervikale område er overlegen i forhold til ribberne.
  12. Saml intakt thorax og livmoderhalskræft DRG med fine pincet og placere dem i varmt F12HS10 med andre DRG. Fjern overskydende væv, der kan klæbe til DRG.
  13. Skyl indre af en ny glas Pasteur-pipette med F12HS10 at hjælpeforhindre DRG klistrer til væggene i pipette. Brug skyllet pipette til at overføre alle DRG og F12HS10 fra små petriskål til en steril 15 ml konisk rør og straks videre til trin 3.
    BEMÆRK: Yderligere embryoner kan dissekeres for at øge antallet af DRG. DRG bør holdes i F12HS10 ved 37 ° C, indtil klar til trin 3.

3. Dissociation, Berigelse, og dyrkning DRG neuroner - Del 1

  1. Placer konisk rør med intakte DRG i centrifugen og forsigtigt dreje (200 xg) i 2-3 min. Bekræft, at DRG er sunket til bunden af ​​røret. Hvis ikke, spinde igen.
  2. Ved hjælp af en pipette forsigtigt fjerne F12HS10, forlader DRG pellet uforstyrret. Tilsæt 2 ml 1X calcium og magnesium gratis (CMF) PBS, forskubbes pelleteret DRG. Spin igen og fjern CMF PBS mens DRG pillen intakt. Gentag dette vasketrin for i alt tre vaske for at fjerne kalvefosterserum i F12HS10, hvilket ville interferere med trypsinfordøjelse i næste trin.
  3. Tilsæt 2 ml opvarmet trypsin til 15 ml rør indeholdende 2 ml CMF PBS og DRG. Placer røret i 37 ° C vandbad i 10-15 minutter for at fordøje DRG i dissocierede celler.
  4. Under inkubation gøre F12H + supplement indeholdende medier (Hams F12, 10 mM HEPES 100 enheder / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin og N2) og varm i 37 ° C vandbad. Typisk 10 ml af den samlede medier er tilstrækkelig til 4-5 35 mm-skåle af primære sensoriske neuroner. Også begynde optøning laminin-1 til belægning dækglas (trin 4).
  5. Forsigtigt triturat DRG i trypsinopløsning med P1000 pipette og visuelt inspicere for fravær af intakte DRG. Fortsæt findeling indtil intakte DRG ikke længere ses af øjet og / eller mulighed for længere trypsin inkubation i 37 ° C vandbad, indtil intakte DRG dissocieres. For at beskytte DRG neuroner mod skader, undgå luftbobler under findeling og begrænse trypsinfordøjelse til <30 min.
  6. Centrifuge rør indeholdende dissocierede DRG og trypsin ved 200 xg i 3-5 minutter til dannelse af pellets. Spin længere om nødvendigt indtil pellet er dannet.
  7. Aspireres forsigtigt trypsin uden at forstyrre pellet. Tilsæt 2 ml F12HS10 til pelletering. Findeles forsigtigt DRG med en P1000 pipettespids.
  8. Overfør hele indholdet fra 15 ml konisk rør i 100 mm dyrkningsskål. Skyl rør med 8 ml F12HS10 og overføre den til dyrkningsskålen, 2 ml ad gangen i alt 10 ml. Dette skylningstrin til indsamling af celler, der kan være forblevet klæbet til væggene i røret.
  9. Placer 100 mm dyrkningsskål (med 10 ml F12HS10 og dissocierede DRG-celler) i en befugtet 37 ° C inkubator i 3 timer.
    BEMÆRK: CO 2 er ikke påkrævet i inkubatoren fordi HEPES buffere medier pH i fravær af CO 2. Under inkubation glialceller binder til overfladen af ​​vævskulturplast og neuroner tendens til løst klæbe til glial seng.

4. Belægning Acid Washedog bages Dækglas med laminin-1

  1. Optø sterile portioner af frossen laminin-1 på is.
  2. Under sterile betingelser tilsættes 1 ml sterilt 1x PBS til 50 ul aliquot af laminin-1.
  3. Brug et spektrofotometer til opnåelse af en absorbansværdi laminin-1 ved 280 nm. Brug denne værdi i den følgende ligning til at bestemme koncentrationen af ​​laminin-1.

ABS 280 = (koncentration mg / ml) * (ekstinktionskoefficient protein)
Ekstinktionskoefficienten for laminin-1 er 0.86.

  1. Under sterile betingelser fortyndes laminin-1 med 1X PBS for at opnå koncentrationer på 1 mg / ml og 20 mg / ml. Brug disse to anvendte koncentrationer af laminin-1 for at opnå en ti-fold forskel laminin-1 bundet til dækglas (30 ng / cm2 og 300 ng / cm 2, henholdsvis) efter inkubering 7,8,10.
  2. I en laminar flow hætte, brug fin pincet til at placere en syrevasket og bagt Coverslip i bunden af ​​en 35 mm dyrkningsskål. Gentag efter behov for at opnå det antal retter, der er nødvendige.
  3. Emne dækglas for UV-lys i 20-30 minutter for yderligere at sikre sterilisering. Hold fad låget under dette trin.
  4. Tilsæt 400 pi af tilberedt laminin-1 til hver dækglas. Brug pipetten til at sprede laminin-1 for at sikre fuld dækning af dækglas. Overfladespænding vil tillade laminin-1 at forblive på dækglas og ikke spredes på bunden af ​​dyrkningsskålen, som er nødvendig.
  5. Sæt låg på skålen og tillade laminin-1 at inkubere i 2-3 timer ved stuetemperatur (3 timer er optimalt).
  6. Efter laminin-1 inkubation skylles dækglas brug af aseptisk teknik med sterilt PBS i laminar flow hætte. Fjern løsning på dækglas og tilsættes 400 pi PBS. Vent 5-10 min. Gentag for i alt 3 skylninger.
  7. Lad PBS på dækglas efter sidste skyl. Må ikke bryde overfladespændingen under skylning og tillader ikke dækglas at tørre ud. Leave låg på indtil klar til plade dissocierede neuroner på coverlip.

5. Dissociation, Berigelse, og dyrkning DRG neuroner - Del 2

  1. Efter inkubation bruge en 10 ml steril pipette til forsigtigt at skylle bunden af ​​100 mm skål indeholdende dissocierede DRG-celler. Hold skålen ved ~ 45 ° vinkel, træk ~ 7 ml F12HS10 med pipette hjælp, derefter forsigtigt udvise 7 ml på ca 1/3 af skålen. Gentag 5x, forsigtigt dislodging neuroner.
  2. Drej skålen og gentag skylle procedure, i yderligere seks skylninger, på en anden tredjedel af skålen. Gentag proceduren igen for de resterende 1/3 af skålen. På denne måde skylles forsigtigt hele bunden af ​​skålen med F12HS10 at fjerne neuroner.
  3. Ved hjælp af samme pipette F12HS10 neuroner fra 100 mm skål til 15 konisk rør. Centrifugeres i 5-10 min ved 200 g til pelletering celler.
  4. Fjern F12HS10, forlader pellet uforstyrret. Resuspender pellet med 2 ml opvarmet F12H + kosttilskud.
  5. Fortynd celler, som er nødvendige med F12H + kosttilskud for at opnå den ønskede koncentration plating (120.000 celler / ml for dækglas overtrukket med 1 ug / ml laminin-1 og 40.000 celler / ml dækglas overtrukket med 20 ug / ml laminin-1 8,16).
  6. Fjern PBS fra laminin-overtrukne dækglas og straks anbringe 400 pi celler på dækglas. Overføre forsigtigt skål til en fugtig, 37 ° C cellekultur inkubator. Tillad at inkubere i mindst 1 time og op til 3 timer for at tillade neuroner til at klæbe til laminin-1.
  7. Under sterile forhold, forsigtigt oversvømme 35 mm skåle indeholdende neuroner med 1,6 ml F12H + kosttilskud.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt, overfladespænding på dækglas kan brydes. Neuroner har tilstrækkeligt klæbet til laminin-1 på dækglas.
  8. Retur celler til inkubator og inkuberes natten over. Udføre eksperimenter såsom immuncytokemi den følgende dag.

6. Jegmmunocytochemistry

  1. Forud for immuncytokemi varm fikseringsopløsning (4% paraformaldehyd, 30% saccharose 2X PBS) i 37 ° C vandbad.
    BEMÆRK: Før fastsættelse af celler, behandle med forskellige reagenser, såsom netrin-1, Mn2 +, Sonic pindsvin, semaphorin og ephrin 16,29-31.
  2. Langsomt fjerne 1 ml af de 2 ml F12H + kosttilskud fra kultur fad. Forsigtigt tilsættes 1 ml opvarmet fikseringsopløsning. Tillad at inkubere ved stuetemperatur i 10-15 min.
  3. Fjern forsigtigt fikseringsopløsning og tilsættes 2 ml PBS. Påfør løsning på vej mod kanten af ​​skålen, undgå eventuel løsner af faste celler på grund af anvendelsen af ​​PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
  4. Gentag vask med PBS i alt 5 vaske. Lad ikke celler til at tørre under enhver trin af immuncytokemi.
  5. Fjern PBS. Anvend 1 ml blokerende opløsning (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normalt gedeserum). Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Alternativt til farvning overflademolekyler, Skal du ikke bruge Triton-X i blokerende opløsning 8.
  6. Fortyndet primære antistoffer i blokerende opløsning pr fremstillingen anbefaling. Brug 1: 500 for antistoffer mod NCAM og aktiveret β1 integriner 16. Fjern blokerende opløsning tilsættes 1 ml primært antistof-opløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  7. Fjern primært antistof og der tilsættes 2 ml 1X PBS. Inkuber i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Gentag for i alt 4 gange vask med PBS. Vasker kan forlænges, hvis det er nødvendigt.
  8. Fortynd sekundært antistof 1: 1000 i blokerende opløsning. Fjern PBS tilsættes 1 ml sekundært antistof-opløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Sekundære antistoffer er lysfølsomme. Hold løsninger og celler i mørke så meget som muligt fra dette punkt fremad.
  9. Fjern sekundær antistof og skyl 5x med 1x PBS, som gjort tidligere.
  10. Anvend ~ 60-80 pi FluoromountG på et objektglas. Ved hjælp af fine tænger, forsigtigt løfte dækglas ud af skålen og lavere dækglas i Fluoromount G på objektglas. Undgå luftbobler.
  11. Store glider vandret ved 4 ° C i mørke. Efter 12-24 timer vil Fluormount G polymerisere og dækglas vil være solidt fastgjort til objektglas. Billede celler efter denne polymerisation trin er fuldført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet her giver efterforskerne til kultur en beriget population af dissocierede embryonale sensoriske neuroner med meget få (f.eks <5%) ikke-neuronale celler 7,8,10,16. Talrige DRG kan fås fra lumbosacral, thorax og livmoderhalskræft regioner. Afhængig af behov investigator kan DRG fra disse forskellige anatomiske regioner let isoleres. For eksempel viser figur 1 billeder af kyllingefosteret gennem forskellige stadier af dissektion med lumbale DRG fremhævet i figurerne 1C og 1D og thorax DRG i figur 1E og 1F.

Dyrkede celler kan let mærkes ved hjælp af immuncytokemi. Her er dyrkede celler immunfarvet med antistoffer mod β1 integrin og NCAM (figur 2). Overraskende, har vi været i stand til at visualisere fluorescensfarvning i op til et år efter disseICC procedurer, hvis objektglassene blev holdt vandret ved 4 ° C og i mørke. Levetiden af ​​ICC pletter skal dog fastsættes af bruger og pr antistof.

Afhængig af tætheden af neuroner kan vækstkegler ved spidserne af strækker neuritter også visualiseres (figur 2D-2F). Neuroner udpladet med 40.000 og 120.000 celler / ml på dækglas overtrukket med 20 ug / ml og 1 mg / ml laminin-1 henholdsvis, har mange frie neuritter op til 26 timer efter udpladning. Disse kulturer kan anvendes til specifikt at analysere vækstkegler foruden at analysere hele neuron. Tidligere har denne procedure er blevet anvendt til at evaluere vækst kegle hastighed og adfærd, såsom vækstkonuskollaps 8,9,11,13,16. Lavere plating tætheder på disse dækglas resulterer i døde neuroner, der ikke er klæbet til substrater. Den nøjagtige passende tæthed nødvendige for hvert eksperiment skal optimeres pr investigator.

Figur 1. Stadier af embryonale chick dissektion at opnå DRG. A) hønseembryo liggende på strækkes. Hjertet (H), vinger (W) og ben (L) mærkes. Den øverste del af billedet er mod hovedet, eller bedre (S). I bunden af ​​billedet er mod halen, eller ringere (I). R = højre side af dyr, L = venstre side af dyr. Alle efterfølgende billeder er i samme retning. B) De indre organer er blevet fjernet fra foster i A. rygsøjle, er ribben og DRG set. For overskuelighedens skyld, en ribbe er mærket, er tre repræsentative DRG identificeret ved sorte cirkler og torakal og lumbal rygsøjle er mærket. C) Samme kyllingeembryo image som B med en grå boks identificerer regionen vist ved HIGhendes forstørrelse i D. D) Højere forstørrelse af lumbal rygsøjle (VC) region. Tre af de elleve DRG i dette synspunkt er identificeret ved stiplede cirkler. DRG er runde og indkapsles. Disse funktioner gør det let at opnå intakte DRG med pincet. E) Et hønseembryo efter fjernelse af indre organer og ventrale halvdel af thorax rygsøjlen. Grå kasse indikerer region er vist ved højere forstørrelse i F. F) Rygmarv (SC) er set i området, hvor rygsøjlen er blevet fjernet. Mod bunden af ​​billedet, er stadig intakt columna rygsøjlen (VC). 3 af 10 DRG er identificeret ved stiplede cirkler. DRG findes mellem hvert sæt ribber.

Figur 2
Figur 2. Dyrkede primære sensoriske neuroner immunolabeled NCAM og β1-integriner Chick DRG neuroner dyrket på høje koncentrationer af laminin-1. Er immunpositive for NCAM (A) og β1-integrin (B). C) Fusioneret billede af to pletter viser de fleste celler er positive for både NCAM og β1 integrin. Disse aviær sensoriske neuroner er immunpositive for begge disse markører. Men der er en celle, er markeret med en stjerne, der er NCAM negativ og β1-integrin positiv, i overensstemmelse med en ikke-neuronal celle. DF) Højere forstørrelse af en dyrket sensorisk neuron viser neuritter strækker sig fra cellen kroppen. D) Indsat i hvid boks viser større forstørrelse af vækst kegle på spidsen af ​​en neurit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi detaljerede protokoller til isolering og dyrkning dissocieret sensoriske neuroner fra en kyllingeembryo. Denne procedure genererer en beriget population af håndfast voksende neuroner in vitro 7,8,10,16. Talrige cellulære og molekylære teknikker kan anvendes på disse dyrkede neuroner, herunder immuncytokemi, der er beskrevet her. Denne protokol blev for nylig anvendt til kvantitativt at vurdere intensiteten af immunolabeled aktiverede integriner i sensoriske vækstkegler 8,16. I disse tidligere undersøgelser blev et software program, der bruges til præcist at skabe en skitse af den distale 20 micron ende af keglen vækst. Skitsen blev foretaget på grundlag af NCAM farvning. Den allestedsnærværende udtryk for NCAM i neuroner aktiveret programmet til at identificere hele vækst kegle i stedet for en begrænset del af keglen vækst. Denne vækst kegle skitse blev derefter identificeret som et område af interesse og integrinet farvningsintensiteten inden for denne regiom renter blev vurderet af softwaren. På denne måde, kan intensiteten af ​​et protein af interesse let måles i en bestemt region i dyrkede sensoriske neuroner.

For at opnå pålidelige resultater, er følgende anbefalinger forudsat. Først, at dækglas er godt vaskes med vand efter HCI inkubation i trin 1,4-1,6. Ellers vil molekyler, såsom laminin-1 spredes ikke godt på dækglasset. For det andet bekræfter, at DRG er tilstrækkeligt dissocieres (trin 3.5) efter trypsinfordøjelse, ellers klumper af celler vil danne og dette vil formindske neuronal renhed. For det tredje er det optimalt at inkubere DRG celler i trin 3.9 for en fuld 3 timer for at opnå en renere population af neuroner. Hvis dette inkubationstrin afkortes derefter falde skylning trin 5.1 og 5.2 for at begrænse antallet af ikke-neuronale celler, der er løsnet efter en kortere inkubationstid. For det fjerde at sikre, at overfladen holdes spændt, mens anvendelse laminin-1 og dissoknyttede neuroner til dækglassene. Hvis overfladespænding er tabt, vil opløsningen ud over dækglasset og tør. Dette vil dræbe neuroner. For det femte skal bestemmes af hver investigator optimale celle tæthed. Tidligere undersøgelser har belagt 120,00 neuroner / ml og 40.000 neuroner / ml på dækglas overtrukket med 1 ug / ml laminin-1 og 20 ug / ml laminin-1 henholdsvis 8,16. Denne koncentration var lav nok til at tillade efterforskerne at studere gratis Axon endelser (slutninger, der endnu ikke havde tilknytning til et andet neuron). Sjette, under immuncytokemi, være sikker på at forsigtigt skylle celler. Fjernelse eller anvende løsninger for hurtigt kan fjerne neuroner fra dækglasset.

Begrænsninger af denne fremgangsmåde omfatter den noget begrænset tidsvindue chick DRG dissektion. DRG kan nemt fås fra embryonale dag (E) 7-10 kyllingeembryoer. Selv om det er muligt at opnå DRG tidligere end E7, er det noget udfordrende. Efter E11 mere brusk transitions til knogle, og det gør dissektion vanskeligere. Således vil undersøgelser, der har til formål at sammenligne embryonale versus voksne neuroner ikke være ideel til denne chick model, har dog tidligere undersøgelser anvendt rottemodellen for alder sammenligning i DRG 32. Det skal bemærkes, at rotte DRG dissektion er dyrere, mindre robust og teknisk mere udfordrende end kylling. Et andet punkt at overveje, er evnen af ​​dyrkede embryonale DRG neuroner til at ændre sig over tid i kulturen. For eksempel disse sensoriske neuroner udtrykker forskellige niveauer af receptorer inden 48 timer afhængig af tilstedeværelsen af udvalgte neurotrophiner 2,30.

To underklasser af DRG neuroner kan beriges ved anvendelse af selektive neurotrophiner i medierne 2,12,30. For eksempel nervevækstfaktor (NGF) og neurotrophin-3 (NT3) primært støtter overlevelsen af kutant og proprioceptive neuroner, henholdsvis 33. De medier, der anvendes i dette eksperiment har både NGF og NT3, Men dette kan let ændres for at selektere enten kutane eller proprioceptive sensoriske neuroner.

Dissocierede neuroner er modtagelig for mange levende billeddiagnostiske teknikker, herunder timelapse forestille vækst kegle motilitet og calcium billeddannelse. Mediet, der anvendes her, er fordelagtig for levende celler, fordi det ikke kræver CO 2 til pH-bufferkapacitet af mediet. Således kan dataopsamling fra levende celler udføres på et mikroskop med en opvarmet tidspunkt, men kræver ikke vedligeholdelse af passende CO 2 niveauer. Vækst kegle hastighed, kollaps 8,16,30, og calcium niveauer 17 er blevet undersøgt i levende primær chick sensoriske neuroner isoleret af teknikken beskrevet her. Desuden kan RNAi succes formindske proteinniveauer i dyrket chick DRG neuroner 34.

Erfaringer fra veldefineret in vitro modeller kan anvendes som et vigtigt fundament for at designe eksperimenteri en mere kompleks in vivo-model. For eksempel blev forskellige metoder, der anvendes i Silver laboratorium 35 til stimulere axon-udvækst i en in vitro model af glial ar. Af de mange forskellige testet in vitro reagenser, kunne kun to (betændelse induktion og fordøjelse af chondroitinsulfat proteoglycaner) fremme Axon regenerering. Interessant, en kombination af disse to behandlinger in vivo stimuleret dramatisk og funktionelle Axon regenerering ind i rygmarven 35. I dette tilfælde de in vitro-forsøg udgjort et vigtigt redskab til hurtigt at screene for reagenser, der øgede Axon udvækst. De reagenser, der med succes fremmet Axon vækst in vitro viste sig også en succes in vivo, hvilket yderligere understøtter værdien af cellekultur eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Alison Philbrook, Belinda Barbagallo og Michael Francis for indsigtsfulde kommentarer til dette dokument. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af en R15 OMRÅDE award 1R15NS070172-01A1 tildelt MLL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile small culture dishes (35 mm) Corning 430165
Sterile large culture dishes (100 mm) Falcon 353003
Sterile large Petri dishes (100 mm) VWR 89000-302
Glass Petri dish (100 mm) VWR D108962
Fine forceps Fine Science Tools 11251-10
Standard forceps Fine Science Tools 1100-12
Coverslips (22 x 22 mm) Fisher 12 518 105K 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
Porcelin coverslip holder Thomas scientific 8542E40
Fetal Bovine serum Gibco 17502-048 use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media
HCl VWR VW3204-1 use at 2 M, can be used twice before discarding
NaCl Sigma S9888 use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution
Laminin-1 Invitrogen 23017-015 Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl
15 ml Conical tube cell treat 229411
PBS CMF 10x Gibco 14200 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
PBS 10x Gibco 14080 used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
Ham's F12 Lonza 12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 10438 use in F12HS20 at 10%
HEPES Sigma H3375 make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM
Penicillin/streptomyocin Sigma P0781 use 5 ml in 500 ml of F12 media
NT3 Millipore GF031 Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer
NGF RnD systems 256-GF Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
L-Glutamine Sigma G7513 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media
Trypsin Sigma T4049 aliquot under sterile conditions, store at -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA) Gibco 15260
Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose Sigma S9378 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Triton-X 100 Sigma T-8787
Paraformaldehyde Sigma P6148 used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Normal goat serum Life technologies PCN500
Microscope slides VWR 16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM Millipore AB5032 polyclonal
Antibody against activated β1 ingegrin Millipore MAB19294 monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Life technologies A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 Life technologies A11036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

Tags

Neuroscience dorsale gangia DRG kylling, Aviær laminin-1 embryonale primær
Isolering og dyrkning af dissocierede sensoriske neuroner Fra kyllingeembryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. … More

Powell, S., Vinod, A., Lemons, M. L. Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos. J. Vis. Exp. (91), e51991, doi:10.3791/51991 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter