ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Summary

細胞培養モデルは、環境条件を詳細に制御を提供し、したがって、神経細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なプラットフォームを提供します。私たちは、隔離解離、およびニワトリ胚の培養感覚ニューロンために、迅速な安価で、かつ信頼性の高い方法を記載する。基質の調製および免疫細胞化学の詳細も提供される。

Abstract

ニューロンは、感覚、運動、移動、学習、およびメモリを含むさまざまな機能のために重要な情報を運ぶ多面細胞である。 生体内で神経細胞を研究することは、それらの複雑さ、彼らの多様かつ動的な環境、そして技術的な限界に挑戦することができます。これらの理由により、in vitroでニューロンを研究することは神経細胞の複雑な謎を解明することが有益で証明することができます。細胞培養モデルの明確に定義された性質は、環境条件および変数を詳細に制御を提供する。ここでは、隔離解離、およびニワトリ胚由来の培養一次ニューロンする方法について説明します。この技術は、迅速で安価であり、ロバスト感覚ニューロンを成長生成する。手順は、一貫して非常に神経細胞について濃縮された培養物を生成し、非常に少数の非神経細胞（5％未満）を有している。一次ニューロンは、したがって詳細な手順二つディスタンを作成するために、未処理のガラスまたは組織培養プラスチックによく接着しないCT、ニューロンのメッキ用の、明確に定義されたラミニン含有基質が記載されている。培養したニューロンは、共免疫沈降、生細胞想像、RNAiを、および免疫細胞化学を含む複数の細胞および分子技術、に非常に適している。これらの培養神経細胞をダブル免疫細胞化学のための手順は、最適化されており、ここに記載されている。

Introduction

ニューロンは、感覚、視覚、運動運動、学習、およびメモリを含む、さまざまな機能に不可欠な情報を伝達する複雑な細胞である。他の細胞型からのユニークな、ニューロンは、通信のための不可欠な神経の高速道路を形成するために、軸索と呼ばれる、アーム状のプロセスを拡張します。成長円錐と呼ばれる成長の軸索の先端に位置して開発専門のコンパートメント、中、その適切な宛先に軸索をリードして、細胞外手がかりのコンサートをナビゲート。成長円錐ナビゲーションの根底にある複雑な分子メカニズムは完全には理解されていない。より良いこれらのメカニズムを理解するために、研究者らは、in vitro環境で定義され、簡略化のニューロンを研究するための細胞培養モデルを使用している。神経分化^2、細胞骨格のダイナミクス、エンドサイトーシスおよび人身売買、デンドライト：文化¹に留学ニューロンは、ニューロンを含む細胞生物学の理解において大きな進歩をもたらしたレギュレーション^3,4、軸索再生^5、そのような神経障害⁶などの臨床症状。加えて、培養神経細胞は、成長円錐の運動性のタイムラプス分析などの免疫細胞化学、細胞表面共免疫沈降、ウエスタンブロット、トランスフェクション、RNAiは、ライブイメージングを含む、研究技術の広い範囲に非常に適している。このように、一次ニューロンを培養したニューロンの細胞生物学の多くの側面を解明するための強力なアプローチである。

細胞培養モデルは、環境条件や変数を詳細に制御した研究者を提供しています。例えば、ニューロンがメッキ（および上に成長）された基質は、容易に操作することができる。ここでは、二つの異なる基質、低ラミニン-1濃度が1およびラミニン-1の飽和濃度で他を生成するための詳細な手順を提供する。驚くべきことに、同じ分子の異なる濃度は、劇的な効果を持つことができ内部のニューロンの状態だけでなく、それらの細胞表面組成に。例えば、インテグリンのcAMPおよび表面レベルの細胞内レベルは、これらの2つの基層^7,8上にめっきニューロンが有意に異なっている。追加の研究は、フィブロネクチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む他の分子は、細胞表面分子の発現および神経運動性^7-11に影響^を与えることが示されている。また、このようなニューロトロフィンおよびニューロトロピン等の水溶性分子はまた、細胞膜の組成および神経運動性^12-16に影響^を及ぼし、容易かつ正確に細胞培養モデルで操作することができる。

ここでは、単離するための方法が記載されているし、培養ニワトリ胚から感覚ニューロンを解離さ。この手順は、軸索伸長^{5,7,8,10,11,16-21}含む神経生物学における重要なブレークスルーを製造するために使用されており、神経節細胞^22を分離するように設計された手順を改変した。ありこの手法にはいくつかの利点。まず、ひよこ後根神経節（DRG）の開発の多くの機能はよく出産、軸索伸長のための時間枠を含む特徴とし、タンパク質発現は、このように試験管内実験で有益構築するための有益な基礎を提供し^{、2,23-28プロファイル} 。第二に、神経細胞培養は研究者がより直接的に（神経細胞および非神経細胞を含む）は、無傷のDRG外植片および/または解離神経細胞および非神経細胞の両方を含む混合培養を用いて別のアプローチと比較して、神経細胞を研究することを可能に解離。第三に、ここで説明する手順は、簡単で安価で学部生に適している。したがって、この技術は、研究ならびに教育目的のために使用することができる。さらに、このプロトコルのマイナーバリエーションはDRGを以外のソースからのニューロンの速い、高収率の精製を可能にする必要があります。例えば、この手順はneuronally ENRを提供するために修正することができるそのような胚前脳や脊髄などの他の組織からの文化をiched。

免疫細胞化学プロトコールは、これらの解離ニューロン培養のために最適化されており、ここでは詳細に記載されている。神経細胞接着分子（NCAM）及びβ1インテグリンに対する二重免疫細胞化学のための手順が提供される。これらの免疫細胞化学的方法から生成されたデータは、培養ニューロン^8,16のいくつかの分子の空間パターニングおよび強度を調べるために使用されてきた。

Protocol

1。カバースリップの準備：アシッドウォッシュと焼く

1. 解剖（ステップ2）の前に少なくとも2日間、カバーガラスを準備するには、次の手順を開始します。オイル、徹底的にきれいなカバースリップを除去するための酸洗浄ステップを実行します。
2. 縦にカバースリップを配置して互いに接触するのを防ぐ磁器ホルダーに用紙をカバースリップ。 2 M塩酸（HCl）を充填したガラス組織学容器にホルダとカバースリップを沈める。磁器ホルダーが使用できない場合あるいは、広がっ〜20カバーガラスを水平方向に100mmのガラス製ペトリ皿の底をカバーし、2 M HCl中でカバースリップを水没する。
3. ドラフト内でロッカー·テーブル上の（酸中に沈めカバースリップで）ガラス容器を置き、室温で少なくとも5時間、穏やかに振動を可能にする。あるいは、酸洗浄は、同じ条件下で一晩カバースリップ。
4. 洗浄は、ロードされた磁器ホルダーを転送することにより、蒸留H ₂ O（のdH ₂ O）を用いてカバースリップのdH ₂ Oで満たされた清浄なガラス組織学コンテナに2MのHClからのカバーガラスと代わりに、カバーガラスとガラスペトリ皿から2MのHClをデカントとDH ₂ Oで補充
5. 再びのdH ₂ Oをデカントし、新鮮なのdH ₂ Oでガラス容器を再充填することによって洗浄する3迅速な洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
6. ロッカーの上に（カバーガラスとのdH ₂ Oで）ガラス容器を返すことによって、より長い洗浄レジメンを開始します。室温で10〜30分間、穏やかに撹拌を可能にします。その後、のdH ₂ Oをデカントし、新鮮なのdH ₂ Oを追加少なくとも10回の洗浄の合計のため繰り返します。別の方法として、一晩洗浄を続ける。
7. 350℃に予熱した炉に洗浄し、カバースリップを置きます。磁器ホルダーを使用している場合、のdH ₂ Oを充填したガラス容器からホルダーを削除して、直接、炉内にカバースリップでホルダーを配置します。ガラスシャーレを使用している場合、のdH ₂ Oをデカントし、furnacにカバーガラスをガラス皿に置くメール。
8. 焼くは350℃で少なくとも5時間、または一晩カバースリップ。
9. ベーキングが完了した後、細かい鉗子で磁器ホルダーからカバースリップを除去し、無菌の100mmのガラスシャーレに入れます。もともとガラスシャーレに磁器ホルダーに入れていなかったカバースリップのままにしておきます。

2チック解剖とのDRGの単離

1. 肥沃外し、（緩やかに揺り動かしながら37から38.5℃に維持）インキュベーターから白色レグホンひよこの卵を上演した。
   注：これまでの研究では、DRGを単離するための胎生7-10を使用している^{2,8,11-13,16。}
2. 層流フード内の選択された卵を置きます。滅菌溶液や楽器との層流フード内で無菌条件下で下記のすべての手順を実施する。 37℃の水浴中で前加温すべての溶液。
3. プラスチック100ミリメートルペトリ皿に卵と場所の内容をクラック。別の100ミリメートルのペトリ皿に胚を転送するために、標準的な鉗子を使用してください。
4. ウェットティッシュを維持するために、パスツールピペットを用いて皿暖かいF12HS10（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清）を加える。その背側（ 図1A）に胚を配置するために鉗子を使用してください。
5. 層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む100ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿を置きます。心臓、肺および他の器官を露出させるために開発し、真皮をつまんで首に尾からの垂直正中切開を作るために細かい鉗子を使用してください。別の方法として、内臓を露出させ、小さな涙のシリーズを作る。
6. 、a）の首をつかみ、b）は、心臓のすぐ優れた大動脈または他の組織をつかみ、尾の方に引っ張る：静かに滅菌細かい鉗子の2セットを使用する動物を骨抜き。
7. 組織へのパスツールピペットを用いて、暖かいF12HS10を適用します。発展途上リブ、脊柱とDRGを（ 図1B-1D）を露出するために、残りの心血管系、呼吸器や消化器官を取り除くために鉗子を使用してください。
8. 解剖顕微鏡下で、さらに内臓を除去し、肋骨に劣る腰椎脊柱の両側に沿ってのDRGを収集するために細かい鉗子を使用しています。胚から無傷のDRGを摘採によってDRGにを収集します。ピンチと脊髄に向かってDRGからのアクセスと周辺部、あるいはその逆に向かって、DRGから届く発展途上の神経をつかん根を断つ。
9. 温かいF12HS10で満たされた35mm培養皿に、無傷のDRGを置きます。このような微細な鉗子でつまんで35mm皿にそのままのDRGから、DRGをに付着している可能性があり、背側または腹側根のような余分な組織を取り除きます。
10. 腰部よりも優れたDRGを取得するには、胸部の腹側半分を削除し、チェルビCAL脊柱。これは、上頸部と上腰部内の別カットにおける脊髄軸に垂直な発展脊柱にカットすることによって行われます。その後、カットは右と脊柱の左側に沿って脊髄軸に平行にする。が公開に脊髄（ 図1E-1F）を公開し、胚から脊柱の腹側半分を持ち上げます。
11. DRGをへの容易なアクセスを許可するには、細かい鉗子で脊髄をつかんで胸部および頸髄を削除します。脊柱から脊髄を持ち上げるために鉗子を使用してください。近似​​として、胸髄は、リブのレベルにあり、頸部がリブよりも優れている。
12. 細かい鉗子で無傷の胸部および子宮頸部のDRGを収集し、他のDRGを暖かくF12HS10に配置します。 DRGをに付着する余分な組織を取り除きます。
13. 助けるためにF12HS10で新しいガラスパスツールピペットの内部をすすぐピペットの壁に付着するのを防ぐのDRG。無菌15ミリリットルコニカルチューブに小さなペトリ皿からすべてのDRGとF12HS10を転送し、すぐにステップ3に進むことすすいでピペットを使用してください。
    注：追加の胚のDRGの数を増やすこと解剖することができる。 DRGを、ステップ3の準備が整うまで、37℃でF12HS10に保管してください。

3解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート1

1. 無傷のDRGを持つ場所コニカルチューブ遠心機に、静かに2〜3分間（200×gで）をスピン。 DRGをチューブの底に沈んできたことを確認します。いない場合は、再度スピン。
2. ピペットを用いて、静かに邪魔されずにDRGペレットを残し、F12HS10を削除します。のDRGのペレットを追い出し、1倍、カルシウムとマグネシウムを含まない（CMF）2mlのPBSを追加します。再びスピン無傷DRGペレットを残しながら、CMF PBSを削除します。次のステップでトリプシン消化を妨害するF12HS10におけるウシ胎児血清を除去し、合計3回の洗浄のためのこの洗浄ステップを繰り返します。
3. 2ミリリットルCMFのPBSとのDRGを含む15mlチューブに温め2mlのトリプシンを追加します。解離した細胞へのDRGを消化するために10〜15分間37℃の水浴中に置きチューブ。
4. インキュベーションの間、F12H +サプリメントを含む培地を加える（ハムF12、10mMのHEPES、100単位/ mlのペニシリン、0.1 mg / mlのストレプトマイシン、10ng / mlのNT3、10ng / mlのNGF、200mMのL-グルタミン及びN2）と暖かい37℃の水浴中。典型的には、総培地の10mlを、一次感覚ニューロンの4-5 35mm皿で十分である。また、コーティングカバースリップ（ステップ4）のためにラミニン-1の解凍を開始します。
5. 静かに粉薬のDRG P1000ピペットでトリプシン溶液中で、視覚的に無傷のDRGがないことを点検します。無傷のDRGは、もはや目で見られるまで粉砕してを続けていない、および/または無傷のDRGが解離されるまで、37℃の水浴中に長いトリプシンインキュベーションを可能にします。損傷からDRGニューロンを保護するために、粉砕して中に気泡を回避し、<30分にトリプシン消化を制限する。
6. Centrifug解離したDRGを含有するペレットを形成するために、3〜5分間200×gでトリプシンの電子管。ペレットが形成されるまで、必要に応じてより長いスピン。
7. 慎重にペレットを中断することなく、トリプシンを吸引。ペレット化しF12HS10の2ミリリットルを追加。静かにP1000のピペットチップでのDRGを粉砕する。
8. 100mm培養皿に15ミリリットルコニカルチューブからすべての内容を転送します。 10ミリリットルの合計時に8ミリリットルF12HS10でチューブをすすぎ、培養皿に転送、2ミリリットル。このすすぎ工程は、管の壁に付着して残っている可能性があり、細胞を収集するのに役立ちます。
9. 3時間加湿した37℃のインキュベーター内に（10ミリリットルF12HS10とし、DRG細胞を解離さ）100mmの培養皿を置きます。
   NOTE：HEPESは、CO ₂の不在下で培地のpHを緩衝するため、CO _{2インキュベーター}中で必要とされない。インキュベーションの間、グリア細胞は、組織培養プラスチックの表面に結合し、ニューロンが緩くグリア床に付着する傾向がある。

4。コーティングアシッドウォッシュラミニン-1とし、焼きカバースリップ

1. 氷上で凍結したラミニン-1の無菌アリコートを解凍する。
2. 無菌条件下では、ラミニン-1の50μlアリコートに無菌×PBS中の1ミリリットルを加える。
3. 280nmでラミニン-1の吸光度の値を取得するために、分光光度計を使用してください。ラミニン-1の濃度を測定するために、以下の式でこの値を使用します。

ABS ₂₈₀ =（濃度mg / mlで）*（タンパク質の吸光係数）
ラミニン-1の吸光係数は0.86である。

4. 無菌条件下で、1 mg / mlのおよび20 mg / mlの濃度を得るために1X PBSでラミニン-1を希釈する。これら二つのインキュベーション^7,8,10後にカバースリップ（それぞれ30 ngの/ cm ²であり、300 ngの/ cm ^2の ）と結合したラミニン-1の10倍の差を達成するために、ラミニン-1の濃度を適用使用してください。
5. 層流フードでは、一方の酸洗浄及び焼きCを配置する微細なピンセットを使用し1 35mm培養皿の底にoverslip。必要な食器の数を得るために必要に応じて繰り返します。
6. さらに滅菌を確実にするために20〜30分間UV光にカバースリップを施す。このステップの間に皿のふたをオフにしてください。
7. 各ガラスカバースリップに準備されたラミニン-1の400を添加する。カバースリップの完全なカバレッジを確保するために、ラミニン-1を広めるためにピペットチップを使用してください。表面張力は、ラミニン-1がカバースリップ上に残り、必要とされる培養皿の底に広げないようにすることができます。
8. 皿の上に蓋を置き、ラミニン-1は、室温で2〜3時間インキュベートすることができます（3時間が最適である）。
9. ラミニン-1インキュベーション後、層流フード内で無菌PBSで無菌技術を使用してカバースリップをすすぐ。カバースリップ上で溶液を除去し、PBS400μlのを追加します。 5〜10分待ちます。 3回のすすぎの合計に対して、この手順を繰り返します。
10. 最後のすすぎの後にカバースリップ上で、PBSのままにしておきます。すすぎ時の表面張力を壊さないでください。また、カバーガラスを乾燥させないでください。レcoverlipに解離したニューロンをめっきする直前まで、上のaveの蓋。

5。解離、豊か、そして培養DRGニューロン - パート2

1. インキュベーション後、穏やかに解離したDRG細胞を含有する100mm皿の底をすすぎ、10 mlの滅菌ピペットを使用する。 〜45°の角度で皿を持ち、静かに、約3分の1皿の上に7ミリリットルを追放、その後、ピペット補助によりF12HS10の〜7ミリリットルを引っ張る。優しくニューロンを追い出し、5回繰り返します。
2. 皿を回転させ、皿の別の3分の1に、別の6回のすすぎのために、手順をすすぐ繰り返します。皿の3分の1を、残りのために再度手順を繰り返します。このように、優しくニューロンを除去するためにF12HS10と皿の底面全体をすすぎ。
3. 同じピペットを用いて、15​​の円錐管に100mmディッシュからF12HS10含有ニューロンを転送します。細胞をペレットに200グラムで5〜10分間遠心。
4. 邪魔されずにペレットを残し、F12HS10を削除します。温めF12H +サプリメントの2ミリリットルでペレットを再懸濁する。
5. 所望のめっき濃度（1μg/ mlのラミニン-1および20μg/ mlラミニン-1 ^8,16で被覆されたカバースリップのために40,000細胞/ mlのコーティングされたカバースリップ用12万細胞/ ml）を得F12H +サプリメントと同様に、必要な細胞を希釈する。
6. ラミニン被覆カバースリップからPBSを取り出し、すぐにカバーガラス上の細胞の400μlのを置く。慎重に加湿し、37℃の細胞培養インキュベーターに皿に移す。少なくとも1時間インキュベートし、最大3時間まで神経細胞がラミニン-1に準拠することを可能にすることを許可する。
7. 無菌条件下では、優しくF12H +サプリメントの1.6ミリリットルでニューロンを含む35mm皿にあふれる。
   注：この時点では、カバーガラス上で表面張力が破壊することができる。ニューロンは十分にカバースリップ上ラミニン1に付着した。
8. インキュベーターで一晩インキュベートした細胞を返します。次の日に免疫細胞化学などの実験を行う。

6。私はmmunocytochemistry

1. 免疫細胞化学の前に、37℃の水浴中に温かい固定溶液（4％パラホルムアルデヒド、30％のスクロース2X PBS）。
   注：細胞を固定する前に、そのようなネトリン-1はMn ^{2 +、}ソニックヘッジホッグ、セマフォリンおよびエフリン^16,29-31などの各種試薬で処理する。
2. ゆっくり培養皿からF12H +サプリメントの2ミリリットルの1ミリリットルを削除します。優しく暖め固定剤溶液1mlを加える。 10〜15分間室温でインキュベートすることを許可する。
3. 慎重に固定溶液を除去し、2mlのPBSを追加。 PBS等の適用開始による固定された細胞の可能性脱落を回避すること、皿の縁に向かって解決策を適用します。 5分間室温でインキュベートする。
4. 5回の洗浄の合計PBS洗浄を繰り返します。細胞は免疫細胞のいずれかのステップの間に乾燥させないでください。
5. PBSを除去します。ブロッキング溶液を1ml（0.1％トリトン-X、1X PBS、5％正常ヤギ血清）を適用する。室温で1時間インキュベートする。あるいは、表面分子を染色する、液^{8ブロッキング}トリトン-Xを使用しないでください。
6. 製造者の推奨に従って、ブロッキング溶液に一次抗体を希釈します。 NCAM活性化β1インテグリン¹⁶に対する抗体500：1を使用してください。ブロッキング溶液を除去し、一次抗体溶液1mlを添加して、室温で1時間インキュベートするか、4℃で一晩。
7. 一次抗体溶液を除去し、1×PBS 2 mlを加える。室温で5〜10分間インキュベートする。 4回のPBS洗浄の合計のため繰り返します。必要に応じて洗浄は、拡張することができます。
8. ブロッキング溶液中1,000：二次抗体1に希釈する。 PBSを取り外し、1ミリリットルの二次抗体溶液を追加し、室温で1時間インキュベートする。
   注：二次抗体は光に敏感である。これ以降、なるべく暗所にソリューションや細胞を保管してください。
9. 二次抗体溶液を除去し、以前に行ったように、1×PBSで5回すすいでください。
10. Fluoromountの〜60-80μlの適用顕微鏡スライド上にG。細かい鉗子を使用して、静かに顕微鏡スライド上Fluoromount Gに皿と下カバースリップからカバースリップを持ち上げます。空気の泡を避けてください。
11. Storeは暗闇の中で、4℃で水平にスライドする。 12〜24時間後、Fluormount Gが重合するとカバーガラスをしっかり顕微鏡スライドに添付されます。画像セルこの重合工程が完了した後。

Representative Results

ここで説明するプロトコルは、文化に非常に少ない（ 例えば 、<5％）非神経細胞^7,8,10,16と解離胚性感覚ニューロンの濃縮集団を研究者を可能にします。多数のDRGを腰仙部、胸部および頸部から得ることができる。治験責任医師の必要に応じて、これらの異なる解剖学的領域からのDRGを容易に単離することができる。たとえば、 図1は、図1Cおよび1Dおよび図1Eおよび1Fでの胸部のDRGで強調表示腰椎DRGを持つ解剖のさまざまな段階を経てニワトリ胚の画像を示す。

培養細胞を簡単に免疫細胞化学によって標識されている。ここでは、培養した細胞は、β1インテグリンおよびNCAM（ 図2）に対する抗体で免疫染色されている。驚くべきことに、私たちはこれらの後に最長1年間の蛍光染色を視覚化することができましたICC手順、スライドを4℃、暗所で水平に保持した場合。しかし、ICCの汚れの寿命は、ユーザーによっておよび抗体ごとに決定する必要がある。

ニューロンの密度に依存して延びる突起の先端の成長円錐はまた、（ 図2D-2F）可視化することができる。ニューロンは、20μg/ mlのラミニン-1それぞれ1μg/ mlのをコーティングしたスライドガラス上で40,00012万細胞/ mlで播種し、26時間後にメッキまで数多くの自由神経突起を持っている。これらの培養物を特異的に全体ニューロンの分析に加えて、成長円錐を分析するために使用することができる。以前は、この手順は、成長円錐の崩壊^8,9,11,13,16として成長円錐速度や行動を評価するために使用されている。基層に接着されていない死者ニューロンにおけるこれらのカバースリップの結果についての下部メッキ密度。各実験について必要とされる正確な適切な密度は、研究者ごとに最適化する必要がある。

ニワトリ胚の解剖の図1ステージはDRGをとした。A）ニワトリ胚をその背側に位置する。心臓（H）は、翼（W）及び脚（L）が標識されている。画像の上部には頭部、または優れた（S）に向かっている。画像の下部には、尾に向かっているか、または劣った（I）。動物のR =右側、動物のL =左側。後続のすべての画像は同じ方向にある。B）内臓脊柱、肋骨およびDRGをが見られているAに胚から削除されています。簡単にするために、一つのリブが標識され、3つの代表的DRGを黒丸で識別され、胸椎および腰椎脊柱が標識されている。C）同ニワトリ胚画像をBとして、領域を識別するグレーのボックスでHIGに示すD. D中の彼女の倍率）腰椎脊柱（VC）領域の高倍率。このビューの11のDRGの3つは破線の円で識別されます。 DRGを丸く封入される。これらの機能は、鉗子。E）内臓および胸部脊柱の腹側半分を除去した後のニワトリ胚を無傷のDRGを得ることが容易になります。グレーボックスは脊柱が除去された場合、脊髄（SC）は地域に見られる）、F、Fでの高倍率で示した領域を示している。画像の下の方に、腰椎脊柱（VC）が無傷のままである。 10のDRGの3は、破線の円で識別されます。 DRGをリブの各セット間で見出される。

図2：培養し、一次感覚ニューロンのNCについて免疫AMおよびβ1インテグリン。ラミニン-1の高濃度の上で培養ニワトリDRGニューロンは、NCAM（A）とβ1インテグリン（B）に対して免疫である。C）は 、2つの汚れの合成画像は、ほとんどの細胞がNCAM、β1インテグリンの両方に陽性である明らかにしている。これらの鳥類の感覚ニューロンは、これらのマーカーの両方のための免疫陽性である。しかし、細胞がNCAMが負、β1インテグリン陽性の、非神経細胞と一致しているアスタリスクが付き、そこにある。DFは）培養された感覚神経の高倍率は、細胞体から伸びる神経突起を示しています。D）インセット白ボックスには、神経突起の先端の成長円錐の高倍率を示している。

Discussion

ここでは、単離するための詳細なプロトコールを提示し、培養ニワトリ胚からの感覚ニューロンを解離さ。この手順では、in vitro ^7,8,10,16 におけるロバスト成長ニューロンの濃縮集団を生成します。多数の細胞および分子技術がここに記述されている免疫細胞を含む、これらの培養ニューロンに適用することができる。このプロトコルは、最近、定量的感覚成長円錐^8,16で免疫標識し、活性化インテグリンの強度を評価した。これらの以前の研究では、ソフトウェアプログラムを正確に成長円錐の遠位端20ミクロンのアウトラインを作成するために使用された。概要はNCAM染色に基づいて行った。神経細胞におけるNCAMの遍在的な発現は、全成長円錐ではなく、成長円錐の限られた部分を識別するためのソフトウェアプログラムを使用可能。この成長円錐の輪郭がそのレジ内の関心領域及びインテグリン染色強度として同定された関心のあるソフトウェアによって評価した。このようにして、目的のタンパク質の強度を容易に培養感覚ニューロン内の特定の領域で測定することができる。

信頼できる結果を得るために、以下の推奨が提供される。まず、カバーガラスがよくステップ1.4〜1.6中のHClのインキュベーション後に水で洗浄していることを確認します。そうでなければ、そのようなラミニン-1のような分子は、カバーガラス上で良好に分散しません。第二に、それ以外の細胞の塊が形成し、これは神経細胞の純度を低下させる、DRGを十分トリプシン消化後（ステップ3.5）解離していることを確認します。第三に、神経細胞の純粋な集団を得るためにフル3時間ステップ3.9におけるDRG細胞をインキュベートすることが最適である。このインキュベーション工程が短縮されている場合は、より短いインキュベーション時間の後に取り除かれている非神経細胞の数を制限するステップ5.1および5.2をすすぎ減少させる。ラミニン-1とdissoを印加しながら第四に、その表面張力が維持されていることを確認カバースリップにciatedニューロン。表面張力が失われた場合、溶液をカバースリップおよび乾燥を越えて延びる。これは、ニューロンを殺すでしょう。第五に、最適な細胞密度は、各治験責任医師によって決定される必要がある。これまでの研究では、120,00ニューロン/ mlおよびそれぞれ1μg/ mlのラミニン-1および20μg/ mlラミニン^-1、8,16で被覆したカバーガラス上4万ニューロン/ mlにメッキしている。この濃度は、研究者が自由な軸索終末（さらに別のニューロンと接続されていなかった結末）を研究することを可能にするのに十分に低いものであった。第六に、免疫細胞の間に、静かに細胞を洗浄するようにしてください。取り外しまたはカバースリップからのニューロンを取り除くことができますあまりにも早く解決策を適用する。

この手順の制限事項ヒヨコのDRG解剖のやや制限された時間ウィンドウが含まれています。 DRGを容易に胎生（E）7-10ニワトリ胚から得ることができる。それはE7より前のDRGを得ることが可能であるが、それは幾分困難である。 E11の後、より多くの軟骨のトランス骨へitions、これは解剖をより困難にする。従って、成体ニューロンに対する胚と比較することを目指した研究がこのひよこモデルのための理想的ではないだろう、しかし、以前の研究では、DRGを³²年齢比較のためのラットモデルを使用しています。これは、ラットDRG切開が少なく強固な、より高価でヒヨコよりも技術的に困難であることに留意すべきである。考慮すべきもう一つのポイントは、培養中の時間の経過とともに変化するために培養された胚性DRGニューロンの能力である。例えば、これらの感覚ニューロンは、選択ニューロトロフィン^2,30の存在に依存して48時間以内の受容体の異なるレベルで発現する。

DRGニューロンの2つのサブクラスは、メディア^2,12,30における選択的ニューロトロフィンを使用することによって濃縮することができる。例えば、神経成長因子（NGF）およびニューロトロフィン-3（NT3）は、主に、それぞれ^33、皮膚および固有受容性ニューロンの生存を支持する。この実験で使用した培地は、NGFおよびNT3の両方を有するしかし、これは簡単に皮膚または固有受容感覚ニューロンのいずれかを選択するために修飾することができる。

解離したニューロンは、成長円錐の運動性およびカルシウムイメージングのタイムラプス想像含む多数のライブ画像化技術に適している。それは、メディアのpH緩衝のためにCO _2を必要としないため、ここで使用される培地は、生細胞イメージングのために有利で ​​ある。このように、生きた細胞からのデータ取得を温めステージを顕微鏡で行うことができますが、十分なCO ₂レベルの維持を必要としません。成長円錐速度、崩壊^8,16,30、及びカルシウムレベル^17は、ここで記載された技術により単離ライブ初代ニワトリ感覚ニューロンで研究されている。また、RNAiは、正常培養ニワトリDRGニューロン³⁴中のタンパク質レベルを低下させることができる。

インビトロモデルにおいて明確に定義されたから得られた知見は、実験を設計するための必須の基礎として使用することができより複雑なin vivoモデルにおいて、 例えば 、さまざまなアプローチは、グリア性瘢痕のin vitroモデルにおける軸索伸長を刺激するためにシルバーラボ³⁵において使用した。 インビトロで試験試薬をさまざまな2つだけ （コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの炎症誘導および消化）の軸索再生を促進する可能性があります。興味深いことに、in vivoでのこれらの2つの処理の組み合わせにより、脊髄³⁵内に劇的かつ機能軸索再生を刺激した。この場合には、in vitro実験は、急速に軸索伸長を増加する試薬をスクリーニングするための重要なツールを提供した。正常インビトロでの軸索成長を促進する試薬は、さらなる細胞培養実験の値をサポートする、 インビボでの成功を証明した。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile small culture dishes (35 mm)	Corning	430165
Sterile large culture dishes (100 mm)	Falcon	353003
Sterile large Petri dishes (100 mm)	VWR	89000-302
Glass Petri dish (100 mm)	VWR	D108962
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
Standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
Coverslips (22 x 22 mm)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
Porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media
HCl	VWR	VW3204-1	use at 2 M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl
15 ml Conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
PBS 10x	Gibco	14080	used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM
Penicillin/streptomyocin	Sigma	P0781	use 5 ml in 500 ml of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
L-Glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Normal goat serum	Life technologies	PCN500
Microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated β1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036