Summary
Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.
Abstract
Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5'ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ'nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.
Introduction
Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda nöronların çalışma hücre kültürü modelleri kullandık. Nöronal farklılaşma 2, sitoskeletal dinamikleri, endositoz ve kaçakçılığı, dendrit: kültürü 1 okuyan nöronlar da dahil olmak üzere nöronal hücre biyolojisi anlayışımızda önemli ilerlemelere yol açmıştırdüzenleme 3,4, aksonal rejenerasyon 5, ve bu nöropatiler 6 gibi klinik durumlar. Buna ek olarak, kültürlü nöronlar İmmünositokimya, hücre yüzeyi ko-bağışıklık çökelti Western blot, transfeksiyon, RNAi, ve bu büyüme konisi motilite timelapse analizi de dahil olmak üzere canlı bir görüntüleme araştırma teknikleri geniş bir yüksek ölçüde uygundurlar. Bu nedenle, birincil kültür nöronları Nöronların hücre biyolojisi çok yönlerini açıklamak için güçlü bir yaklaşım.
Hücre kültürü modeli çevresel koşullar ve değişkenler üzerinde ayrıntılı kontrol ile araştırmacılar sağlar. Örneğin, kaplama nöronlar (ve buna uygun olarak büyür) edildiği katmanlarından kolayca manipüle edilebilir. Burada, iki farklı katmanlarından, düşük laminin-1 konsantrasyonu ile bir ve laminin-1 konsantrasyonları doyurarak ile diğer üretmek için ayrıntılı talimatlar sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, aynı molekülün farklı konsantrasyonlarda istenmeyen etkilere sahip olabilirİç nöronların durumu yanı sıra hücre yüzeyi bileşime. Örneğin, integrinler, cAMP ve yüzey düzeyleri hücre içi düzeyleri, bu iki substrat üzerine kaplanır 7,8 nöronlarında önemli ölçüde farklıdır. Daha başka çalışmalarda, fibronektin ve kondroitin sülfat proteoglikan, etki hücre yüzey moleküllerinin ifade edilmesi ve nöronal motilite 7-11 de dahil olmak üzere, bu diğer molekülleri göstermiştir. Buna ek olarak, aynı zamanda, hücre zarı bileşim ve nöronal motilite 12-16 darbe ve kolay ve hassas bir hücre kültürü modeli olarak manipüle olabilir nörotrofin ve neurotropins gibi çözünebilir moleküllerdir.
Burada, biz yöntemleri izole etmek ve kültür civciv embriyoları duyusal nöronlar ayrışmış açıklar. Bu prosedür, akson büyümesinin 5,7,8,10,11,16-21 içeren nörobiyolojisinde önemli gelişmelere yapmak için kullanılmıştır ve gangliyon hücreleri 22 izole etmek için tasarlandı bir prosedürden modifiye edilmiştir. VarBu yaklaşımın birçok avantajları. İlk olarak, civciv sırt kök ganglion (DRG) gelişimi birçok özellikleri iyi doğum, akson uzantısı için zaman çerçevesi de dahil olmak üzere karakterize edilir, ve protein ifadesi böylece in vitro deneylerde bilgilendirici inşa etmek için bir öğretici temel sağlayarak, 2,23-28 profiller. İkinci olarak, nöronal kültürler araştırıcı daha doğrudan ayrışan nöronlar ve nöronal olmayan hücreler her ikisini ihtiva eden (nöronlar ve nöronal-olmayan hücreleri içeren) Bozulmamış DRG eksplantları ve / veya karışık kültürlerinin kullanıldığı alternatif yaklaşımlara kıyasla nöronların çalışma sağlar ayrışmış. Üçüncü olarak, burada açıklanan prosedür, basit, ucuz ve lisans elverişlidir. Bu nedenle, bu teknik araştırma hem de eğitim amaçlı kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol küçük varyasyonlar DRG'ler dışındaki kaynaklardan nöronların hızlı, yüksek verim arınma izin vermelidir. Örneğin, bu prosedür, ENR nöronal olarak temin etmek üzere modifiye edilebilirembriyonik önbeyinde omurilik gibi diğer dokulardan iched kültürler.
İmmünositokimya, bu protokoller ayrışan nöronal kültürler için optimize edilmiştir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) ve β1 integrinler karşı iki İmmünositokimya için prosedür sağlanır. Bu imüno yöntemlerle üretilen veriler kültüre edilmiş nöronlarda 8,16 uzaysal ve model oluşturmanın çok molekül yoğunluğunu incelemek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coverslip Hazırlanışı: Asit Yıkama ve pişirin
- En az 2 gün önce Diseksiyon (aşama 2) için, lamelleri hazırlamak için aşağıdaki adımları başlar. Yağlar ve tamamen temiz lamelleri kaldırmak için asit yıkama aşamasını gerçekleştirir.
- Dikey lamelleri pozisyonları ve birbirlerine dokunmadan onları engelleyen porselen tutucu Yük lamelleri. 2 M hidroklorik asit (HCI) ile dolu bir cam kap içine histoloji tutucu ve lamelleri batırılır. Porselen tutucu mevcut değilse, alternatif olarak, 100 mm cam Petri kabı alt kapağı ve 2 M HCl lamelleri daldırın 20 lamelleri yatay ~ yayıldı.
- Bir çeker ocak içinde külbütör tablasına (asit içinde daldırılmış lamelleri ile) cam kaba yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 5 saat boyunca hafif sallanan sağlar. Alternatif olarak, asitle temizleme, gece boyunca aynı koşullar altında lamelleri.
- Porselen tutucu yüklenen aktarılarak damıtılmış H2O (DH 2 O) ile yıkayın lamelleridH 2 O ile dolu temiz bir cam histoloji kaba 2 M HCI gelen lamelleri ile Alternatif olarak, lamelleri ile cam petri 2 M HCI süzün ve dH 2 O ile doldurun
- Tekrar dH 2 O boşaltılarak ve taze dH 2 O ile cam kap dolum yıkayın 3 hızlı yıkar toplam tekrarlayın.
- Rocker üzerine (lamelleri ile ve dH 2 O) cam kap dönerek uzun yıkama rejimi başlayacaktı. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca hafifçe çalkalanarak izin verme. Sonra, dH 2 O süzün ve taze dH 2 O eklemek En az on yıkama toplam tekrarlayın. Alternatif olarak, bir gecede yıkamaya devam.
- 350 ° C'ye ısıtılmış fırın içine yıkanmıştır lamelleri. Porselen tutucu kullanıyorsanız, dH 2 O-dolu cam kabı tutucusunu çıkarın ve sonra doğrudan fırına lamelleri ile yerleştirmeyiniz. Bir cam Petri kullanıyorsanız, dH 2 O süzün ve sobala içine lamelleri ile cam tabak yerleştirinör.
- En az beş saat veya gece boyunca 350 ° C lamelleri pişirin.
- Pişirme işlemi tamamlandıktan sonra, ince forseps ile porselen tutucudan lamelleri çıkarın ve steril 100 mm ebadındaki bir cam Petri kabı içine yerleştirin. Başlangıçta cam Petri kabındaki porselen tutucuya yerleştirildi değil lamelleri bırakın.
2. Civciv Diseksiyon ve DRG'ler İzolasyonu
- Bereketli Kaldır (hafif hafif sallanarak 37-38,5 ° C'de tutulan) inkübatör Beyaz Livorno civciv yumurta düzenledi.
NOT: Önceki çalışmalarda DRG'ler 2,8,11-13,16 izolasyonu için embriyonik gün 7-10 kullandık. - Laminar akış içinde seçilen yumurta yerleştirin. Steril çözümleri ve araçları ile laminer akış kaputu aseptik koşullarda, aşağıda listelenen tüm işlemleri yürütmek. 37 ° C su banyosunda Pre-sıcak tüm çözümleri.
- Plastik 100 mm Petri kabı içine yumurta ve yer içeriğini çatlak. Başka bir 100 mm Petri kabı embriyo transferi için standart forseps kullanın.
- Sıcak F12HS10 ekleme (Ham'ın F12, 10 mM HEPES, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 cenin sığır serumu, 0.1 mg) ıslak doku tutmak için Pasteur pipeti ile çanak. Sırt tarafında (Şekil 1A) üzerine embriyo konumlandırmak için forseps kullanabilir.
- Laminer akış kaputu bir binoküler stereovision mikroskop üzerine embriyonik doku içeren 100 mm plastik Petri kabı yerleştirin. Kalp, akciğer ve diğer organlara maruz gelişen dermis kısma boyun kuyruk dikey bir orta hat kesi yapmak için ince forseps kullanın. Alternatif olarak, iç organların maruz küçük gözyaşı bir dizi yapmak.
- Yavaşça steril ince forseps 2 set kullanın: a) boyun kavramak ve b) kuyruk doğru kalbe hemen üstün aortu veya diğer doku tutun ve çekin,hayvan iç çıkarma.
- Dokuya Pasteur pipeti ile sıcak F12HS10 uygulanır. Gelişmekte kaburga, omurga kolonu ve DRG'ler (Şekil 1B-1D) maruz kalan kardiyovasküler, solunum veya sindirim organları çıkarmak için forseps kullanın.
- Mikroskop altında, daha kaburga alt lomber vertebral kolon, her iki tarafın birlikte DRG'ler organları kaldırmak ve toplamak için ince forseps kullanabilir. Embriyodan sağlam DRG'ler yolma tarafından DRG'ler toplayın. Kıstırma ve omurilik doğru DRG ulaşmak ve çevre ya da tam tersi doğru DRG ulaşır gelişmekte olan sinir kavrayarak kökleri sahip olamazlar.
- Sıcak F12HS10 dolu bir 35 mm kültür çanak içine bozulmamış DRG'ler yerleştirin. Ince forseps ile sıkıştırarak 35 mm çanak sağlam DRG'ler gelen DRG'ler yapışmış olabilir dorsal veya ventral kökleri gibi, herhangi bir aşırı doku çıkarın.
- Lomber bölgeye üstün DRG'ler elde etmek için, torakal ve Cervi'de ventral yarısında kaldırmakcal omurga. Bu, üst boyun bölgesinde omurilik ekseni ile üst bel bölgesinde bir kesim dik gelişmekte belkemiğinin bir kesim yapılarak yapılır. Sonra, kesik sağ ve vertebral kolonun sol kenarlarında omurilik eksenine paralel hale. Açığa omurilik (Şekil 1E-1F) ortaya embriyo, gelen vertebral kolonun ventral yarısını kaldırın.
- DRG'ler kolay erişim sağlamak için, ince forseps ile omuriliği tutarak torakal ve servikal omurilik çıkarın. Vertebral kolonun üzerinden omurilik kaldırmak için forseps kullanabilir. Bir yaklaşım olarak, göğüs omurilik yivlerin seviyesinde ve servikal alan kaburga üstündür.
- Ince forseps ile sağlam göğüs ve servikal DRG'ler toplayın ve diğer DRG'ler sıcak F12HS10 koyun. DRG'ler yapışabilir aşırı doku çıkarın.
- Yardım etmek F12HS10 ile yeni bir cam Pasteur pipet içini durulayınPipet duvarlarına yapışmasını önlemek DRG'ler. Bir steril 15 ml konik tüp küçük bir petri tüm DRG'ler ve F12HS10 transferi ve hemen 3. adıma geçmek için durulanır pipet kullanın.
NOT: Ek embriyolar DRG'lerin sayısını artırmak için disseke edilebilir. DRG'ler Aşama 3 için hazır olana kadar 37 ° C 'de F12HS10 tutulmalıdır.
3. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 1
- Sağlam DRG'ler santrifüj içine yavaşça yer ile konik tüp 2-3 dakika boyunca (200 xg) dönerler. DRG'ler tüpün dibine battı onaylayın. Aksi takdirde, tekrar dönerler.
- Bir pipet kullanarak, yavaşça rahatsız DRG pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. DRG'lerin pelet yerinden ayrılmasını, 1x kalsiyum ve magnezyum içermeyen (CMF) 2 ml PBS ilave edin. Tekrar Spin ve sağlam DRG pelet bırakarak CMF PBS kaldırmak. , Bir sonraki aşamada bir şekilde tripsin emdirme ile müdahale edecek F12HS10 fetal sığır serumu, çıkarmak için üç kez olmak üzere toplam bu yıkama işlemi tekrar edin.
- 2 mi PBS ve CMF DRG'ler içeren 15 ml'lik bir tüpe ısıtıldı tripsin 2 ml ilave edilir. 10-15 dakika ayrışmış hücrelere DRG'ler sindirmek için 37 ° C su banyosu içinde yer tüpü.
- İnkübasyon sırasında, F12H + ek ihtiva eden ortam yapmak (Ham'ın F12, 10 mM HEPES 100 birim / ml penisilin, 0,1 mg / ml streptomisin 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamin ve N2) ve sıcak 37 ° C su banyosu içinde. Tipik olarak, toplam 10 mL ortam içinde birincil duyu nöronlarının 4-5 olarak 35 mm'lik kaplara için yeterlidir. Ayrıca çözülme laminin-1 kaplama lamelleri (adım 4) için başlar.
- Görsel yavaşça çiğnemek P1000 pipet ile tripsin çözeltisi içinde DRG'ler ve sağlam DRG'ler yokluğu için inceleyin. DRG'ler sağlam artık gözü ile görülebilecek kadar öğütme devam edilmesi ve / veya bozulmamış DRG'ler ayrışmış kadar 37 ° C su banyosu içinde daha fazla tripsin inkübasyon için izin verir. , Hasar DRG nöronları korumak öğütüldükten sırasında hava kabarcıkları önlemek ve <30 dakika tripsin sindirimi sınırlamak için.
- Centrifugayrışmış DRG'ler içeren ve pelet oluşturmak için 3-5 dakika boyunca 200 xg'de tripsin e tüp. Pelet oluşana kadar gerekirse daha uzun Spin.
- Dikkatle pelet bozmadan tripsin aspire. Topak haline F12HS10 2 ml ilave edilir. Yavaşça P1000 pipet ile DRG'ler çiğnemek.
- 100 mm kültür çanak içine 15 ml konik tüp tüm içeriği aktarın. 10 ml'lik bir toplam için her seferinde, 2 ml 8 mi F12HS10 ile tüp durulayın ve kültür tabağına aktarın. Bu durulama aşaması, borunun duvarlarına yapışmış halde olabilir hücreleri toplamak yardımcı olur.
- 100 mm kültür tabağına yerleştirin (10 mi F12HS10 ve DRG hücreleri ayrışmış), 3 saat boyunca nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içine.
NOT: HEPES CO2 yokluğunda ortam pH tamponları, çünkü CO2 inkübatör gerekli değildir. İnkübasyon sırasında, glial hücreler, glial gevşek yatağına yapışarak doku kültürü eğilimi plastik ve nöron yüzeyine bağlanır.
4. Kaplama Asit YıkanmışLaminin-1 ve Fırında Lameller
- Buz üzerinde donmuş laminin-1 steril hacimde çözülme.
- , Steril koşullar altında, laminin-1, 50 ul steril kana 1x PBS 1 ml.
- 280 nm'de, laminin-1 absorbans değerini elde etmek için bir spektrofotometre kullanılır. Laminin-1 konsantrasyonunu belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak, bu değeri kullanın.
ABS 280 (= konsantrasyonu mg / ml) * (protein yok olma katsayısı)
Laminin-1 için yok olma katsayısı 0.86 olduğunu.
- , Steril koşullar altında, 1 mg / ml ve 20 mg / ml konsantrasyonları elde etmek için 1X PBS ile laminin-1 seyreltin. Laminin-1 inkübasyondan sonra 7,8,10 lamel (30 ng / cm2 ve 300 ng / cm2) bağlı bir on kat bir fark elde etmek için, laminin-1 Bu iki tatbik konsantrasyonlarını kullanarak.
- Laminar akış, bir asitle yıkanmış ve pişmiş c yerleştirmek için ince forseps kullanımıBir 35 mm kültür çanak dibine overslip. Gerekli yemekleri sayısını elde etmek için gerektiği kadar tekrarlayın.
- Daha da sterilizasyon sağlamak üzere 20-30 dakika süre ile, UV ışığına maruz lamelleri. Bu aşama esnasında çanak kapağı kapalı tutunuz.
- Her cam lamel hazırlanan laminin-1 400 ul ekleyin. Lamel tam kapsama sağlamak için laminin-1 yaymak için pipet kullanın. Yüzey gerilimi, laminin-1 lamel kalır ve gerektiğinde, kültür kabı, bir alt üzerine yayılmaz sağlayacaktır.
- Tabağa kapağı yerleştirin ve laminin-1, oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle inkübe izin (3 saat uygunudur).
- Laminin-1 inkübasyondan sonra, laminar akış başlığı içinde steril PBS ile aseptik teknik kullanılarak lamelleri yıkayın. Lamel çözüm çıkarın ve PBS 400 ul ekleyin. 5-10 dakika bekleyin. 3 durulama toplam tekrarlayın.
- Son durulama sonra lamel PBS bırakın. Durulama sırasında yüzey gerilimini kırmak etmeyin ve lamelleri kurumasına izin vermeyin. Lehazır olana kadar üzerinde ave kapak coverlip üzerine nöronlar ayrışmış plakasına.
5. Ayrılma, zenginleştirilip, ve Kültürleme DRG Nöronlar - Bölüm 2
- İnkübasyondan sonra, yavaşça ayrışmış DRG hücreleri ihtiva eden 100 mm tabak için alt durulama için 10 ml'lik steril bir pipet kullanın. Sonra yavaşça yaklaşık 1/3 yemeğin üzerine 7 ml sınırdışı ~ pipet yardımı ile F12HS10 7 ml çekin, 45 ° açı ~ de çanak tutun. Yavaşça nöronlar yerinden oynatıp 5x tekrarlayın.
- Çanak döndürün ve yemeğin başka 1/3, başka bir altı durular için, prosedürü durulama tekrarlayın. Yemeğin 1/3 kalan tekrar işlemi tekrarlayın. Bu şekilde, yavaşça çıkarmak için nöronlar F12HS10 ile çanak tüm alt yıkayın.
- Aynı pipet kullanarak, 15 konik tüp 100 mm çanak F12HS10 içeren nöronlar aktarın. Hücrelerin topakçık 200 g'de 5-10 dakika boyunca santrifüj.
- Rahatsız pelet bırakarak F12HS10 çıkarın. Isıtıldı F12H + takviyeleri 2 ml yeniden süspanse pelet.
- İstenen kaplama konsantrasyonu (20 ug / ml laminin-1 ile kaplanmış 8,16 lamelleri boyunca 1 ug / ml laminin-1 ve 40.000 hücre / ml 'si ile kaplanmış lamelleri için 120.000 hücre / ml) elde etmek üzere F12H + takviyeleri ile, gereken hücreleri seyreltin.
- Laminin kaplı lamelleri PBS çıkarın ve hemen lamelleri üzerine hücrelerinin 400 ul yerleştirin. Dikkatle nemlendirilmiş, 37 ° C hücre kültürü inkübatör çanak aktarın. Nöronlar, laminin-1 yapışmasının sağlanması için 3 saat için en az 1 saat süreyle ve en inkübe izin verin.
- , Steril koşullar altında, yavaşça F12H + takviyeleri 1.6 ml nöron içeren 35 mm'lik kaplara sel.
NOT: Bu zamanda, bir örtücü kısım üzerine gerilim kırılabilir alanlar. Nöronlar yeterince lamel laminin-1 yapıştırılır var. - Kuluçka ve gece inkübe hücreleri dönün. Ertesi gün immünsitokimya gibi deneyler yapın.
6. Benmmunocytochemistry
- İmmünositokimya önce, 37 ° C su banyosunda ılık bir sabitleyici çözeltisi (% 4 paraformaldehit,% 30 sukroz 2X PBS).
NOT: hücreleri sabitleme önce, böyle netrin-1, Mn 2, sonik kirpi, semaforin ve efrin 16,29-31 gibi çeşitli reaktifler ile tedavi. - Yavaş yavaş kültürü çanak F12H + takviyeleri 2 ml 1 ml'sini uzaklaştırın. Yavaşça ısıtılmış sabitleştirici çözeltisi 1 ml. 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe izin verin.
- Dikkatle sabitleştirici çözüm kaldırmak ve 2 ml PBS ekleyin. PBS uygulaması nedeniyle sabit hücrelerin olası yerinden oynatmamaya kaçınarak, yemeğin kenarına doğru çözümü uygulayın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 5 yıkama toplam PBS yıkama tekrarlayın. Hücreler immünositokimyada Herhangi bir adım sırasında kurumasına izin vermeyin.
- PBS çıkarın. Bloke etme çözeltisi, 1 ml halinde (% 0.1 Triton-X, 1X PBS,% 5 normal keçi serumu). Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Alternatif olarak, yüzey molekülleri leke, Çözüm 8 engelleme Triton-X kullanmayın.
- Üreticinin tavsiyesine göre çözümü engelleme içine primer antikorları sulandırmak. NCAM karşı antikorlar için 500 ve β1 integrinleri 16 aktif: 1 kullanın. , Bloke çözeltisini çıkarın primer antikor çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir.
- Primer antikor çözüm çıkarın ve 1X PBS 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca inkübe edin. 4 PBS yıkama toplam tekrarlayın. Gerekirse yıkar, uzatılabilir.
- İkincil antikor 1 sulandırmak: 1000 çözümü engelleme. , PBS çıkarın 1 mi ikincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
NOT: İkincil antikorlar ışığa duyarlı bulunmaktadır. Bu noktadan sonra mümkün olduğu kadar karanlıkta çözüm ve hücreleri tutun. - Sekonder antikor çözüm çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi, 1x PBS ile 5x durulayın.
- Fluoromount arasında ~ 60-80 ul uygulayınBir mikroskop lamı üzerine G. Ince forseps kullanarak, yavaşça mikroskop lamı üzerine Fluoromount G içine çanak ve alt lamel üzerinden lamel kaldırın. Hava kabarcıkları kaçının.
- Mağaza karanlıkta 4 ° C'de yatay olarak kayar. 12-24 saat sonra, Fluormount G polimerize edecek ve kapak sıkıca mikroskop lamı eklenir. Bu polimerizasyon basamağından sonra hücreler Resim tamamlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol kültürü için çok az (örneğin, <5%) nöronal olmayan hücrelerin 7,8,10,16 ile ayrışan embriyonik duyu nöronlarının zenginleştirilmiş bir popülasyonu araştırmacılar sağlar. Sayısız DRG'ler lumbosakral, torakal ve servikal bölgelerde elde edilebilir. Araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu farklı anatomik bölgelerden DRG'ler kolaylıkla izole edilebilir. Örneğin, Şekil 1 Şekil 1C ve 1D ve Şekiller 1E ve 1F toraks DRG'lerde vurgulanan lomber DRG'ler ile diseksiyon çeşitli aşamalarında civciv embriyo görüntüleri gösterir.
Kültürlü hücreleri kolayca immünsitokimya tarafından sınıflandırılmıştır. Burada, kültürlü hücreler β1 integrin ve NCAM (Şekil 2) karşı antikorlar ile boyanmış edilir. Şaşırtıcı bir şekilde, bu sonra bir yıl boyunca flüoresan lekelenmesi görselleştirmek mümkün oldumICC prosedürler, slaytlar, 4 ° C'de ve karanlıkta tutuldu yatay olarak ise. Bununla birlikte, ICC lekelerin uzunluğu kullanıcı tarafından ve antikor başına tespit edilmesi gerekmektedir.
Nöronların yoğunluğuna bağlı olarak, dışa doğru uzanan uçları büyüme konileri de (Şekiller 2B-2F) görselleştirilebilir. Nöronlar 20 ug / ml ve laminin-1 ve 1 ug / ml ile kaplanmış lameller üzerinde 40,000 ila 120,000 hücre / ml 'de kaplanmıştır, 26 saat sonrası kaplama kadar çok sayıda serbest nörit sahiptir. Bu kültürler, özellikle bütün nöron analiz ek olarak büyüme konileri analiz etmek için kullanılabilir. Daha önce, bu prosedür büyüme konisi hız ve büyüme koni çöküşü 8,9,11,13,16 gibi davranışları değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Katmanlarından uyulmadığı ölü nöronların bu lamelleri sonuçları Alt kaplama yoğunlukları. Her deney için gerekli olan kesin uygun yoğunluk araştırmacı başına optimize edilmesi gerekmektedir.
Civciv embriyosu diseksiyon Şekil 1. Aşamaları DRG'ler elde etmek için. A) Civciv embriyo, sırt tarafında yalan. Kalp (H), kanatlar (W) ve bacaklar (L) etiketli. Görüntünün üst baş, ya da üstün (S) doğru olduğunu. Görüntünün alt kuyruk veya aşağı (I) doğru olduğunu. R hayvanın = sağ tarafında, L hayvanın = sol tarafında. Tüm sonraki görüntüler iç organları vertebra A sütunundaki embriyo kaldırılmıştır) aynı oryantasyon. B vardır, kaburgaları ve DRG'ler görülür. Basitlik için, bir kaburga etiketli, üç temsilci DRG'ler siyah daireler tarafından tespit edilir ve torakal ve lomber omurga işaretlenmiştir. C) Aynı civciv embriyo görüntüyü B olarak bölgeyi tanımlayan bir gri kutu ile HIG gösterilenD. D onu büyütme) lomber omurga (VC) Bölgenin yüksek büyütme. Bu görünümde onbir DRG'ler üç kesik çevreler tarafından tespit edilir. DRG'ler yuvarlak ve kapsüllü. Bu özellikler forseps. E) iç organları ve Torasik vertebra ventral yarısında çıkarılmasından sonra bir civciv embriyo ile sağlam DRG'ler elde kolaylaştırır. Gri kutu omurga kaldırıldı burada bölgesinde görülmektedir F 'de daha yüksek bir büyütmede) Omurilik (SK) gösterilen bölgeyi gösterir. Görüntünün alt Doğru, lomber omurga (VC) hala bozulmamış. 3 10 DRG'ler kesik çevreler tarafından tespit edilir. DRG'ler kaburga her set arasında bulunur.
Şekil 2. Kültür primer duyusal nöronlar NC immunolabeledAM ve β1 integrinler bulunur. Civciv DRG nöronlarında, laminin-1 yüksek konsantrasyonda kültüre NCAM (A) ve β1 integrin için (B) C). Iki lekelerin birleştirilen görüntü için immünopozitif çoğu hücre NCAM ve β1 hem integrin için pozitif görülmektedir. Bu kuş duyusal nöronlar bu belirteçlerin her ikisi için immünopozitif vardır. Beyaz Ancak, NCAM negatif ve β1 integrin pozitif olmayan bir nöronal hücre. DF) bir kültür duyusal nöronun Yüksek büyütme ile tutarlı bir yıldız ile işaretlenmiş bir hücre, hücre gövdesinden uzanan nevrotiler. Ge orada gösteriyorsa,) Ankastre kutusu akson ucunda büyüme konisi daha büyütülmüş olarak göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-aktif integrinlerin yoğunluğunu değerlendirmek için kullanıldı. Bu önceki çalışmalarda, bir yazılım programı doğru büyüme konisi 20 mikron uzak ucunun bir ana hatlarını oluşturmak için kullanılmıştır. Anahat NCAM boyama dayalı yapılmıştır. Nöronlarda NCAM arasında her yerde ifade tüm büyüme konisi ziyade büyüme konisinin sınırlı bir bölümünü tanımlamak için yazılım programı etkin. Bu büyüme konisi anahat daha sonra ilgili bir bölgesi ve Regi içinde integrin boyama yoğunluğuna olarak tanımlandıilgi yazılım tarafından değerlendirildi. Bu şekilde, ilgi konusu bir protein yoğunluğu kolaylıkla kültürlenebilir duyu nöronları içinde belirli bir bölgede ölçülebilir.
Güvenilir sonuçlar elde etmek için, aşağıdaki önerileri verilmektedir. İlk olarak, adım lamelleri de 1.4-1.6 HCl inkübasyondan sonra, su ile yıkandı, emin olun. Aksi takdirde, örneğin, laminin-1 gibi moleküller lamel üzerinde iyi dağıtmak olmayacaktır. İkincisi, aksi halde hücrelerin kümeleri oluşturacak ve bu nöronal saflık azalacak, DRG'ler yeterince tripsin sindirim sonra (adım 3.5) ayrışmış olduğunu doğrulamaktadır. Üçüncü olarak, bu nöronlar, daha saf bir popülasyon elde etmek için tam 3 saat boyunca aşama 3.9 DRG hücreleri inkübe etmek için en uygunudur. Bu inkübasyon adımı kısaltıldığında, daha kısa bir kuluçka süresinden sonra yerinden çıkarıldığında nöronal olmayan hücrelerin sayısını sınırlamak için adımlar 5.1 ve 5.2 durulama azaltır. Laminin-1 ve disso uygulanması sırasında Dördüncü olarak, bu yüzey gerilimi korunmasını sağlamaklamelleri anılmaktadır nöronlar. Yüzey gerilimi kaybolursa, çözelti lamel ve kuru ötesine uzanır. Bu nöronlar öldürecek. Beşinci olarak, uygun hücre yoğunluğu, her bir araştırmacı tarafından tespit edilmesi gerekmektedir. Daha önceki çalışmalar / ml laminin-1 ve 20 ug / ml, sırasıyla laminin 1 8,16, 1 ug ile kaplanmış 120,00 nöronlar / ml ve lamelleri 40,000 nöronlar / ml kaplama. Bu konsantrasyon araştırmacılar ücretsiz akson uçlarının (henüz başka bir nöron ile bağlantılı değil sonlar) çalışmaya izin verecek kadar düşük olmuştur. Altıncı, immünsitokimya sırasında, hafifçe hücreleri yıkayın belli olacak. Çıkarma veya lamel nöronlar bağdaki çok hızlı çözümler uygulayarak.
Bu prosedürün Sınırlamalar civciv DRG diseksiyon biraz sınırlı zaman penceresi bulunmaktadır. DRG'ler kolayca embriyonik gün (D) 7-10, piliç embriyolarından elde edilebilir. Daha önce de E7 daha DRG'ler elde etmek mümkün olsa da, biraz zordur. E11 sonra, daha fazla kıkırdak transkemiğe itions ve bu diseksiyon daha zor hale getirir. Böylece, yetişkin nöronların karşı embriyonik karşılaştırmak hedefliyoruz çalışmalar bu hatun modeli için ideal olmaz, ancak önceki çalışmalarda DRG'ler 32 yaş karşılaştırma için fare modeli kullandık. Bu sıçan DRG diseksiyon daha az sağlam ve daha pahalı ve civciv teknik açıdan daha zor olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta kültür süresi boyunca kültür edilmiş embriyonik değiştirme DRG nöronlarının yeteneğidir. Örneğin, bu sensor nöronlar seçme nörotrofinlerin 2,30 varlığına bağlı olarak, 48 saat içinde reseptörler farklı seviyeleri ifade etmedi.
DRG nöronlarının iki alt medya 2,12,30 seçici nörotrofinlerin kullanılarak zenginleştirilebilir. Örneğin, sinir büyüme faktörü (NGF) ve nörotrofin-3 (NT3) temel olarak deri ve proprioseptif nöronlar, sırasıyla 33 ve yaşamda kalmasını destekleyen. Bu deneyde kullanılan medya NGF ve NT3 hem vardırBununla birlikte, bu film kolaylıkla deri altı ya da proprioseptif duyusal nöronlar ya da seçmek için modifiye edilebilir.
Ayrışmış nöronlar büyüme konisinin motilite ve kalsiyum görüntüleme timelapse hayallerin dahil olmak üzere birçok canlı görüntüleme tekniklerine elverişlidir. Ortamın pH tamponlama için CO 2 gerektirmez, çünkü burada kullanılan ortam, canlı hücre görüntüleme için avantajlıdır. Dolayısıyla, canlı hücrelerden veri edinimi, ısıtılmış sahne ile mikroskop altında gerçekleştirilebilir ama yeterli CO2 seviyelerinin bakım gerektirmez. Büyüme hızı koni, çökme 8,16,30 ve kalsiyum düzeyi 17 burada tarif edilen teknik ile izole edilmiş canlı bir primer piliç duyu nöronlarında incelenmiştir. Ayrıca, RNAi başarılı bir şekilde kültür civciv DRG nöronlarının 34 protein seviyelerini azaltabilir.
In vitro modellerde iyi tanımlanmış kazanılan öngörüleri deney tasarımı için önemli bir temel olarak kullanılabilirdaha karmaşık bir in vivo modelinde. Örneğin, çeşitli yaklaşımlar gliar yara izlerinin bir in vitro modelde akson büyümesini uyardığı gümüş laboratuarda 35 kullanılmıştır. In vitro test reaktifleri çeşitli, sadece iki (iltihap indüksiyon ve kondroitin sülfat proteoglikan sindirim) akson yenilenmesini teşvik edebilir. İlginç bir şekilde, in vivo olarak, bu iki tedavinin bir kombinasyonu, 35 omurilik içine, dramatik ve fonksiyonel akson rejenerasyonunu teşvik etmiştir. Bu durumda, in vitro deneyler akson dış gelişimini kuvvetli bir artış reaktifler için hızlı bir şekilde taramak için önemli bir araç sağlanır. Başarılı bir şekilde, in vitro olarak akson büyümesini teşvik reaktifler yanı sıra diğer hücre kültürü değerini destekler, in vivo başarılı olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
