Summary
מודלים תרבית תאים מספקים שליטה מפורטת על תנאים סביבתיים ובכך מספקים פלטפורמה רבת עוצמה על מנת להבהיר היבטים רבים של ביולוגיה של תא עצבי. אנו מתארים שיטה מהירה, זולה, ואמינה לבודד, לנתק, ותרבות תאי עצב תחושתי מעובר חומוס. פרטים של הכנת המצע וimmunocytochemistry גם מסופקים.
Abstract
הנוירונים הם תאים רב פנים שנושאים מידע חיוני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל תחושה, תנועה מוטורית, למידה, וזיכרון. חקר תאי עצב in vivo יכול להיות מאתגר בשל המורכבות שלהם, הסביבות המגוונות ודינמיות שלהם, ומגבלות טכניות. מסיבות אלה, חקרו תאי עצב במבחנה יכול להוכיח מועיל לפענח את המסתורין המורכב של תאי עצב. הטבע המוגדר היטב של דגמי תרבית תאים מספק שליטה מפורטת על תנאים ומשתנים סביבתיים. כאן אנו מתארים כיצד לבודד, לנתק, ונוירונים עיקרי תרבות מעוברת חומוס. טכניקה זו היא מהירה, זולה, ומייצרת וחסונה גדלה עצב סנסורי. ההליך מייצר באופן עקבי תרבויות שהעשירו מאוד עבור תאי עצב ויש לו מעט מאוד תאים שאינם עצביים (פחות מ -5%). נוירונים עיקרי אינו דבק גם לזכוכית שלא טופלה או מפלסטיק בתרבית רקמה, ולכן נהלים מפורטים ליצירת שתי distinct, מצע המכיל laminin מוגדר היטב לציפוי עצבי מתוארים. נוירונים בתרבית הם נוחים מאוד לטכניקות תאיות ומולקולריות מרובות, כוללים שיתוף immunoprecipitation, דמיון תא חי, RNAi, וimmunocytochemistry. נהלים לimmunocytochemistry כפול על נוירונים בתרבית אלה כבר מותאמים ושתוארו כאן.
Introduction
הנוירונים הם תאים מורכבים שנושאים מידע חיוני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל תחושה, ראייה, תנועה מוטורית, למידה, וזיכרון. ייחודי מסוגי תאים אחרים, תאי עצב להרחיב את התהליכים כמו זרוע, האקסונים נקראים, כדי ליצור כבישים עצביים חיוניים לתקשורת. במהלך תאי פיתוח מתמחה ממוקמים בקצוות של אקסונים הגובר, נקרא קונוסים צמיחה, לנווט קונצרט של רמזים תאיים להוביל את האקסון ליעד המתאים. המנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס ניווט חרוט צמיחה אינם מובנים במלואם. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים האלה, חוקרים השתמשו במודלי תרבית תאים ללמוד הנוירונים בסביבה חוץ גופית מוגדרת ופשוטה ב. הנוירונים לומדים בתרבות 1 הוביל להתקדמות משמעותית בהבנה שלנו של ביולוגיה של תא העצבי ובם: הבחנה עצבית 2, דינמיקת cytoskeletal, אנדוציטוזה וסחר, דנדריטתקנה 3,4, התחדשות axonal 5, ומצבים קליניים כגון מחלות עצבים 6. בנוסף, נוירונים בתרבית הם נוחים מאוד למגוון רחב של טכניקות מחקר כוללים immunocytochemistry, שיתוף immunoprecipitation פני תא, כתם מערבי, transfection, RNAi, והדמיה לחיות כגון ניתוח timelapse של תנועתיות החרוט צמיחה. לפיכך, culturing נוירונים עיקרי הוא גישה רבת עוצמה כדי להבהיר היבטים רבים של הביולוגיה של התא של תאי עצב.
מודל תרבית תאים מספק לחוקרים עם שליטה מפורטת על תנאים ומשתנים סביבתיים. לדוגמא, ניתן להשפיע המצע שעליו נוירונים הם מצופים (ולגדול על) בקלות. כאן, אנו מספקים הוראות מפורטות ליצירת שני מצע ברור, אחד עם ריכוז laminin-1 נמוך והשני עם להרוות ריכוזים של laminin-1. באופן מפתיע, ריכוזים שונים של אותה המולקולה יכולים להיות השפעה דרמטיתעל המצב הפנימי של תאי עצב, כמו גם את רכב פני השטח של תאים שלהם. לדוגמא, רמות תאיות של רמות cAMP ופני השטח של integrins שונות באופן משמעותי בתאי עצב מצופים על שני 7,8 substrata אלה. מחקרים נוספים הראו כי מולקולות אחרות, ובכלל זה proteoglycans פיברונקטין וכונדרואיטין סולפט, השפעת הביטוי של מולקולות פני השטח של תא ותנועתיות עצביות 7-11. בנוסף, מולקולות מסיסה כגון neurotrophins וneurotropins גם להשפיע הרכב קרום תא ותנועתיות עצביות 12-16 והוא יכול להיות בקלות ובאופן מדויק מניפולציות במודל תרבית תאים.
כאן, אנו מתארים שיטות לבודד ותרבות מנותקת עצב סנסורי מעובר חומוס. הליך זה נעשה שימוש כדי להפוך את פריצות דרך משמעותיות בנוירוביולוגיה, ובכלל זה תולדת האקסון 5,7,8,10,11,16-21 והיה שונה מהליך שנועד לבודד את תאי הגנגליון 22. ישמספר יתרונות לגישה זו. ראשית, תכונות רבות של גנגליון שורש הגבי חומוס פיתוח (DRG) הם גם מתאפיינים כוללים מסגרת הזמן ללידה, הארכת האקסון, וביטוי חלבון פרופילי 2,23-28, ובכך לספק בסיס מאלף שעליו לבנות אינפורמטיבי בניסויי מבחנה. שנית, ניתק תרבויות עצביות מאפשרות לחוקר ללמוד באופן ישיר יותר נוירונים בהשוואה לגישות חלופיות באמצעות explants שלם DRG (המכיל תאי עצב ותאים שאינם עצביים) ו / או תרבויות מעורבות המכיל גם תאי עצב ניתק ותאים שאינם עצביים. שלישית, ההליך המתואר כאן הוא פשוט, זול ונוח לסטודנטים לתואר ראשון. לכן, טכניקה זו יכולה לשמש למחקר, כמו גם למטרות הוראה. יתר על כן, שינויים קלים של פרוטוקול זה צריכים לאפשר טיהור תשואה גבוהה במהירות, של נוירונים ממקורות אחרים מאשר DRGs. לדוגמא, בהליך זה יכול להיות שונה כדי לספק neuronally enrתרבויות iched מרקמות אחרות כגון מוח קדמי עוברי או בחוט השדרה.
פרוטוקולי Immunocytochemistry כבר מותאמים לתרבויות עצביות ניתק אלה ומתוארים בפירוט כאן. הליך immunocytochemistry הכפול נגד מולקולה עצבית הידבקות תא (NCAM) וintegrins β1 מסופק. הנתונים המופקים משיטות immunocytochemical אלה היו בשימוש כדי לבחון את הדפוסים מרחביים ועוצמתם של מספר מולקולות בנוירונים בתרבית 8,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 Coverslip הכנה: חומצה לשטוף ואופה
- לפחות 2 ימים לפני הנתיחה (שלב 2), מתחיל את השלבים הבאים כדי להכין coverslips. בצע את הצעד לשטוף את החומצה כדי להסיר שמנים וcoverslips לנקות ביסודיות.
- coverslips עומס בבעל פורצלן שאנכי ממקם coverslips ומונע מהם נוגעים זה בזה. לצלול בעל וcoverslips לתוך מיכל היסטולוגיה זכוכית המלא עם 2 חומצה הידרוכלורית M (HCl). לחלופין, אם בעל פורצלן אינו זמין, להפיץ ~ 20 coverslips אופקי כדי לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי זכוכית מ"מ 100 ולצלול coverslips ב2 M HCl.
- מניחים כלי זכוכית (עם coverslips שקוע בחומצה) על שולחן כסא נדנדה במנדף ולאפשר נדנדה עדינה במשך לפחות 5 שעות בטמפרטורת חדר. לחלופין, לשטוף את חומצת coverslips לילה באותם תנאים.
- לשטוף coverslips עם מזוקק H 2 O (DH 2 O) על ידי העברת בעל פורצלן טעוןעם coverslips מ2 M HCl למכל היסטולוגיה נקי זכוכית מלא DH 2 א ' לחלופין, למזוג 2 M HCl מצלחת פטרי זכוכית עם coverslips ולמלא עם DH 2 א '
- לשטוף באמצעות אחסון DH 2 O שוב ומילוי כלי זכוכית עם DH הטרי 2 O. חזור על פעולה עבור הסכום כולל של 3 שוטף מהיר.
- בגין משטר כביסה כבר על ידי החזרת כלי זכוכית (עם coverslips וDH 2 O) על נדנדה. לאפשר לתסיסה עדינה ל10-30 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן, למזוג DH 2 O ולהוסיף dH הטרי 2 O. חזור על פעולה עבור הסכום כולל של לפחות עשר שטיפות. לחלופין, להמשיך כביסה הלילה.
- הנח coverslips נשטף לתנור שחומם מראש ל 350 C °. אם באמצעות בעל פורצלן, להסיר בעל מDH 2 מיכל זכוכית מלא-O ואז למקם את בעל עם coverslips ישירות לתוך הכבשן. אם אתם משתמשים בצלחת פטרי זכוכית, למזוג DH 2 O ולמקם את צלחת הזכוכית עם coverslips לתוך התנורים עםדואר.
- אופים coverslips לפחות חמש שעות או הלילה בשעה 350 ° C.
- לאחר האפייה היא מלאה, להסיר את coverslips מבעל פורצלן עם מלקחיים עדינים ומקום לתוך צלחת פטרי זכוכית 100 מ"מ סטרילי. השאר coverslips שלא הניחו במקור בבעל פורצלן בצלחת פטרי הזכוכית.
2 Chick Dissection ובידוד של DRGs
- הסר פורה, מבוים ביצת אפרוח הלבן ליבורנו מחממה (מוחזק ב37-38.5 ° C עם נדנדה עדינה).
הערה: המחקרים קודמים השתמשו ביום עוברי 7-10 לבידודה של DRGs 2,8,11-13,16. - הנח נבחרה ביצה בזרימה למינרית. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים מזוהמים בזרימה למינרית עם פתרונות וכלים סטריליים. טרום חמים כל הפתרונות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- לפצח את תוכן ביצה ומקום לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ פלסטיק. שימוש במלקחיים סטנדרטיים להעברת עובר למשנהו צלחת פטרי 100 מ"מ.
- הוספת F12HS10 החם (F12 של שינקין, 10 HEPES מ"מ, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 10% בסרום שור עוברי) לצלחת עם פיפטה פסטר כדי לשמור על רקמות רטובות. שימוש במלקחיים כדי למקם עובר על צד הגב שלו (איור 1 א).
- הנח 100 פלסטיק מ"מ צלחת פטרי המכילה רקמות עוברי על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. השתמש במלקחיים בסדר לעשות חתך קו האמצע אנכי מזנב לצוואר על ידי צובט את הדרמיס הפיתוח כדי לחשוף את הלב, ריאות ואיברים אחרים. לחלופין, לעשות סדרה של דמעות קטנות לחשוף איברים פנימיים.
- בעדינות להשתמש 2 סטים של מלקחיים עדינים סטריליים ל:) לתפוס את הצוואר וב) לתפוס את אב העורקים או רקמות אחרות באופן מיידי מעולים ללב ולמשוך לכיוון הזנב,מוציא את קרביה של בעלי החיים.
- החל F12HS10 החם עם פיפטה פסטר לרקמות. שימוש במלקחיים כדי להסיר כל לב וכלי דם, איברי נשימה או עיכול שנותרו לחשוף את צלעות פיתוח, עמוד השדרה וDRGs (איורים 1 ב-1D).
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר עוד איברים ולאסוף DRGs לאורך שני צידי עמוד השדרה המותני, נחותה לצלעות. לאסוף DRGs על ידי מריטת DRGs שלם מן העובר. לצבוט ולנתק את השורשים המגיעים מDRG לכיוון חוט השדרה ולתפוס את עצב הפיתוח שמגיע מDRG לכיוון הפריפריה או להיפך.
- הנח DRGs שלם לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ מלא בF12HS10 החם. הסר את כל רקמה עודפת, כגון גב או שורשי הגחון שאולי דבק DRGs, מDRGs שלם ב35 צלחת מ"מ על ידי צובט עם מלקחיים בסדר.
- כדי להשיג DRGs העדיף על האזור המותני, להסיר את מחצית הגחון של בית החזה וCerviעמוד השדרה קלוריות. הדבר נעשה על ידי ביצוע חתך בעמוד השדרה מתפתח בניצב לציר חוט השדרה באזור העליון של צוואר הרחם ולבצע קיצוץ נוסף באזור המותני העליון. לאחר מכן, לבצע חתכים במקביל לציר חוט השדרה לאורך הצד הימני ושמאלי של עמוד השדרה. הרם את מחצית הגחון של עמוד השדרה מן העובר, החושף את חושף את חוט השדרה (איורים 1 ה-1F).
- כדי לאפשר גישה קלה לDRGs, להסיר את חוט השדרה ובית חזה צוואר רחם ידי אחיזה בחוט השדרה עם מלקחיים בסדר. השתמש במלקחיים כדי להרים את חוט השדרה מעמוד השדרה. כקירוב, חוט השדרה החזי הוא ברמה של צלעות ובאזור צוואר הרחם הוא מעולה לצלעות.
- לאסוף חזה שלם וDRGs צוואר הרחם עם מלקחיים עדינים ומניח אותם בF12HS10 החם עם DRGs אחר. הסרת רקמה עודפת שעלולות לדבוק DRGs.
- יש לשטוף את הפנים של פיפטה פסטר זכוכית חדשה עם F12HS10 כדי לעזורלמנוע DRGs מלהידבק לקירות של פיפטה. השתמש בפיפטה שטפה להעביר את כל DRGs וF12HS10 מצלחת פטרי קטנה לצינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי ומייד המשך לשלב 3.
יכולים להיות גזורים עוברים נוספים כדי להגדיל את מספר DRGs: הערה. DRGs צריך להישמר בF12HS10 על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לצעד 3.
.3 דיסוציאציה, העשרת, וCulturing DRG נוירונים - חלק 1
- צינור חרוטי מקום עם DRGs ללא פגע לצנטריפוגות ובעדינות הספין (200 XG) במשך 2-3 דקות. ודא שDRGs שקע לתחתית צינור. אם לא, ספין שוב.
- בעזרת פיפטה, להסיר בעדינות F12HS10, עוזב גלולה DRG באין מפריע. הוסף 2 מ"ל של 1x סידן ומגנזיום חינם (CMF) PBS, פירוק גלולה של DRGs. ספין שוב ולהסיר CMF PBS תוך השארת גלולה DRG בשלמותה. חזור על שלב זה לשטוף עבור הסכום כולל של שלושה שוטף כדי להסיר סרום שור עוברי בF12HS10, שיפריע לעיכול טריפסין בשלב הבא.
- הוסף 2 מ"ל של טריפסין חימם לצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל CMF PBS וDRGs. צינור מקום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ל10-15 דקות לעכל DRGs לתאים ניתקו.
- במהלך דגירה, להפוך את תקשורת F12H + תוסף המכיל (F12 של שינקין, 10 100 יחידות / פניצילין HEPES מ"מ מ"ל, 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 10 ng / ml NT3, 10 ng / NGF מ"ל, L-גלוטמין 200 מ"מ וN2) וחם ב37 ° C אמבט מים. בדרך כלל, 10 מ"ל של תקשורת הכוללת הוא מספיק ל4-5 35 מנות מ"מ של עצב סנסורי עיקרי. גם להתחיל laminin-1 ההפשרה לcoverslips ציפוי (שלב 4).
- DRGs העדינות triturate בפתרון טריפסין עם פיפטה p1000 ובודק להיעדרות של DRGs שלם. המשך טחינה דקה עד DRGs שלם כבר לא נראה על ידי העין ו / או לאפשר לדגירת טריפסין יותר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד DRGs שלם הם ניתקו. כדי להגן על תאי עצב DRG מנזק, למנוע בועות אוויר בטחינה דקה ולהגביל עיכול טריפסין ל< 30 דקות.
- Centrifugצינור דואר המכיל DRGs ניתק וטריפסין ב XG 200 ל3-5 דקות כדי ליצור גלולה. ספין כבר במידת הצורך עד גלולה נוצר.
- בזהירות לשאוב טריפסין מבלי להפריע גלולה. הוסף 2 מ"ל של F12HS10 לגלולה. בעדינות triturate DRGs עם קצה פיפטה p1000.
- להעביר את כל התכנים מצינור חרוטי 15 מ"ל ל100 צלחת תרבות מ"מ. יש לשטוף את הצינור עם F12HS10 8 מ"ל ולהעביר אותו למנת התרבות, 2 מ"ל בכל פעם בסכום כולל של 10 מ"ל. צעד שטיפה זה עוזר לאסוף תאים שאולי נשארו דבקו בקירות של הצינור.
- הנח 100 צלחת תרבות מ"מ (עם 10 מ"ל F12HS10 וניתק תאי DRG) ל37 מעלות צלזיוס חממת humidified ל3 שעות.
הערה: CO 2 אינה נדרשת בחממה בגלל HEPES אוגרים pH תקשורת בהעדר CO 2. במהלך דגירה, תאי גלייה להיקשר למשטח פלסטיק בתרבית רקמה ותאי עצב נוטים לדבוק במיטת גליה באופן רופף.
.4 ציפוי מולבןוהאפוי Coverslips עם Laminin-1
- להפשיר aliquots סטרילי של laminin-1 הקפוא בקרח.
- בתנאים סטריליים, להוסיף 1 מ"ל של סטרילית 1x PBS ל50 aliquot μl של laminin-1.
- השתמש ספקטרופוטומטר להשיג ערך הספיגה של laminin-1 ב280 ננומטר. השתמש בערך זה במשוואה הבאה כדי לקבוע את הריכוז של laminin-1.
ABS 280 = (מ"ג ריכוז / מ"ל) * (מקדם הכחדה של חלבון)
מקדם ההכחדה לlaminin-1 הוא 0.86.
- בתנאים סטריליים, לדלל laminin-1 עם 1X PBS כדי להשיג את ריכוזי 1 מ"ג / מ"ל ו20 מ"ג / מ"ל. השתמש בשני ריכוזים מיושמים אלה של laminin-1 כדי להשיג הבדל של פי עשרה מחייב coverslip (30 ng / 2 סנטימטר ו300 ng / 2 סנטימטר, בהתאמה) לאחר הדגירה 7,8,10 laminin-1.
- בזרימה למינרית, להשתמש במלקחיים עדינים למקום ג אחד חומצה שטף ואפויoverslip לתוך החלק התחתון של צלחת תרבות 35 מ"מ אחד. חזור על צורך להשיג את מספר המנות הדרושות.
- נושא coverslips לאור UV של 20-30 דקות כדי להבטיח עיקור נוסף. שמור את מכסה צלחת במהלך שלב זה.
- הוספת 400 μl של laminin-1 מוכן לכל coverslip זכוכית. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ laminin-1 על מנת להבטיח כיסוי מלא של coverslip. מתח פנים יאפשר laminin-1 להישאר על coverslip ולא התפשט אל תחתית צלחת התרבות, אשר נדרש.
- מניחים את המכסה על גבי צלחת ולאפשר laminin-1 כדי לדגור על 2-3 שעות בטמפרטורת חדר (3 שעות היא אופטימליות).
- לאחר הדגירה laminin-1, לשטוף coverslips באמצעות טכניקת ספטית עם PBS סטרילי בזרימה למינרית. הסר פתרון על coverslip ולהוסיף 400 μl של PBS. חכה 5-10 דקות. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 3 שטיפות.
- השאר PBS על coverslip לאחר השטיפה האחרונה. אל תשברו את מתח פנים במהלך שטיפה ואינו מאפשר coverslips להתייבש. Leמכסה ave בעד מוכן לצלחת ניתק נוירונים על coverlip.
.5 דיסוציאציה, העשרת, וCulturing DRG נוירונים - חלק 2
- לאחר דגירה, להשתמש פיפטה סטרילית 10 מ"ל לשטוף את תחתית צלחת 100 מ"מ המכילה תאי DRG ניתקו בעדינות. להחזיק צלחת ב ~ 45 ° זווית, למשוך ~ 7 מ"ל של F12HS10 עם סיוע פיפטה, אז בעדינות לגרש 7 מ"ל על בערך 1/3 צלחת. חזור על 5x, בעדינות פירוק תאי עצב.
- לסובב צלחת וחוזר על שטיפת הליך, לעוד שש שטיפות, על 1/3 אחר של המנה. חזור על הליך שוב לנותר 1/3 של מנה. בדרך זו, בעדינות לשטוף את כל תחתית הצלחת עם F12HS10 כדי להסיר תאי עצב.
- תוך שימוש באותו פיפטה, להעביר נוירונים F12HS10 המכיל מ100 צלחת מ"מ ל15 צינור חרוטי. צנטריפוגה ל5-10 דקות ב200 גרם לגלולת תאים.
- הסר F12HS10, עוזב גלולה באין מפריע. גלולה גלולה עם 2 מ"ל של F12H + תוספים חימם.
- לדלל תאים לפי צורך עם תוספי F12H + לקבל ריכוז ציפוי רצוי (120,000 תאים / מ"ל לcoverslips מצופה בתאים / מ"ל laminin-1 ו 40,000 / מ"ל 1 מיקרוגרם לcoverslips מצופה ב20 מיקרוגרם / מ"ל laminin-1 8,16).
- הסר PBS מcoverslips מצופה laminin ומניח מייד 400 μl של תאים על coverslips. להעביר בזהירות צלחת לתרבות תא חממת humidified, 37 C °. לאפשר לדגירה של שעה לפחות 1 ועד 3 שעות כדי לאפשר לתאי עצב לדבוק laminin-1.
- בתנאים סטריליים, בעדינות להציף 35 מ"מ מאכלים המכילים נוירונים עם 1.6 מ"ל של F12H + תוספים.
הערה: בשלב זה, על פני השטח את המתח על coverslip יכול להיות שבור. הנוירונים כראוי דבקו laminin-1 על coverslip. - חזור תאי חממת דגירה הלילה. לבצע ניסויים כגון immunocytochemistry למחרת.
.6 אניmmunocytochemistry
- לפני immunocytochemistry, פתרון חם מקבע (paraformaldehyde 4%, סוכרוז 30% 2X PBS) ב37 ° C אמבט מים.
הערה: לפני תיקון תאים, טיפול בחומרים כימיים שונים, כגון netrin-1, Mn 2 +, סוניק קיפוד, semaphorin, וephrin 16,29-31. - לאט לאט להסיר 1 מ"ל של 2 מ"ל של F12H + תוספים מצלחת התרבות. בעדינות להוסיף 1 מ"ל של תמיסה מקבע חיממה. לאפשר לדגירה בטמפרטורת חדר למשך 10-15 דקות.
- מוציא בזהירות פתרון מקבע ולהוסיף 2 מ"ל PBS. החל פתרון לכיוון הקצה של צלחת, הימנעות דחיקה אפשרית של תאים קבועים עקב יישום של PBS. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- חזור על לשטוף PBS עבור הסכום כולל של 5 שטיפות. אל תאפשר לתאים לייבוש בכל צעד של immunocytochemistry.
- הסר PBS. החל 1 מ"ל של תמיסת חסימה (0.1% Triton-X, 1X PBS, 5% עזים בסרום נורמלי). דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. לחלופין, להכתים מולקולות פני השטח, אל תשתמשו Triton-X בחסימת פתרון 8.
- לדלל נוגדנים ראשוניים לפתרון חסימה להמלצתו של הייצור. השתמש 1: 500 לנוגדנים נגד NCAM והופעל β1 integrins 16. הסר פתרון חסימה, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת נוגדן ראשונית ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C..
- הסר פתרון נוגדן ראשוני ולהוסיף 2 מ"ל של 1X PBS. דגירה של 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 4 שוטף PBS. ניתן להאריך שוטף, במידת הצורך.
- לדלל נוגדנים משני 1: 1,000 בחסימת פתרון. הסר PBS, להוסיף 1 מ"ל פתרון נוגדנים משני ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
הערה: נוגדנים משניים הם רגישים לאור. שמור פתרונות ותאים בחושך ככל האפשר מרגע זה והלאה. - הסר פתרון נוגדנים משני ולשטוף 5x עם 1x PBS, כפי שנעשה בעבר.
- החל ~ 60-80 μl של FluoromountG לשקופית מיקרוסקופ. באמצעות מלקחיים עדינים, בעדינות להרים coverslip מהצלחת וcoverslip התחתון לFluoromount G על שקופיות מיקרוסקופ. הימנע מבועות אוויר.
- חנות מחליקה במאוזן על 4 מעלות צלזיוס בחושך. אחרי 12-24 לשעה, Fluormount G יהיה פלמר וcoverslip יהיה מחובר היטב לשקופית מיקרוסקופ. תאי תמונה אחרי צעד פילמור זה הוא מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרי תרבות אוכלוסייה מועשרת של עצב סנסורי עוברי ניתק עם מעט מאוד תאים (לדוגמא, <5%) שאינם עצביים 7,8,10,16. ניתן להשיג DRGs רב מlumbosacral, בית החזה ואזורי צוואר רחם. בהתאם לצרכים של החוקר, DRGs מאזורים אנטומיים שונים אלה יכולים להיות מבודדים בקלות. לדוגמא, איור 1 מציג תמונות של עובר אפרוח דרך שלבים שונים של נתיחה עם DRGs המותני מודגש ב1C דמויות ו1D וDRGs בית החזה ב1E דמויות ו1F.
תאים בתרבית מסומנים בקלות על ידי immunocytochemistry. כאן, תאים בתרבית immunostained עם נוגדנים כנגד integrin β1 וNCAM (איור 2). באופן מפתיע, אנו כבר יכולים לדמיין מכתים ניאון לעד שנה אחרי אלה נהלי ICC, אם השקופיות הוחזקו אופקית על 4 מעלות צלזיוס ובחושך. עם זאת, תוחלת החיים של כתמי ICC צריכה להיקבע על ידי משתמש ולנוגדן.
בהתאם לצפיפות של תאי עצב, קונוסים צמיחה בטיפים של neurites הארכה יכולים גם להיות דמיינו (איורים 2 ד-2F). הנוירונים מצופים ב40,000 ו120,000 תאים / מ"ל על coverslips מצופה ב20 מיקרוגרם / מ"ל ו1 מיקרוגרם / מ"ל של laminin-1, בהתאמה, יש לי neurites חופשית רבות עד להודעה ציפוי 26 שעה. תרבויות אלה יכולים לשמש לניתוח ספציפי קונוסים צמיחה בנוסף לניתוח כולו נוירון. בעבר, הליך זה נעשה שימוש כדי להעריך צמיחת מהירות קונוס והתנהגויות, כגון קריסת חרוט צמיחת 8,9,11,13,16. צפיפויות ציפוי נמוכות יותר בתוצאות coverslips אלה בתאי עצב מתים, כי הם לא פעלו בהתאם למצע. הצפיפות המתאימה המדויקת נחוצה לכל ניסוי צריכה להיות מותאמת לכל חוקר.
s = "jove_content" FO: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
.1 שלבי איור של נתיחת חומוס עוברית להשיג DRGs. עובר) אפרוח שוכבים על צד הגב שלה. הלב (H), כנפיים (W) וברגליים (L) מסומנים. החלק העליון של התמונה הוא לכיוון הראש, או מעולה (S). התחתון של התמונה הוא לכיוון הזנב, או נחותים (I). R = צד ימין של בעלי חיים, L = צד שמאל של בעלי חיים. כל התמונות שלאחר מכן נמצאות באותו כיוון. B) האיברים הפנימיים הוסרו מן העובר בא עמוד השדרה, צלעות וDRGs נראים. לשם פשטות, צלעות אחד שכותרתו, שלושה DRGs נציג מזוהה על ידי עיגולים שחורים ובית החזה ועמוד השדרה המותני מסומן. C) תמונה עובר אפרוח זהה B עם תיבה אפורה זיהוי האזור שמוצג על גדולהגדלתה בד D) הגדלה גבוהה של אזור המותני עמוד השדרה (VC). שלושה מDRGs עשר בתצוגה זו מזוהות על ידי חוגים מקווקוים. DRGs עגול וכמוס. תכונות אלו הופכות אותו קלה להשיג DRGs שלם עם מלקחיים. עוברים אפרוח לאחר הסרת האיברים פנימיים ומחצית הגחון של עמוד השדרה החזי E). תיבה אפורה מציינת אזור שמוצג בהגדלה גבוהה יותר בפ F) בחוט השדרה (SC) נראית באזור שבו עמוד השדרה הוסר. כיוון החלק התחתון של התמונה, העמודה מותני בחוליות (VC) היא עדיין שלמה. 3 10 DRGs מזוהה על ידי חוגים מקווקוים. DRGs נמצא בין כל סט של צלעות.
איור 2 עצב סנסורי עיקרי מתורבת immunolabeled לNCintegrins AM וβ1. נוירונים האפרוח DRG בתרבית על ריכוזים גבוהים של laminin-1 הוא immunopositive לNCAM (א) ו integrin β1 (B). C) תמונה ממוזגת של שני כתמים מגלה רוב התאים הם חיוביים עבור שניהם NCAM וintegrin β1. עצב סנסורי עופות אלה הם immunopositive עבור שניהם של סמנים אלה. עם זאת, יש תא, מסומן על ידי כוכבית שהיא integrin השלילי וβ1 NCAM חיובי, עולה בקנה אחד עם סוג תאים לא עצבי. הגדלה גבוהה של נוירון החושי תרבותי DF) תערוכות neurites המשתרעת מהגוף התא. D) הבלעה בלבן תיבת תערוכות הגדלה גבוהה יותר של חרוט צמיחה בקצה neurite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד וניתק culturing עצב סנסורי מעובר אפרוח. הליך זה יוצר אוכלוסייה מועשרת של הנוירונים גדלו וחסונה במבחנה 7,8,10,16. ניתן ליישם טכניקות תאיות ומולקולריות רבות לנוירונים בתרבית אלה, כוללים immunocytochemistry, אשר מתואר כאן. פרוטוקול זה היה בשימוש לאחרונה על מנת להעריך את עוצמת immunolabeled integrins מופעל בקונוסים צמיחה חושיים 8,16 כמותית. במחקרים הקודמים אלה, תוכנה נעשה שימוש כדי ליצור קווי המתאר של 20 מיקרון הקצה הדיסטלי של חרוט הצמיחה במדויק. המתווה נעשתה על בסיס צביעת NCAM. הביטוי בכל מקום של NCAM בתאי עצב אפשר לתוכנה לזהות חרוט הצמיחה כל ולא חלק מוגבל של חרוט הצמיחה. מתווה חרוט צמיחה זו ולאחר מכן זוהתה כאזור של עניין ואת עוצמת כתמי integrin בתוך regi שבעניין הוערך על ידי התוכנה. באופן זה, בעוצמה של חלבון של עניין ניתן למדוד בקלות באזור מסוים בתוך תאי עצב תחושתיים בתרבית.
על מנת לקבל תוצאות אמינות, ההמלצות הבאות מסופקות. ראשית, להבטיח כי coverslips נשטפים היטב עם מים לאחר הדגירה HCl בצעדי 1.4-1.6. אחרת, מולקולות כגון laminin-1 לא לפזר גם על coverslip. שנית, לוודא שDRGs הם כראוי ניתק (שלב 3.5) לאחר עיכול טריפסין, אחרת גושים של תאים יהוו וזה יקטין טוהר עצבי. שלישית, זה הוא אופטימלי לדגירת תאי DRG בשלב 3.9 לשעה 3 מלאה להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי עצב. אם שלב דגירה זה מתקצר, ואז להקטין את שטיפת מדרגות 5.1 ו5.2 להגביל את מספר התאים שאינם עצביים החלצו לאחר זמן דגירה קצר יותר. רביעית, להבטיח נטען, כי מתח פנים תוך יישום laminin-1 וdissoנוירונים ciated לcoverslips. אם מתח פנים הולכים לאיבוד, הפתרון יהיה להרחיב מעבר coverslip והיבש. זה יהרוג את תאי העצב. חמישי, צפיפות תאים אופטימלית צריכה להיקבע על ידי כל חוקר. מחקרים קודמים מצופים 120,00 מ"ל נוירונים / ו40,000 / נוירונים מ"ל על coverslips מצופה ב1 מיקרוגרם laminin-1 / מ"ל ו20 מיקרוגרם laminin-1 / מ"ל, בהתאמה 8,16. ריכוז זה היה נמוך מספיק כדי לאפשר לחוקרים ללמוד סופים האקסון חופשיים (קצוות שעדיין לא מחוברים עם נוירון אחר). שישית, במהלך immunocytochemistry, להיות בטוח כדי לשטוף בעדינות תאים. הסרה או יישום פתרונות במהירות רבה מדי יכול לעקור נוירונים מcoverslip.
מגבלות של הליך זה כוללים חלון הזמן במידה מסוימת המוגבל של נתיחת DRG חומוס. בקלות ניתן להשיג DRGs מיום עוברי (E) 7-10 עובר חומוס. למרות שניתן להשיג DRGs מוקדם יותר מאשר E7, זה מאתגר למדי. לאחר E11, יותר סחוס טרנסitions לעצם וזה הופך את הנתיחה קשה יותר. כך, מחקרים שמטרתם להשוות עוברי לעומת תאי עצב בוגרים לא יהיו אידיאליים עבור דגם אפרוח זה, עם זאת, מחקרים קודמים השתמשו במודל החולדה להשוואת גיל בDRGs 32. יש לציין כי לנתיחה DRG החולדה היא יקרה יותר, פחות חזקה וטכנית מאתגרת יותר מחומוס. נקודה נוספת שיש לשקול היא היכולת של הנוירונים DRG עובריים בתרבית כדי לשנות לאורך זמן בתרבות. לדוגמא, תאי עצב התחושתיים אלה מבטאים רמות של קולטני שונות בתוך 48 שעות בהתאם לנוכחות של neurotrophins בחר 2,30.
שתי subclasses של נוירונים DRG יכולה להיות מועשרת על ידי שימוש בneurotrophins סלקטיבית בתקשורת 2,12,30. לדוגמא, גורם הגדילה עצבית (NGF) וneurotrophin-3 (NT3) תומכים בעיקר ההישרדות של תאי עצב עורית והפרופריוצפטיבית, בהתאמה 33. יש התקשורת המשמשת בניסוי זה הן NGF וNT3, עם זאת, זה ניתן לשנות בקלות כדי לבחור עבור כל אחת עצב סנסורי עורית או הפרופריוצפטיבית.
נוירונים ניתקו נוחות לטכניקות הדמיה חיה רבות, כולל דמיון timelapse של תנועתיות חרוט צמיחה והדמיה סידן. התקשורת המשמשת כאן היא יתרון עבור הדמיה תא חי, כי היא אינה דורשת CO 2 לחציצת pH של התקשורת. לפיכך, רכישת נתונים מתאי חיים יכולה להתבצע על מיקרוסקופ עם במה חיממה אך אינו דורשת תחזוקה של רמות 2 CO נאותים. רמות צמיחת מהירות קונוס, קריסת 8,16,30, וסידן 17 נחקרו בתאי עצב חיים חומוס העיקרי חושיים שבודדו על ידי הטכניקה שתוארה כאן. בנוסף, RNAi יכול להקטין בהצלחה רמות חלבון בתאי עצב DRG חומוס תרבותי 34.
תובנה מ- מוגדר היטב במודלים חוץ גופית יכולות לשמש כבסיס חיוני לעיצוב ניסוייםבמודל מורכב יותר in vivo. לדוגמא, גישות שונות שמשו במעבדה הכסף 35 כדי לעורר תולדת האקסון במודל במבחנה של צלקת גליה. של מגוון רחב של חומרים כימיים נבדקו במבחנה, רק שתיים (אינדוקציה דלקת ועיכול של proteoglycans כונדרואיטין סולפט) יכולים לטפח התחדשות האקסון. מעניין, שילוב של שני טיפולים אלה in vivo מגורה התחדשות האקסון דרמטי ופונקציונלית לתוך חוט השדרה 35. במקרה זה, בניסויים במבחנה סיפקו כלי חשוב לסינון במהירות לחומרים כימיים שעלו תולדת האקסון. ריאגנטים שקדמו בהצלחה צמיחת האקסון במבחנה גם הוכיחו מוצלחים in vivo, שעוד תומך הערך של ניסויי תרבית תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לאליסון Philbrook, בלינדה Barbagallo ומייקל פרנסיס להערות תובנה על נייר זה. המחקר המדווח בפרסום זה נתמכה על ידי הפרס R15 AREA 1R15NS070172-01A1 הוענק לMLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
