Summary
modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.
Abstract
Les neurones sont des cellules multiples qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Etudier les neurones in vivo peut être difficile en raison de leur complexité, leurs environnements variés et dynamiques, et des limitations techniques. Pour ces raisons, l'étude de neurones in vitro peut s'avérer bénéfique pour percer les mystères complexes de neurones. La nature bien définie de modèles de culture cellulaire un contrôle détaillé des conditions environnementales et des variables. Nous décrivons ici comment isoler, dissocier, et les neurones culture primaires d'embryons de poulet. Cette technique est rapide, peu coûteux, robuste et génère croissance des neurones sensoriels. La procédure produit des cultures qui sont systématiquement hautement enrichies en neurones et a très peu de cellules non-neuronales (moins de 5%). Neurones primaires n'adhèrent pas bien à verre non traité ou la culture de tissus en plastique, donc des procédures détaillées pour créer deux Distinct, bien définie substrats contenant de la laminine-pour le placage neuronale sont décrits. Des neurones en culture sont prête très bien à des techniques moléculaires et cellulaires multiples, y compris la co-immunoprécipitation, imaginer des cellules vivantes, ARNi, et immunocytochimie. Procédures pour le double immunocytochimie sur ces neurones en culture ont été optimisés et décrit ici.
Introduction
Les neurones sont des cellules complexes qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, la vision, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Unique à partir d'autres types cellulaires, les neurones de bras s'étendent processus analogue, appelés axones, pour former des autoroutes neuronaux essentiels pour la communication. Au cours de compartiments de développement spécialisée situés à l'extrémité des axones en croissance, appelé les cônes de croissance, naviguer à travers un concert de signaux extracellulaires de mener l'axone à sa destination appropriée. Les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent cône navigation de croissance ne sont pas pleinement compris. Pour mieux comprendre ces mécanismes, les chercheurs ont utilisé des modèles de culture cellulaire pour étudier les neurones dans un environnement défini vitro et simplifiée. Etudier les neurones en culture 1 a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie des cellules neuronales, y compris: la différenciation neuronale 2, la dynamique du cytosquelette, l'endocytose et le trafic, dendritesla réglementation 3,4, la régénération axonale 5, et les conditions cliniques telles que les neuropathies 6. En outre, des neurones en culture sont prêtent très bien à une large gamme de techniques de recherche, y compris immunocytochimie, la surface des cellules co-immunoprécipitation, Western blot, la transfection, l'ARNi et imagerie en temps réel telles que l'analyse de timelapse de la motilité du cône de croissance. Ainsi, la culture de neurones primaires est une approche puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie cellulaire des neurones.
Le modèle de culture cellulaire fournit aux enquêteurs avec un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et les variables. Par exemple, le substrat sur lequel les neurones sont étalées (et poussent sur) peut être facilement manipulé. Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour produire deux substrats distincts, l'un avec une faible concentration de la laminine-1 et l'autre avec des concentrations saturantes de la laminine-1. De façon surprenante, des concentrations différentes de la même molécule peuvent avoir des effets dramatiquessur l'état interne de neurones ainsi que leur composition de la surface cellulaire. Par exemple, les taux intracellulaires d'AMPc et de surface niveaux de intégrines sont significativement différents dans les neurones étalées sur ces deux substrats 7,8. D'autres études ont montré que d'autres molécules, y compris la fibronectine et des protéoglycanes chondroïtine sulfate, l'impact de l'expression de molécules de surface cellulaire et la motilité des neurones 7-11. En outre, les molécules solubles tels que les neurotrophines et aussi l'impact neurotropins composition de la membrane cellulaire et la motilité des neurones et de 12 à 16 peuvent être manipulés facilement et avec précision dans un modèle de culture cellulaire.
Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler et culture dissociés neurones sensoriels à partir d'embryons de poulet. Cette procédure a été utilisée pour faire des percées significatives dans la neurobiologie, y compris la croissance axonale 5,7,8,10,11,16-21 et a été modifié à partir d'une procédure visant à isoler les cellules ganglionnaires de la 22. Il y aplusieurs avantages à cette approche. Tout d'abord, de nombreuses fonctionnalités de poussin ganglion de la racine dorsale (DRG) le développement sont bien caractérisés, y compris le délai de naissance, l'extension de l'axone, et les profils d'expression de la protéine 2,23-28, fournissant ainsi une base instructive sur laquelle construire informative des expériences in vitro. Ensuite, les cultures neuronales dissociées permettent le chercheur d'étudier plus directement les neurones par rapport à d'autres approches utilisant des explants de DRG intacts (qui contiennent des neurones et des cellules non-neuronales) et / ou des cultures mixtes contenant à la fois des neurones dissociés et les cellules non-neuronales. Troisièmement, la procédure décrite ici est simple, peu coûteux et se prêtent à de premier cycle. Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour la recherche ainsi qu'à des fins d'enseignement. En outre, des variations mineures de ce protocole devraient permettre rapide, à haut rendement purification des neurones à partir de sources autres que les DRG. Par exemple, cette procédure peut être modifiée pour fournir neuronale enriched cultures provenant d'autres tissus tels que le cerveau antérieur ou de la moelle épinière embryonnaire.
protocoles de immunocytochimie ont été optimisés pour ces cultures neuronales dissociées et sont décrits en détail ici. La procédure de double-immunocytochimie contre neural molécule d'adhésion cellulaire (NCAM) et β1 des intégrines est fourni. Les données produites par ces méthodes immunocytochimiques ont été utilisées pour examiner la structuration spatiale et d'intensité de plusieurs molécules dans des neurones en culture 8,16.
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Protocol
1 lamelle Préparation: Laver acide et Cuire
- Au moins 2 jours avant la dissection (étape 2), commencer les étapes suivantes pour préparer lamelles. Effectuer l'étape de lavage à l'acide pour éliminer les huiles et les lamelles de nettoyer à fond.
- lamelles de charge en support de porcelaine qui positionne verticalement lamelles et les empêche de toucher l'autre. Immerger support et des lamelles dans un récipient d'histologie de verre rempli d'acide chlorhydrique 2 M (HCl). Alternativement, si titulaire de porcelaine n'est pas disponible, répartis ~ 20 lamelles horizontalement pour couvrir le fond de 100 mm verre boîte de Petri et plonger des lamelles dans du HCl 2 M.
- Placez récipient en verre (avec des lamelles immergées dans de l'acide) sur la table à bascule dans une hotte et permettre doux balancement pendant au moins 5 heures à température ambiante. Sinon, lavage à l'acide lamelles de nuit dans les mêmes conditions.
- Laver les lamelles couvre-objet avec H 2 O distillée (dH 2 O) par le transfert de porte-charge porcelaineavec des lamelles de HCl 2 M dans un récipient en verre propre de l'histologie rempli avec dH 2 O. Sinon, décanter HCl 2 M de verre boîte de Pétri avec des lamelles et remplir avec dH 2 O.
- Laver par décantation dH2Û nouveau et le remplissage récipient en verre avec dH frais 2 O. Répétez l'opération pour un total de 3 lavages rapides.
- Commencer plus laver régime en retournant récipient en verre (avec des lamelles et dH 2 O) sur la bascule. Permettre agitation douce pendant 10-30 min à température ambiante. Ensuite, décanter dH2Û et ajouter dH frais 2 O. Répétez l'opération pour un total d'au moins dix lavages. Sinon, continuer le lavage pendant la nuit.
- Placez les lamelles dans le four préchauffé lavés à 350 ° C. Si vous utilisez titulaire de porcelaine, retirer le support de dH 2 récipient en verre O-rempli et puis placez support avec des lamelles directement dans le four. Si vous utilisez une boîte de Pétri en verre, décanter dH2Û et placer le plat en verre avec des lamelles dans le furnace.
- Cuire les lamelles pendant au moins cinq heures ou toute la nuit à 350 ° C.
- Après la cuisson est terminée, retirez les lamelles de porte en porcelaine avec des pinces fines et placez-le dans le verre 100 mm boîte de Petri stérile. Laissez lamelles qui n'avaient pas été placés dans le support de porcelaine dans le verre boîte de Pétri.
2. Chick Dissection et isolement des DRG
- Retirer fertile, mise en scène White Leghorn poussin oeuf de l'incubateur (tenue à 37 à 38,5 ° C avec doux balancement).
REMARQUE: Des études antérieures ont utilisé jour embryonnaire 7-10 pour l'isolement des DRG 2,8,11-13,16. - Placez l'oeuf sélectionné dans une hotte à flux laminaire. Effectuer toutes les procédures indiquées ci-dessous dans des conditions aseptiques dans la hotte à flux laminaire avec des solutions et des instruments stériles. Préchauffer toutes les solutions dans un bain-marie à 37 °.
- Crack œufs et placez le contenu dans une boîte de 100 mm de Petri en plastique. Utilisez une pince standard pour transférer l'embryon à un autre de 100 mm boîte de Petri.
- Ajouter F12HS10 chaud (F12 de Ham, 10 mM d'HEPES, 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg ml de streptomycine, de sérum / 10% de veau foetal) à plat avec pipette Pasteur à garder tissu humide. Utiliser des pinces pour positionner embryon sur sa face dorsale (Figure 1A).
- Placez 100 mm en plastique boîte de Pétri contenant du tissu embryonnaire sur un microscope binoculaire stéréoscopique de dissection dans une hotte à flux laminaire. Utilisez une pince fine à faire une incision verticale médiane de la queue à col en pinçant le derme de développement à exposer le coeur, les poumons et d'autres organes. Sinon, faire une série de petites larmes pour exposer les organes internes.
- Utilisent doucement 2 jeux de pinces fines stériles à: a) saisir le cou et b) saisir l'aorte ou d'autres tissus immédiatement supérieure à cœur et tirez vers la queue,éviscération de l'animal.
- Appliquer F12HS10 chaud avec pipette Pasteur pour les tissus. Utilisez une pince pour enlever les cardiovasculaires, les organes respiratoires ou digestifs restant à exposer les côtes en développement, la colonne vertébrale et les DRG (figures 1B-1D).
- Sous le microscope de dissection, utiliser une pince fine pour éliminer davantage les organes et recueillir des DRG long des deux côtés de la colonne vertébrale lombaire, inférieur aux côtes. Recueillir DRG en pinçant DRG intactes de l'embryon. Pincez et couper les racines qui s'étendent du DRG vers la moelle épinière et le nerf de préhension en développement qui s'étend de la DRG vers la périphérie ou vice versa.
- Placez DRG intactes dans une boîte de culture de 35 mm rempli de F12HS10 chaud. Retirez tout excès de tissu, comme la dorsale ou ventrale racines qui peuvent avoir adhéré à DRG, des DRG intactes en boîte de 35 mm en pinçant avec une pince fine.
- Pour obtenir des DRG supérieures à la région lombaire, retirez la moitié ventrale du thorax et cervical colonne vertébrale. Ceci est réalisé en effectuant une coupe dans la colonne vertébrale développement perpendiculaire à l'axe de la colonne vertébrale dans la région cervicale supérieure et une autre coupe dans la région lombaire supérieure. Ensuite, faire des coupes parallèles à l'axe de la moelle épinière le long de la côté gauche de la colonne vertébrale et de droite. Soulevez la moitié ventrale de la colonne vertébrale de l'embryon, ce qui expose les expose la moelle épinière (figures 1E-1F).
- Pour permettre un accès facile à DRG, retirer la moelle épinière thoracique et cervicale en saisissant la moelle épinière avec des pinces fines. Utilisez la pince pour soulever la moelle épinière de la colonne vertébrale. En première approximation, la moelle épinière thoracique se situe au niveau des nervures et de la zone du col est supérieure à celle des nervures.
- Recueillir thoracique intact et DRG col de l'utérus avec une pince fine et les placer dans F12HS10 chaud avec d'autres DRG. Retirer l'excès de tissu qui peuvent adhérer à DRG.
- Rincer l'intérieur d'une nouvelle pipette Pasteur en verre avec F12HS10 pour aiderempêcher GHM de coller aux parois de la pipette. Utilisez pipette rincée à transférer tous les DRG et F12HS10 de petite boîte de Petri à un tube de 15 ml conique stérile et procéder immédiatement à l'étape 3.
NOTE: Plus d'embryons peuvent être disséquées pour augmenter le nombre de DRG. DRG doivent être conservés dans F12HS10 à 37 ° C avant d'être prêt pour l'étape 3.
3. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 1
- Placer le tube conique avec GHM intactes dans la centrifugeuse et doucement tourner (200 xg) pendant 2-3 min. Vérifiez que les DRG ont coulé au fond du tube. Sinon, tourner à nouveau.
- Avec une pipette, enlever délicatement F12HS10, laissant DRG pastille intacte. Ajouter 2 ml de 1x calcium et de magnésium libre (CMF) PBS, déloger le culot de DRG. Spin et la retirer CMF PBS tout en laissant le culot de DRG intact. Répétez cette étape de lavage pour un total de trois lavages pour éliminer le sérum de veau fœtal dans F12HS10, qui pourrait interférer avec digestion par la trypsine à l'étape suivante.
- Ajouter 2 ml de trypsine réchauffé à tube de 15 ml contenant 2 ml de PBS et CMF DRG. Placer le tube dans 37 ° C bain d'eau pendant 10-15 min à digérer DRG dans les cellules dissociées.
- Pendant l'incubation, faire F12H + supplément contenant médias (F12 de Ham, 10 mM HEPES 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg / ml de streptomycine, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml de NGF, 200 mM de L-glutamine et N2) et chaud 37 ° C dans un bain d'eau. Typiquement, 10 ml de milieu totale est suffisante pour 4-5 plats de 35 mm de neurones sensoriels primaires. Aussi commencer la décongélation de la laminine-1 pour les lamelles de revêtement (étape 4).
- DRG doucement triturer dans une solution de trypsine avec p1000 pipette et inspecter visuellement de l'absence de DRG intactes. Continuer jusqu'à ce que la trituration DRG intactes ne sont plus considérés par les yeux et / ou permettre plus trypsine incubation dans 37 ° C bain d'eau jusqu'à ce que DRG intactes sont dissociés. Pour protéger les neurones de DRG de dommages, éviter les bulles d'air lors de trituration et de limiter digestion par la trypsine à <30 min.
- CentrifugTube électronique contenant DRG dissociés et de la trypsine à 200 xg pendant 3 à 5 min pour former des pellets. Spin plus si nécessaire jusqu'à ce culot est formé.
- Aspirer soigneusement la trypsine sans perturber culot. Ajouter 2 ml de F12HS10 à sédimenter. Triturer doucement DRG avec une pointe de pipette P1000.
- Transférer tous les contenus du tube de 15 ml conique dans 100 boîte de culture mm. Rincer le tube avec 8 ml F12HS10 et le transférer à la boîte de culture, de 2 ml à la fois pour un total de 10 ml. Cette étape de rinçage permet de recueillir les cellules qui auraient pu rester adhéré aux parois du tube.
- Passer boîte de culture de 100 mm (10 ml F12HS10 et les cellules dissociées dans un DRG) humidifié à 37 ° C pendant 3 heures incubateur.
REMARQUE: CO 2 n'est pas nécessaire dans l'incubateur parce HEPES tampons pH du substrat en l'absence de CO 2. Pendant l'incubation, les cellules gliales se lient à la surface du tissu plastique de la culture et les neurones ont tendance à adhérer de façon lâche au lit gliales.
4. Acid Washed revêtementLamelles et au four avec la laminine-1
- Décongeler aliquotes stériles de la laminine-1 congelés sur glace.
- Dans des conditions stériles, ajouter 1 ml de PBS stérile 1x 50 aliquote ul de la laminine-1.
- Utilisation d'un spectrophotomètre pour obtenir une valeur d'absorbance de la laminine-1 à 280 nm. Utiliser cette valeur dans l'équation suivante pour déterminer la concentration de la laminine-1.
ABS = 280 (concentration mg / ml) * (coefficient d'extinction de la protéine)
Le coefficient d'extinction pour la laminine-1 est de 0,86.
- Dans des conditions stériles, la laminine-1 dilué avec du PBS 1X à obtenir des concentrations de 1 mg / ml et 20 mg / ml. Utiliser ces deux concentrations appliquées de la laminine-1 pour obtenir une différence de dix fois de la laminine-1 lié à la lamelle couvre-objet (30 ng / cm 2 et 300 ng / cm 2, respectivement) après incubation 7,8,10.
- Dans une hotte à flux laminaire, utilisez une pince fine à placer un lavé à l'acide et au four coverslip dans le fond d'une boîte de culture de 35 mm. Répéter au besoin pour obtenir le nombre de plats nécessaires.
- Soumettre les lamelles couvre-objet à la lumière UV pendant 20 à 30 min de plus à assurer la stérilisation. Gardez le couvercle plat hors tension pendant cette étape.
- Ajouter 400 ul de prêt laminine-1 à chaque lamelle de verre. Utilisez pointe de la pipette pour répandre la laminine-1 afin d'assurer une couverture complète de la lamelle. La tension de surface permettra laminine-1 de rester sur la lamelle et ne se propage pas sur le fond du plat de la culture, qui est nécessaire.
- Placer le couvercle sur plat et laissez la laminine-1 à incuber pendant 2-3 heures à température ambiante (3 heures est optimal).
- Après la laminine-1 incubation, rincer les lamelles à l'aide de la technique aseptique avec du PBS stérile en hotte à flux laminaire. Retirer solution sur lamelle et ajouter 400 ul de PBS. Attendez 5-10 min. Répétez l'opération pour un total de 3 rinçages.
- Laissez PBS sur lamelle après le dernier rinçage. Ne pas briser la tension de surface pendant le rinçage et ne permettent pas de lamelles de sécher. Lecouvercle ave jusqu'à prêt à plaque neurones dissociés sur le coverlip.
5. dissociation, enrichissante, et culture des neurones DRG - Partie 2
- Après incubation, utiliser une pipette stérile de 10 ml à rincer doucement le fond du plat de 100 mm contenant des cellules DRG dissociés. Tenez plat à ~ 45 °, tirez ~ 7 ml de F12HS10 avec l'aide de la pipette, puis expulser doucement 7 ml sur environ 1/3 de plat. Répéter 5x, délogeant délicatement neurones.
- Tournez plat et répéter le rinçage procédure, pour six rinçages, sur un autre tiers de l'assiette. Répéter l'opération à nouveau pour rester tiers de plat. De cette façon, les rincer doucement tout le fond du plat avec F12HS10 pour enlever les neurones.
- Utilisant même pipette, transférer neurones F12HS10 contenant de 100 mm plat à 15 tube conique. Centrifuger pendant 5-10 min à 200 g pour sédimenter les cellules.
- Retirer F12HS10, laissant pastille intacte. Remettre le culot avec 2 ml de F12H réchauffé + suppléments.
- Diluer les cellules que nécessaire avec F12H + suppléments pour obtenir la concentration de placage souhaitée (120 000 cellules / ml pour des lamelles revêtues d'/ ml de cellules 1 ug de la laminine-1 et 40 000 / ml pour des lamelles revêtues avec 20 ug / ml de laminine-1 8,16).
- Retirer PBS à partir des lamelles de laminine-enduit et placer immédiatement 400 pi de cellules sur des lamelles. Soigneusement transférer à un plat humidifié, 37 ° C culture cellulaire incubateur. Laisser incuber pendant au moins une heure et jusqu'à 3 heures pour permettre à des neurones à adhérer à la laminine-1.
- Dans des conditions stériles, inonder doucement 35 mm plats neurones contenant 1,6 ml de F12H + suppléments.
NOTE: A ce moment, la tension de surface sur la lamelle peut être rompu. Les neurones ont bien adhéré à la laminine-1 sur la lamelle. - Retour cellules dans l'incubateur et incuber pendant la nuit. Réaliser des expériences telles que immunocytochimie le lendemain.
6. jemmunocytochemistry
- Avant l'immunocytochimie, solution de fixation à chaud (4% de paraformaldéhyde, 30% de saccharose 2X PBS) à 37 ° C bain d'eau.
REMARQUE: Avant de cellules de fixation, traiter avec divers réactifs, tels que la nétrine-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, sémaphorine, et ephrin 16,29-31. - Retirer lentement 1 ml de 2 ml de F12H + suppléments de boîte de culture. Incorporer délicatement 1 ml de solution de fixation réchauffé. Laisser incuber à température ambiante pendant 10 à 15 min.
- Retirez délicatement solution de fixation et ajouter 2 ml de PBS. Appliquer la solution vers le bord du plat, en évitant possible délogement des cellules fixes en raison de l'application de PBS. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Répétez PBS lavage pour un total de 5 lavages. Ne laissez pas les cellules à sécher pendant une étape de immunocytochimie.
- Retirer du PBS. Appliquer 1 ml de solution de blocage (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de sérum de chèvre normal). Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Sinon, pour tacher molécules de surface, Ne pas utiliser de Triton-X dans une solution de blocage 8.
- Diluer anticorps primaires dans une solution de blocage par la recommandation de la fabrication. Utilisez 1: 500 pour les anticorps contre NCAM et activé β1 intégrines 16. Retirer la solution de blocage, ajouter 1 ml de solution d'anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Retirer solution d'anticorps primaire et ajouter 2 ml de PBS 1X. Incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante. Répétez l'opération pour un total de 4 lavages PBS. Lavages peuvent être prolongés, si nécessaire.
- Diluer l'anticorps secondaire 1: 1000 dans une solution de blocage. Retirer PBS, ajouter 1 ml de solution d'anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
REMARQUE: Les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière. Conserver les solutions et les cellules dans l'obscurité autant que possible de ce point en avant. - Retirer la solution d'anticorps secondaire et rincer 5x avec PBS 1x, comme précédemment.
- Appliquer ~ 60-80 ul de FluoromountG sur une lame de microscope. En utilisant des pinces fines, soulevez doucement la lamelle sur plat et lamelle inférieure dans Fluoromount G sur lame de microscope. Éviter les bulles d'air.
- Magasin glisse horizontalement à 4 ° C dans l'obscurité. Après 12-24 heures, Fluormount G va polymériser et lamelle sera fermement attaché à lame de microscope. des cellules de l'image issue de cette étape de polymérisation est terminée.
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Representative Results
Le protocole décrit ici, les enquêteurs de la culture une population enrichie de neurones sensoriels embryonnaires dissociées avec très peu de cellules (par exemple, <5%) non-neuronales 7,8,10,16. De nombreux GHM peuvent être obtenues auprès du lombo-sacrée, thoracique et cervical. Selon les besoins de l'enquêteur, les GHM de ces régions anatomiques distinctes peuvent être facilement isolés. Par exemple, la figure 1 montre des images de l'embryon de poulet à travers différentes étapes de dissection avec les DRG lombaires mis en évidence dans les figures 1C et 1D et DRG thoraciques des figures 1E et 1F.
Les cellules cultivées sont facilement étiquetés par immunocytochimie. Ici, les cellules cultivées sont immunocolorées avec des anticorps dirigés contre l'intégrine β1 et NCAM (figure 2). Étonnamment, nous avons été en mesure de visualiser coloration fluorescente pour un maximum de un an après cesCPI procédures, si les lames ont été maintenues à l'horizontale à 4 ° C et dans l'obscurité. Cependant, la longévité des taches de la CPI doit être déterminé par l'utilisateur et par anticorps.
En fonction de la densité de neurones, les cônes de croissance à l'extrémité des neurites s'étendant peuvent également être visualisés (Figures 2D-2F). Les neurones plaquées à 40 000 et 120 000 cellules / ml sur des lamelles revêtues avec 20 ug / ml et 1 ug / ml de laminine-1, respectivement, ont de nombreux neurites libres jusqu'à 26 heures après plaquage. Ces cultures peuvent être utilisés pour analyser spécifiquement les cônes de croissance en plus de l'analyse de l'ensemble des neurones. Auparavant, cette procédure a été utilisée pour évaluer la vitesse et les comportements, tels que la croissance cône effondrement 8,9,11,13,16 cône de croissance. Densités de placage plus faibles sur ces résultats de Lamelles de neurones morts qui ne sont pas adhéré au substrat. La densité appropriée exacte nécessaire pour chaque expérience doit être optimisé par enquêteur.
Figure 1: Etapes de l'embryon de poulet dissection d'obtenir des DRG. A) Chick embryon couché sur le côté dorsal. Le cœur (H), les ailes (W) et les jambes (L) sont marqués. La partie supérieure de l'image est à la tête, ou supérieur (S). Le fond de l'image est à la queue, ou inférieur (I). R = latéral droit de l'animal, L = gauche de l'animal. Toutes les images suivantes sont dans la même orientation. B) Les organes internes ont été enlevés de l'embryon en A. La colonne vertébrale, les côtes et les DRG sont vus. Pour plus de simplicité, une nervure est marqué, trois DRG représentatifs sont identifiés par des cercles noirs et la colonne vertébrale thoracique et lombaire est marqué. C) l'image même de poussin d'embryons B avec une boîte grise identification de la région montré à higson agrandissement dans D. D) de grossissement supérieur de la région lombaire de la colonne vertébrale (VC). Trois des onze DRG dans cette vue sont identifiés par des cercles en pointillés. DRG sont ronds et encapsulé. Ces caractéristiques le rendent facile à obtenir DRG intactes avec une pince. E) Un embryon de poussin après prélèvement d'organes internes et la moitié ventrale de la colonne vertébrale thoracique. Boîte grise indique région montré à un grossissement supérieur à F. F) de la moelle épinière (SC) est vu dans la région où la colonne vertébrale a été enlevée. Vers le bas de l'image, de la colonne vertébrale lombaire (VC) est encore intacte. 3 10 DRG sont identifiés par des cercles en pointillés. DRG se trouvent entre chaque ensemble de nervures.
Figure 2 neurones sensoriels primaires de culture immuno-pour NCAM et β1 intégrines. Neurones DRG Chick cultivées sur des concentrations élevées de la laminine-1 sont immunopositif pour NCAM (A) et β1 intégrine (B). C) image fusionnée de deux taches révèle la plupart des cellules sont positives pour les deux NCAM et β1 intégrines. Ces neurones sensoriels aviaires sont immunopositif pour ces deux marqueurs. Cependant, il s'agit d'une cellule, marqués par un astérisque qui est NCAM intégrine négatif et β1 positif, conforme à une cellule non neuronale. DF) d'un grossissement supérieur d'un neurone sensoriel de culture montre les neurites s'étendant du corps de la cellule. D) encastrée dans blanc boîte montre un plus fort grossissement de cône de croissance à la pointe d'un neurites.
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Discussion
Nous présentons ici des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture dissociés neurones sensoriels d'un embryon de poulet. Cette procédure génère une population enrichie de neurones croissance robuste in vitro 7,8,10,16. De nombreuses techniques moléculaires et cellulaires peuvent être appliqués à ces neurones en culture, y compris l'immunocytochimie, qui est décrit ici. Ce protocole a été récemment utilisée pour évaluer quantitativement l'intensité des intégrines activées immunomarquées dans les cônes de croissance sensorielles 8,16. Dans ces études antérieures, un logiciel a été utilisé pour créer un contour de façon précise l'extrémité distale de 20 microns du cône de croissance. Le plan a été faite sur la base NCAM coloration. L'expression ubiquitaire dans les neurones de la NCAM activer le logiciel afin d'identifier l'ensemble de cône de croissance plutôt que d'une partie limitée du cône de croissance. Ce contour du cône de croissance a ensuite été identifié comme étant une région d'intérêt et l'intensité de coloration au sein de l'intégrine qui ne trichesur l'intérêt a été évaluée par le logiciel. De cette manière, l'intensité d'une protéine d'intérêt peut être facilement mesurée dans une région spécifique à l'intérieur des neurones sensoriels en culture.
Pour obtenir des résultats fiables, les recommandations suivantes sont fournies. Tout d'abord, veiller à ce que les lamelles sont bien lavés à l'eau après HCl incubation dans les étapes 1.4 à 1.6. Sinon, des molécules telles que la laminine-1 ne se disperseront pas bien sur la lamelle. Deuxièmement, vérifiez que les DRG sont dissociés de manière adéquate (étape 3.5) après digestion par la trypsine, sinon des amas de cellules se formeront et cela va diminuer la pureté neuronale. Troisièmement, il est optimal pour incuber les cellules de DRG à l'étape 3.9 pour un 3 heures pleine d'obtenir une population pure de neurones. Si cette étape d'incubation est raccourcie, puis diminuer rinçage étapes 5.1 et 5.2 de limiter le nombre de cellules non neuronales qui sont délogées après un temps d'incubation plus courte. Quatrièmement, en sorte que la tension de surface est maintenue lors de l'application de la laminine-1 et dissoneurones ciés aux lamelles. Si la tension de surface est perdue, la solution s'étendra au-delà de la lamelle et sec. Cela tuera les neurones. Cinquièmement, la densité cellulaire optimale doit être déterminée par chaque chercheur. Des études antérieures ont plaqué neurones 120,00 / ml et 40 000 ml / neurones sur des lamelles revêtues de 1 ug / ml de laminine-1 et 20 pg / ml de laminine-1, respectivement 8,16. Cette concentration était suffisamment faible pour permettre aux enquêteurs d'étudier gratuitement terminaisons axonales (les terminaisons qui n'avaient pas encore attaché à un autre neurone). Sixièmement, pendant immunocytochimie, être certain de rincer délicatement les cellules. Retrait ou appliquer des solutions trop rapidement peut déloger les neurones de la lamelle.
Les limites de cette procédure comprennent la fenêtre de temps assez limité de poussin DRG dissection. DRG peut facilement être obtenu à partir de jour embryonnaire (E) 7-10 embryons de poulet. Bien qu'il soit possible d'obtenir des DRG tôt que E7, il est quelque peu difficile. Après E11, plus de cartilage transitions à l'os et cela rend la dissection plus difficile. Ainsi, les études visant à comparer embryonnaire par rapport neurones adultes ne seraient pas idéal pour ce modèle de poussin, cependant, des études antérieures ont utilisé le modèle de rat pour la comparaison de l'âge dans les DRG 32. Il est à noter que DRG de rat dissection est plus cher, moins robuste et techniquement plus difficile que poussin. Un autre point à considérer est la capacité des neurones de DRG embryonnaires cultivées à changer au fil du temps dans la culture. Par exemple, ces neurones sensoriels expriment différents niveaux de récepteurs dans les 48 heures en fonction de la présence de sélectionner des neurotrophines 2,30.
Deux sous-classes de neurones DRG peuvent être enrichis par l'utilisation des neurotrophines sélectifs dans les médias 2,12,30. Par exemple, le facteur de croissance des nerfs (NGF) et la neurotrophine-3 (NT3) soutiennent principalement la survie des neurones, respectivement 33 cutanées et proprioceptives. Les médias utilisés dans cette expérience a à la fois NGF et NT3Cependant, cela peut être facilement modifié pour sélectionner soit pour les neurones sensoriels cutanés ou proprioceptives.
Neurones dissociés se prêtent à de nombreuses techniques d'imagerie en temps réel, y compris timelapse imagination de la motilité du cône de croissance et l'imagerie du calcium. Le support utilisé ici est avantageux pour l'imagerie des cellules vivantes, car il ne nécessite pas de CO 2 pour effet tampon de pH du milieu. Ainsi, l'acquisition de données à partir de cellules vivantes peut être effectuée sur un microscope avec un stade chauffé mais ne nécessite aucun entretien de CO 2 des niveaux adéquats. Les niveaux de croissance de la vitesse de cône, effondrement 8,16,30, et de calcium 17 ont été étudiées en chiches primaire neurones sensoriels vivantes isolées par la technique décrite ici. En outre, l'ARNi peut réussir à diminuer les niveaux de protéines dans les neurones DRG chiches cultivés 34.
Les enseignements tirés de bien défini dans les modèles in vitro peuvent être utilisés comme un fondement essentiel de concevoir des expériencesdans un modèle in vivo plus complexe. Ainsi, différentes approches ont été utilisées dans le laboratoire d'argent de 35 pour stimuler la croissance axonale dans un modèle in vitro de la cicatrice gliale. Parmi la variété de réactifs testés in vitro, seulement deux (inflammation induction et la digestion des protéoglycanes de sulfate de chondroïtine) pourraient favoriser la régénération des axones. Fait intéressant, une combinaison de ces deux traitements in vivo stimulé dramatique et fonctionnelle régénération axonale dans la moelle épinière 35. Dans ce cas, les expériences in vitro ont donné un outil important de dépister rapidement des réactifs qui ont augmenté la croissance axonale. Les réactifs qui ont promu avec succès la croissance des axones in vitro a également été couronnés de succès in vivo, qui supporte en outre la valeur des expériences de culture cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Alison Philbrook, Belinda Barbagallo et Michael Francis des commentaires perspicaces sur ce document. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par une bourse ZONE R15 1R15NS070172-01A1 attribué à MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
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