Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप में लाइव कोशिका झिल्ली पर आण्विक प्रसार कानून को फास्ट प्रतिदीप्ति इमेजिंग से

Published: October 9, 2014 doi: 10.3791/51994
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 2
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

Abstract

यह स्थानिक वितरण और लिपिड और प्रोटीन की तरह झिल्ली घटकों की गति कई सेलुलर कार्यों के विनियमन में महत्वपूर्ण कारक हैं कि तेजी से स्पष्ट हो गया है. हालांकि, तेजी से गतिशीलता और शामिल छोटे संरचनाओं के लिए, एक बहुत ही उच्च spatio- लौकिक संकल्प अणुओं की वास्तविक व्यवहार को पकड़ने के लिए आवश्यक है. यहाँ हम उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में fluorescently लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन और लिपिड की गतिशीलता के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. विशेष रूप से, इस दृष्टिकोण प्रत्येक अणु को ट्रैक करने की जरूरत नहीं है, लेकिन यह झिल्ली का एक दिया क्षेत्र के सभी अणुओं का उपयोग कर जनसंख्या व्यवहार खरीदते हैं. शुरुआती बिंदु झिल्ली पर एक दिया क्षेत्र की एक तेजी से इमेजिंग है. बाद में, एक पूर्ण spatio- अस्थायी autocorrelation समारोह उदाहरण के लिए, प्रत्येक 2, 3, एन repetitions समय देरी बढ़ती में अधिग्रहीत छवियों correlating गणना की जाती है. यह चौड़ाई को दिखाना है कि संभव हैकारण प्रसार करने के कण आंदोलन के एक समारोह के रूप में समय की देरी बढ़ाने के स्थानिक autocorrelation समारोह बढ़ जाती है की चोटी की. इसलिए, autocorrelation कार्यों की श्रृंखला की फिटिंग वास्तविक प्रोटीन यहां औसत विस्थापन बनाम स्पष्ट diffusivity के रूप में प्रस्तुत किया, इमेजिंग (iMSD) से वर्ग विस्थापन मतलब निकालने के लिए सक्षम बनाता है. इस नैनोमीटर सटीकता के साथ एकल अणुओं की औसत गतिशीलता का एक मात्रात्मक देखने पैदावार. लेबल transferrin रिसेप्टर (टीएफआर) और एक ATTO488 की एक GFP टैग संस्करण का उपयोग करके 1-palmitoyl-2-hydroxy- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine (पीपीई) उस पर प्रोटीन और लिपिड प्रसार के spatiotemporal विनियमन निरीक्षण करने के लिए संभव है माइक्रो करने वाली मिल्ली दूसरी बार सीमा में माइक्रोन आकार झिल्ली क्षेत्रों.

Introduction

सिंगर और निकोल्सन द्वारा मूल "द्रव मोज़ेक" मॉडल से शुरू, सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली की तस्वीर लगातार cytoskeleton और लिपिड डोमेन 1,2 की उभरती भूमिका को शामिल करने के क्रम में पिछले दशकों के दौरान अद्यतन किया गया है.

पहली टिप्पणियों झिल्ली प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अंश 3-5 स्थिर है कि (FRAP) अनावरण photobleaching के बाद फ्लोरोसेंट वसूली से प्राप्त किया गया. इन अग्रणी अध्ययन, बहुत जानकारीपूर्ण हालांकि, FRAP setups के अपेक्षाकृत गरीब अंतरिक्ष (माइक्रोन) में संकल्प और समय (सेकंड) से सामना करना पड़ा. इसके अलावा, एक जोड़ा औसत माप किया जा रहा है, FRAP एक अणु व्यवहार के बारे में जानकारी देने में अभाव है.

इस संदर्भ में, संभावना विशेष रूप से (एक समय में प्रसार की प्रक्रिया एक अणु के अध्ययन की अनुमति) बहुत उज्ज्वल टैग के साथ एक अणु लेबल करने के लिए बहुत सफल रहा है. विशेष रूप से, जोर सेएट microseconds timescale, Kusumi, बहुत झिल्ली फिजियोलॉजी 6 में actin आधारित झिल्ली कंकाल की भूमिका की मान्यता के लिए योगदान दिया है कि लिपिड और प्रोटीन की गतिशीलता की अज्ञात सुविधाओं के लिए अल. प्राप्त की पहुँच के लिए एक कण ट्रैकिंग (SPT) दृष्टिकोण का समय संकल्प , 7. इन निष्कर्षों लिपिड और प्रोटीन प्रसार actin आधारित कंकाल द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें 'धरना और बाड़' मॉडल, तथाकथित उत्पन्न. हालांकि, SPT कई प्रयोगात्मक मुद्दों द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी की विशाल राशि के लिए उपयोग करने के क्रम में संबोधित किया जाना है. विशेष रूप से, लेबलिंग प्रक्रिया आम तौर पर इस प्रणाली में लेबल प्रजातियों के उत्पादन, शोधन और परिचय की तरह कई कदम से बना है. इसके अलावा, बड़े लेबल, क्वांटम डॉट्स या धातु नैनोकणों की तरह, अक्सर उप millisecond timescale और कई मामलों में टाला नहीं जा सकता है लेबल द्वारा लक्ष्य अणुओं की crosslinking तक पहुँचने के लिए आवश्यक हैं. अंत में, कई trajectoriesसांख्यिकीय मापदंड फिट करने के लिए दर्ज हो चुके हैं और समन्वित रूप से लेबल की एक कम घनत्व ट्रैकिंग की अनुमति की आवश्यकता है.

SPT की तुलना में, इन कमियों के कई पर काबू पाने प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), आणविक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही होनहार दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. वास्तव में, एफसीएस क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम करने, मंद और घने लेबल के साथ अच्छी तरह भी काम करता है. इसके अलावा, यह समय की एक सीमित मात्रा में उच्च आँकड़े तक पहुँचने की अनुमति देता है. अंत में, लेबल की "" उच्च घनत्व के बावजूद FCS एकल अणुओं जानकारी प्रदान करता है. धन्यवाद इन सभी गुणों को, एफसीएस एक बहुत स्पष्ट दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है और बड़े पैमाने पर मॉडल झिल्ली में और जीवित कोशिकाओं 8-10 में दोनों लिपिड और प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. कई अलग अलग दृष्टिकोण आणविक प्रसार का विवरण प्रकट करने के लिए एफसीएस की क्षमता में वृद्धि करने का प्रस्ताव किया गया है. उदाहरण के लिए, यह श थाखुद को अलग ढंग से आकार अवलोकन क्षेत्रों पर एफसीएस प्रदर्शन से एक आणविक गति 11,12 के एक "एफसीएस प्रसार कानून" शिक्षाप्रद छिपा सुविधाओं परिभाषित कर सकते हैं कि. आकार में विविध होने के अलावा, फोकल क्षेत्र में भी, 13 दोहराया गया था तेजी कैमरों 21,22 के साथ लाइनों 14-20 या संयुग्मित साथ अंतरिक्ष में ले जाया गया. इन 'spatio- लौकिक' सहसंबंध दृष्टिकोण का उपयोग कर, कई झिल्ली घटकों के प्रासंगिक जैविक मापदंडों मात्रात्मक मॉडल झिल्ली और वास्तविक जैविक वाले, झिल्ली स्थानिक संगठन में इस प्रकार उपज अंतर्दृष्टि दोनों पर वर्णित किया गया.

हालांकि, सभी FRAP और FCS अनुप्रयोगों में अब तक वर्णित फोकल क्षेत्र के आकार के दूर नहीं किया जा सकता है कि स्थानिक संकल्प में एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है. कई सुपर संकल्प इमेजिंग तरीकों हाल ही में इस सीमा को बायपास करने के लिए विकसित किया गया है. कुछ ऐसे Stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में, स्थानीयकरण परिशुद्धता के आधार पर कर रहे हैं <समर्थन> 23,24, photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 25, प्रतिदीप्ति पाम (FPALM) 26, और एकल कण ट्रैकिंग पाम (sptPALM) 27: प्रत्येक स्नैपशॉट में आवश्यक फोटॉनों की अपेक्षाकृत बड़ी राशि है, तथापि, के समय संकल्प सीमा कम से कम कई मिसे के लिए इन तरीकों, इस प्रकार vivo में उनकी प्रयोज्यता बाधा.

इसके विपरीत, सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए एक आशाजनक विकल्प स्थानिक प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण तरीकों (STED या प्रतिवर्ती saturable ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति संक्रमण (RESOLFT)) 28,29 के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन नियमन से खोल दिया गया है. इन तरीकों में तेजी से स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी और पहचान प्रणाली का उपयोग करने की संभावना के साथ अवलोकन मात्रा का आकार देने में अच्छी तरह से नीचे विवर्तन सीमा गठबंधन. प्रतिदीप्ति अस्थिरता विश्लेषण के साथ संयोजन में, STED माइक्रोस्कोपी सीधे लिपिड और पी के nanoscale spatiotemporal गतिशीलता की जांच करने की अनुमति दीजीवित कोशिका झिल्ली 30,31 में roteins.

STED आधारित माइक्रोस्कोपी का ही भौतिक मात्रा में जीवित कोशिकाओं में fluorescently टैग झिल्ली प्रोटीन और / या लिपिड की गतिशीलता के अध्ययन के लिए उपयुक्त है कि एक संशोधित spatio- अस्थायी छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (stics 32,33) विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप से. यहाँ प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल कुछ कदम से बना है. पहले एक झिल्ली पर ब्याज के क्षेत्र की एक तेज इमेजिंग की आवश्यकता है. फिर, छवियों के परिणामस्वरूप ढेर औसत स्थानिक लौकिक सहसंबंध कार्यों की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सहसंबंध कार्यों की श्रृंखला फिटिंग द्वारा, आणविक 'प्रसार कानून' एक स्पष्ट diffusivity (डी एपीपी) के रूप में इमेजिंग से सीधे प्राप्त किया जा सकता है - -average विस्थापन साजिश बनाम. इस साजिश समीक्षकों अणुओं से पता लगाया वातावरण पर निर्भर करता है और सीधे वास्तविक प्रसार मोड पहचानने की अनुमति देता हैब्याज की लिपिड / प्रोटीन की.

पहले 34 के रूप में दिखाया अधिक विवरण में, अधिग्रहीत छवि श्रृंखला की spatio- अस्थायी ऑटो सहसंबंध समारोह समीक्षकों एकत्र छवि श्रृंखला में आगे बढ़ अणुओं की गतिशीलता पर निर्भर करता है (एक ही तर्क एक लाइन अधिग्रहण में लागू किया जा सकता है कि कृपया ध्यान दें अंतरिक्ष में सिर्फ एक आयाम) माना जाता है, जहां. विशेष रूप से, हम सहसंबंध समारोह के रूप में परिभाषित:

(1)

जहां स्थिति एक्स में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है, वाई और समय टी, और का प्रतिनिधित्व करता है एक्स में दूरी औरक्रमशः वाई दिशाओं, समय अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है, और औसत का प्रतिनिधित्व करता है. इस समारोह के रूप में व्यक्त किया जा सकता है:

(2)

'एन' अवलोकन क्षेत्र में अणुओं की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, अंतरिक्ष में कनवल्शनफ़िल्टर्स ऑपरेशन का प्रतिनिधित्व करता है, और वाद्य कमर के autocorrelation का प्रतिनिधित्व करता है. यह बाद के कारण ऑप्टिकल / रिकॉर्डिंग स्थापना के लिए एक एकल emitter के फोटॉनों अंतरिक्ष में फैल रहे हैं की एक उपाय के रूप में व्याख्या की जा सकती (तथाकथित बात फैल समारोह, पीएसएफ, जीनअच्छी तरह से) एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated रैली. अंत में, एक दूरी पर एक कण को ​​खोजने के लिए संभावना का प्रतिनिधित्व करता है और एक समय की देरी के बाद . हम कणों सभी दिशाओं में बेतरतीब ढंग से ले जाने और शुद्ध अपशिष्टों मौजूद नहीं हैं, जिसमें एक वाचाल गतिशीलता, विचार, इस समारोह में भी अच्छी तरह से विचरण चलती कण का मतलब स्क्वायर विस्थापन (एमएसडी) के रूप में पहचाना जा सकता है जहां एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated है . इस प्रकार, सहसंबंध समारोह की कमर (भी रूप में भेजा ), कण MSDS की राशि और वाद्य कमर के रूप में परिभाषित किया जा सकता है और एक गाऊसी फिट से मापा जा सकता हैहर बार देरी के लिए सहसंबंध समारोह की ting. मापा मैं एमएसडी आगे बढ़ अणुओं का एक स्पष्ट diffusivity गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक औसत विस्थापन के रूप में:

(3)

(4)

निम्न वर्गों भर में पाठक मार्गदर्शन कर सकते हैं इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक स्थापना पर कुछ विचार. चुनिंदा एक वाणिज्यिक TIR प्रतिदीप्ति हम कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​रोशनी का उपयोग करेगा जीवित कोशिकाओं के बेसल झिल्ली पर fluorophores उत्तेजित करने के लिए आदेश में (TIRF) माइक्रोस्कोप (विवरण सामग्री अनुभाग में पाया जा सकता है). इसके अलावा, आदेश में वें इकट्ठा करने के लिएई प्रतिदीप्ति हम एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करेगा और (चिप 16 माइक्रोन पर पिक्सेल की शारीरिक आकार) एक EMCCD कैमरा (100x NA 1.47, उच्च संख्यात्मक एपर्चर TIRF रोशनी के लिए आवश्यक है). 100 एनएम के एक पिक्सेल आकार तक पहुँचने के लिए हम 1.6x के एक अतिरिक्त बढ़ाई लेंस लागू होते हैं. नीचे चर्चा की, 1 मिसे नीचे एक समय संकल्प ठीक से 100 एनएम से नीचे तेजी से झिल्ली लिपिड की गतिशीलता का वर्णन करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. इस अस्थायी समाधान तक पहुँचने के क्रम में हम कैमरा (एक्स 512 512) के पूरे चिप की तुलना में छोटे ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन करने की आवश्यकता है. इस तरह, कैमरे समय संकल्प बढ़ती लाइनों की संख्या कम पढ़ा होगा. हालांकि, इस readout शासन में फ्रेम बार कैमरे पर readout चिप के लिए जोखिम से शुल्क में बदलाव करने की जरूरत है और 512 x 512 पिक्सेल EMCCD के लिए मिसे के क्रम में आमतौर पर समय से सीमित हो जाएगा. इस सीमा को हरा करने के लिए, एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी डब्ल्यू, रॉय लाइनों केवल बजाय पूरे फ्रेम स्थानांतरण की अनुमति देता है(हमारे EMCCD में फसली सेंसर मोड कहा जाता है) उजागर चिप के आकार का एक व्यावहारिक प्रभावी कमी रबर. इस विन्यास प्रभावी होने के लिए, रॉय के बाहर चिप ऑप्टिकल पथ में घुड़सवार slits के एक जोड़े द्वारा कवर किया जाना चाहिए. एक समय संकल्प नीचे 10 -4 सेकंड के लिए इस सेटअप करने के लिए धन्यवाद प्राप्त किया जा सकता है. 'चर्चा' अनुभाग में समझाया के रूप में इस दृष्टिकोण, कई अलग अलग प्रयोगात्मक setups के साथ मिलकर किया जा सकता है कि, हालांकि, कृपया ध्यान दें.

विधि का प्रदर्शन GFP- एक ATTO488 लेबल दोनों 1-palmitoyl-2-hydroxy- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-पीपीई) और transferrin रिसेप्टर के एक GFP लेबल संस्करण (का उपयोग करके, जीवित कोशिकाओं में प्रदान किया जाएगा टीएफआर). पहले से 30,35 रिपोर्ट के रूप में ATTO488-पीपीई के मामले में इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक, एक ज्यादातर मुक्त प्रसार का संकेत औसत विस्थापन के एक समारोह के रूप में एक लगभग निरंतर विकास अनुप्रयोग ठीक हो सकता है. इसके विपरीत, टीएफआर-GFP एक घटते विकास से पता चलता है 6 सुझाव औसत विस्थापन के एक समारोह के रूप में b> अनुप्रयोग. इसके अलावा, दूसरे मामले में यह स्थानीय प्रसार निरंतर और झिल्ली विमान पर कई माइक्रोन से अधिक औसत कारावास क्षेत्र यों संभव है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 सिस्टम अंशांकन

  1. बात फैल समारोह (पीएसएफ) अंशांकन
    1. आसुत जल का 90 μl में 30 एनएम फ्लोरोसेंट मनका समाधान (लगभग 5 माइक्रोन) के 10 μl पतला और फिर 20 मिनट के लिए समाधान sonicate. एक वर्ग (1 सेमी एक्स 1 सेमी) agarose जेल (3%) और जमा जेल के शीर्ष पर समाधान के 10 μl का टुकड़ा काट. एक 2 सेमी पेट्री डिश के नीचे कांच पर जेल का टुकड़ा उलट और कांच पर बूंद निचोड़.
    2. अधिग्रहण सेटअप को चालू धारक में नमूना डाल, कैमरा जोखिम और EMgain सेट (100 मिसे और 1,000 प्रणाली के अनुसार अच्छा मानकों हैं लेकिन अनुकूलन) और कैमरा नीचे शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें.
    3. 100 मिसे, 1000 को कैमरे EMgain, अधिग्रहण मोड में सेट कैमरा जोखिम सेटिंग को बचाने स्थानांतरण, 100 पुनरावृत्ति और ऑटो फ्रेम करने के लिए.
    4. जेल की सीमा पर ऐपिस और प्रेषित प्रकाश फोकस का उपयोग करना और फिर, जेल के केंद्र के लिए उद्देश्य के लिए कदम फोकस और स्टेशन को समायोजितलेजर संरेखण प्रक्रिया RT (लास वायुसेना में, 'TIRF सेटअप' का चयन करें और ऑटो संरेखण प्रक्रिया का पालन).
    5. एक संदर्भ के रूप में (जो कि आमतौर पर मोती कुल का प्रतिनिधित्व करता है) उज्जवल मौके पर ही ध्यान केंद्रित सही, पृथक एकल धब्बों के साथ देखने का एक क्षेत्र का पता लगाएं 100 फ्रेम अधिग्रहण और कई एकल स्पॉट हासिल करने के क्रम में कदम 5-6 बार दोहराएँ.
    6. एक डाटा प्रोसेसिंग प्रोग्राम के लिए अधिग्रहीत श्रृंखला के आयात और समय में (चित्रा 1 ए) के ढेर के औसत और एक अलग मनका का चयन करें. कण समुच्चय से बचने के लिए छोटी से छोटी लोगों का चयन करने के लिए ध्यान रखना.
    7. (Matlab में सामग्री में आईसीएस Matlab उपकरण में) कमांड "gaussfit" का उपयोग कर एक गाऊसी समारोह के साथ चयनित तीव्रता वितरण (एकल मोती प्रोफाइल का एक उदाहरण चित्रा 1 बी में प्रस्तुत किया जाता है) फिट. प्राप्त बच निरीक्षण द्वारा फिट की अच्छाई सत्यापित (इसी बच साथ सज्जित गाऊसी प्रोफाइल का एक उदाहरण मैं प्रस्तुत किया हैn चित्रा 1 बी).
  2. कैमरा अंशांकन
    1. कैमरा चालू करें और कैमरा नीचे शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें. सेट कैमरा अधिग्रहण की स्थापना, (यानी, इस्तेमाल किया कैमरा के लिए हम 0.5 मिसे, 1000 को कैमरे EMgain, फसली मोड, 32 एक्स 128, 10,000 पुनरावृत्ति को आरओआई आकार के लिए अधिग्रहण मोड के लिए जोखिम सेट) और कैमरा पृष्ठभूमि के अधिग्रहण शुरू संकेत.
    2. आयात एक डाटा प्रोसेसिंग प्रोग्राम के लिए फ्रेम श्रृंखला का अधिग्रहण किया. गणना और कैमरा पृष्ठभूमि चिप के चयनित क्षेत्र में लगभग सपाट है कि सत्यापित करने के क्रम में प्रत्येक पिक्सेल में औसत तीव्रता का निरीक्षण किया. कैमरा पृष्ठभूमि आमतौर पर सीमा लाइनों में पक्षपाती है क्योंकि फसली मोड में, प्रत्येक फ्रेम के लिए पहला और (आरओआई के आकार के आधार पर 3 से 10) पिछले कुछ क्षैतिज लाइनों को हटा दें.
    3. मूल्यों की एक हिस्टोग्राम बनाएँ (Matlab में कमांड 'इतिहास' का उपयोग) पर ढेर अधिग्रहीत छवियों में (भी डिजिटल स्तर, डीएल परिभाषित) और लघुगणक साजिशआवृत्ति जिसके परिणामस्वरूप के (Matlab में semilogy आदेश का उपयोग). कैमरा पृष्ठभूमि के लिए डीएल वितरण का एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है.
      नोट: कैमरे में अच्छी तरह से काम कर रहा है, साजिश एक घातीय क्षय (लॉग पैमाने में नकारात्मक ढलान के साथ एक लाइन के द्वारा पीछा शून्य फोटोन के लिए जुड़े मूल्यों के वितरण का प्रतिनिधित्व एक लगभग गाऊसी शिखर (लॉग पैमाने में एक परवलयिक प्रोफाइल) दिखाएगा ) 1 फोटान (चित्रा 2) के लिए जुड़े मूल्यों के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है. घातीय भाग का क्षय लगातार हर एक फोटान को कैमरे द्वारा सौंपा डीएल के एक अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि विशेष रूप से, केंद्र और गाऊसी समारोह का विचरण, क्रमशः, ऑफसेट कैमरा और त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. Matlab में सामग्री के समर्थन में स्क्रिप्ट की धारा "CalibrateCamera" का उपयोग करें.
    4. सभी चयनित कैमरा EMGain और लाभ के लिए आपरेशन दोहराएँ.

2 लेबलसेल तैयार

  1. (1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine), लिपिड समावेश 36 के लिए आवश्यक liposomes तैयार डोप के अलग से 1 मिलीग्राम भंग करने के लिए, DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-प्रोपेन) के 1 मिलीग्राम, और क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर में पीपीई-ATTO488 की 1 मिलीग्राम. 24 घंटे के लिए वैक्यूम के अंतर्गत एक साथ 0.5 डोप समाधान के मिलीलीटर, DOTAP समाधान के 0.5 मिलीलीटर, और पीपीई-ATTO488 समाधान के 25 μl और सूखी मिश्रण. 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15 मिनट और sonicate के लिए HEPES बफर 20 मिमी के 0.5 मिलीलीटर, भंवर जोड़ें.
  2. , सेल तैयार पीबीएस के साथ मिला हुआ चो K1 (चीनी हैम्स्टर अंडाशय) के एक P100 पकवान 3 बार धोने, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में trypsin और दुकान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. FBS के 10% के साथ पूरक DMEM / F12 माध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ने अलग कोशिकाओं को निलंबित और एक ही माध्यम के 800 μl युक्त एक पेट्री डिश में सेल समाधान के 150 μl बीज.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में स्टोर और 5% सीओ 2. लिपिड शामिल करने के लिए, 500 के साथ सेल मध्यम जगहसीरम मुक्त माध्यम के μl; 30 मिनट के बाद, liposomes समाधान के 2 μl जोड़ने; और पीएसबी के साथ 15 मिनट धोने के बाद इमेजिंग के लिए नई DMEM / F12 मध्यम जोड़ें.
  4. अभिकर्मक के लिए, transfect कोशिकाओं इमेजिंग से पहले इनक्यूबेटर में टीएफआर-GFP प्लाज्मिड और दुकान 24 घंटे का उपयोग Lipofectamine प्रोटोकॉल (निर्माता निर्देश) के अनुसार.

3 डाटा अधिग्रहण

  1. सेटअप तैयारी
    1. माइक्रोस्कोप थर्मोस्टेट करने के लिए, प्रयोग से पहले 24 घंटा इनक्यूबेटर पर बारी.
    2. सबसे तेजी से प्राप्त अधिग्रहण के समय लागू करने के लिए, फसली सेंसर मोड में काम (परिचय देखें) और सेल (कैमरा 2) का चयन करने के लिए इमेजिंग कैमरा (1) और दूसरा कैमरा के लिए एक पहली बार कैमरे का उपयोग करें. सेटअप विन्यास की एक योजना पूरक चित्रा S1 में प्रस्तुत किया है. फिर, माइक्रोस्कोप पर दो कैमरों बारी संरेखित और कैमरे को शांत करने के लिए प्रतीक्षा करने के लिए.
    3. दोनों कैमरों प्रेषित प्रकाश इमेजिंग के लिए मानकों पर सेट (यानी
    4. केवल (यहाँ एक 32 x 32 पिक्सल आरओआई) सेल इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया रॉय पर प्रकाश की अनुमति slits धक्का धीरे धारक में नमूनों रखो और ऐपिस का उपयोग ध्यान केंद्रित, कैमरा 1 को प्रकाश भेजने और.
    5. चयनित क्षेत्र में एक सेल में ले जाएँ और कैमरा 2 के लिए प्रकाश भेजने के लिए, तो एक संदर्भ के क्रम में कैमरा 2 नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक आरओआई आकर्षित.
  2. इमेजिंग (चित्रा 3A)
    1. सबसे पहले, अपने स्थापना की प्रक्रिया के अनुसार TIRF लेजर संरेखित. हमारे सेटअप में, 'TIRF सेटअप' का चयन करें और ऑटो संरेखण प्रक्रिया शुरू करते हैं. लेजर गठबंधन किया है जब (लगभग 70 डिग्री) प्रवेश गहराई के 70 एनएम निर्धारित किया है.
    2. दोनों कैमरा 1 और कैमरा 2 पर 100 तक EMGain 70 मिसे के लिए और जोखिम समय सेट करें; फिर, कैमरा 1 का उपयोग कर एक सेल का चयन करें, तो कैमरा 2 पर प्रकाश भेजने और सही ढंग से कोशिका झिल्ली ध्यान केंद्रित. सीए पर न्यूनतम जोखिम निर्धारितमेरा 2, 1000 EMGain, फसली सेंसर मोड, 10 5 repetitions और सेट स्वत: सहेजना फ़ाइलें (लचीला छवि परिवहन प्रणाली, आसानी से हो प्रबंधित कर सकते हैं कि एक प्रारूप) फिट बैठता है.
    3. छवि श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण शुरू करो. लाभ और फिर, एक नया सेल प्राप्त करने से पहले तापमान स्थिरीकरण की अनुमति 8-10 कोशिकाओं के अधिग्रहण के क्रम में पिछले दो कदम दोहराने के लिए फसली मोड रिलीज.

इमेजिंग से मीन स्क्वायर विस्थापन के 4 गणना (मैं एमएसडी)

नोट: निम्न प्रोटोकॉल सीधे कच्चे डेटा पर लागू किया जा सकता है. एक ही समय में, पूरे प्रोटोकॉल Matlab में और SimFCS में दोनों नकली डेटा अधिग्रहण के लिए मान्य है. इसी ट्यूटोरियल के लिए लिंक 'माल' अनुभाग में पाया जा सकता है.

  1. Matlab द्वारा गणना
    1. ImportImageSeries स्क्रिप्ट का उपयोग कर Matlab के लिए अधिग्रहीत की श्रृंखला आयात करें. सीओ का उपयोग समय में प्रत्येक छवि के औसत तीव्रता की गणनाmmand पहले 2 आयामों पर मतलब है और जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर देखने के लिए भूखंड का उपयोग करें.
    2. Photobleaching के 10% से अधिक मौजूद है, तो श्रृंखला त्यागने या उनमें से पहले भाग को हटा दें. यह कम है तो 37 से पहले दिखाया गया है, प्रत्येक छवि के लिए इसकी औसत तीव्रता घटाकर सहसंबंध समारोह पर प्रभाव को दूर करने के लिए प्रयास करें.
    3. तीसरा आयाम पर मतलब का उपयोग करके प्रत्येक पिक्सेल की औसत तीव्रता की गणना और छवि परिणामस्वरूप देखें.
      नोट: विशेष रूप से ध्यान artifactual सहसंबंध से बचने के लिए आवश्यक है. वास्तव में, जैसा कि पहले भी इसी तरह की तकनीक 38, सेल सीमाओं के लिए और साथ ही फोकस पुटिका के बाहर दिखाया गया के रूप में एक मजबूत संबंध मिलवा सकता है. औसत छवि का निरीक्षण सेल सीमाओं या ध्यान vesicles के बाहर का पता चलता है, अन्यथा अधिग्रहण त्यागने शामिल क्षेत्र को बाहर करने का प्रयास करें. इस स्थिर संरचनाओं के प्रभाव को दूर करने के लिए प्रत्येक पिक्सेल 39 से औसत अस्थायी तीव्रता घटाना.
    4. टी की गणनासमारोह CalculateSTICScorrfunc का उपयोग करके वह spatiotemporal सहसंबंध (जी (ξ, χ, τ)). जी (ξ, χ, 0) की वजह से कम प्रकाश व्यवस्था में शॉट शोर को सहसंबंध जी हावी क्योंकि (0,0,0) निकालें; कारण डिटेक्टर को सहसंबंध मापा कमर में वृद्धि से τ = 0 जी (ξ, χ, τ) ख़राब कर सकता है जोखिम समय के दौरान जी (± 1,0,0), और कण आंदोलन हावी (इस आशय τ के लिए गायब हो जाता है > 0) 34.
    5. तो सामग्री के समर्थन में "LogBinStack" समारोह का उपयोग करके शोर को कम करने के लिए और एक लघुगणक समय बिन का उपयोग टूटने जी (ξ, χ, τ> 0) (ξ, χ, τ) समारोह का उपयोग "gaussfit" के परिणामस्वरूप जी फिट माल में आईसीएस Matlab उपकरण मैं एमएसडी (जिसके परिणामस्वरूप सरणी के दूसरे स्तंभ) को ठीक करने के लिए.
    6. समय के एक समारोह के रूप में प्राप्त की कमर σ (τ) 2 (मैं एमएसडी) साजिश. डेटा भी शोर कर रहे हैं, acqu की संख्या बढ़ाने की कोशिशiRed फ्रेम, एक साथ लेजर शक्ति, औसत और ज्यादा (ξ, χ, τ) में वृद्धि.
  2. SimFCS द्वारा गणना
    1. ImageJ BioFormat आयातक प्लगइन का उपयोग कर के साथ प्राप्त कर लिया फ़ाइलों को खोलने और झगड़ा अनुक्रम के रूप में प्राप्त कर लिया श्रृंखला बचाने के लिए.
    2. ओपन SimFCS और चयन RICS उपकरण का चयन करें और फ़ाइल> आयात एकाधिक छवियाँ (अनुपूरक चित्रा S2).
    3. फिट खिड़की (अनुपूरक चित्रा S3), फ़िट तिथी सही अधिग्रहण मापदंडों डालने और बंद करें.
    4. प्रदर्शन> औसत तीव्रता> CH1 चुने और photobleaching की उपस्थिति (अनुपूरक चित्रा S4) सत्यापित.
    5. Photobleaching के 10% से अधिक वर्तमान त्यागें श्रृंखला है या अगर यह संभव फिर से लोड श्रृंखला के पहले भाग को हटाने छवि अनुक्रम है.
    6. यह विरंजन कम से कम 10% का चयन करें उपकरण है> मैं एमएसडी> निर्धारित मापदंडों छोड़ दिया, एक पर रॉय पैनल में सेट, 'उपयोग मूविंग एवरेज' की जांचसंवाददाता समय विशेषता प्रसार समय की तुलना में अधिक है कि चल औसत भुगतान ध्यान के लिए फ्रेम का भूरा रंग (1 माइक्रोन 2 सेकंड से आगे बढ़ कण के लिए -1 10 सेकंड का एक समय एक अच्छा चल औसत है)
    7. उपकरण> iMSD> मैं एमएसडी (अनुपूरक चित्रा S5) और फिट की गणना और ज्ञापन पैड से मैं एमएसडी निर्यात (अनुपूरक चित्रा S6).

मैं एमएसडी से प्रसार कानून की 5 गणना

  1. अवरोधन (σ ​​0 2) एक्सट्रपलेशन पहले कुछ बिंदुओं फ़िट (5 अंक आमतौर पर पर्याप्त हैं, लेकिन अधिक अंक वे एक रेखीय व्यवहार दिखाने लगाया जा सकता है) और पहले से मापा पीएसएफ 2 के साथ इस मूल्य की तुलना करें. वे तुलना कर रहे हैं, अलग fluorophores की गतिशीलता का पालन किया जा रहा है. इसके विपरीत, σ 0 2 >> पीएसएफ 2 की कोशिश है कि यह सुनिश्चित करने के लिए तेजी से प्राप्त करने के लिए अगरकोई छिपा हुआ गतिशीलता 34 उपस्थित रहे.
  2. स्पष्ट diffusivity (डी एपीपी) और समीकरणों 3 और 4 (परिचय देखें) का उपयोग औसत विस्थापन (आर) की गणना.
  3. एफसीएस 12 (चित्रा 3 डी) आधारित स्थान परिवर्तन के साथ मापा जाता है के साथ तुलनीय एक प्रसार कानून प्राप्त करने के लिए अनुसंधान के एक समारोह के रूप में प्लॉट डी अनुप्रयोग.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल कदम 1.1 में वर्णित के रूप में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई कमर जांच करने के लिए आदेश में, एक एकल फ्लोरोसेंट नैनो मनका की छवि उपाय हो सकता है. इन मोतियों की एक ठेठ फ्लोरोसेंट छवि चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. एक 2 डी गाऊसी समारोह से तीव्रता वितरण की फिटिंग वापस अच्छा बच देता है और 270 एनएम पर सहायक कमर को मापने के लिए अनुमति देता है. यह मान रेले समीकरण द्वारा अनुमानित की उम्मीद है और विवर्तन सीमा के साथ अच्छे समझौते में है. इस अंशांकन कण गतिशीलता की माप के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन यह स्पष्ट कण आकार को मापने के लिए आवश्यक है.

कैमरा पृष्ठभूमि का एक विशिष्ट आवृत्ति वितरण के बारे में 180 डीएल पर पीक कोई फोटोन को कैमरे प्रतिक्रिया की वजह से है. चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है, और यह एनालॉग से डिजिटल (ई) कनवर्टर के योगदान का प्रतिनिधित्व करता है. यह योगदान ऑफसेट अनुमान लगाने के लिए एक गाऊसी वितरण और विचरण के रूप में अनुमानित किया जा सकता हैसंकेत रिकॉर्डिंग द्वारा शुरू की. 200 डीएल से ऊपर डिजिटल स्तर वितरण घातीय (लघुगणक पैमाने में रैखिक) हो जाता है और एक फोटान के लिए औसत कैमरा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. एक घातीय वितरण के साथ इस हिस्से फिटिंग प्रत्येक फोटान को सौंपा औसत डीएल की माप की अनुमति देता है. उच्च प्रत्येक फोटोन को सौंपा औसत डीएल और ई कनवर्टर त्रुटि के बीच का अनुपात है, कम गणना सहसंबंध समारोह में शोर हो जाएगा. इसके अलावा, औसत फोटान प्रतिक्रिया कैमरा गतिशील रेंज के आकलन की अनुमति देता है.

पूरा प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक चित्र चित्रा 3 में संक्षेप है और झिल्ली में Atto488-पीपीई प्रविष्टि की एक तस्वीर चित्रा -4 ए में प्रतिनिधित्व किया है. Atto488-पीपीई के साथ लेबल एक चो कोशिकाओं के बेसल झिल्ली का एक प्रतिनिधि TIRF छवि 4B चित्रा में प्रस्तुत किया है. कई चमकीले धब्बों ली की वजह से सेल के बाहर मौजूद हो सकता हैposomes कांच पर खड़ी. वे एक झिल्ली हिस्से पर प्रतिदीप्ति में ज्यादातर वर्दी एक आरओआई चुनकर खारिज किया जा सकता है (यानी., सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली). जैसी कि उम्मीद थी इस लिपिड के लिए मापा प्रसार कानून (चित्रा 4C) पहले से STED-एफसीएस माप 30,35 द्वारा दिखाए गए के रूप में एक ज्यादातर मुक्त प्रसार का संकेत सपाट है. यह स्पष्ट रूप से करने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता का संकेत है, सभी दिखाया विस्थापन मूल्यों विवर्तन सीमा से नीचे हैं उल्लेखनीय है कि नैनोमीटर की कुछ दसियों के लिए अच्छी तरह से विवर्तन सीमा से नीचे और नीचे औसत आणविक displacements सुपर हल.

झिल्ली में टीएफआर-GFP डिमर प्रविष्टि की एक schematization चित्रा 5A में प्रतिनिधित्व किया है. कई अध्ययनों से इस रिसेप्टर के cytoplasmic पूंछ बारी में रिसेप्टर गतिशीलता 12,40 के लिए एक बाड़ के रूप में कार्य करता है जो झिल्ली कंकाल के साथ सूचना का आदान प्रदान से पता चला कि. टीएफआर-GFP व्यक्त एक चो सेल का एक प्रतिनिधि TIRF छवि prese हैचित्रा 5 ब में nted. झिल्ली देशी हालत और कम से कम है अधिक अभिव्यक्ति से संबंधित कलाकृतियों की संभावना के करीब है के रूप में कम प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं, प्राथमिकता दी जानी चाहिए. इसके अलावा, सेल के मध्य भाग मौजूद हो सकता है (कोशिका द्रव्य से, उदाहरण के लिए) बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति के प्रभाव के रूप में, बचा जाना चाहिए. जैसी कि उम्मीद थी मापा प्रसार कानून टीएफआर-GFP के लिए (चित्रा 5C) 0.2 माइक्रोन से 2 नीचे स्पष्ट diffusivity में फलस्वरूप तेजी से कमी के द्वारा पीछा किया, के बारे में 0.7 माइक्रोन 2 सेकंड -1 की औसत विकास अनुप्रयोग के साथ, 100 एनएम से नीचे पहली बार एक फ्लैट व्यवहार से पता चलता है सेक -1 (मूल्य आम तौर से मापा विवर्तन सीमित एफसीएस 12). यह परिणाम हमारे दृष्टिकोण आसानी नैनोमीटर की कुछ दसियों के एक संकल्प के साथ GFP लेबल प्रोटीन की औसत विस्थापन उपाय कर सकते हैं कि पता चलता है. इसके अलावा डी अनुप्रयोग शुरू होता है, जिस पर स्थानिक पैमाने सेट विशेषता कम करने के लिएपिछले अनुमान 6 के साथ ध्यान में रखते हुए लगभग 120 एनएम पर झिल्ली कंकाल से प्रोटीन आंशिक कारावास की स्थानिक पैमाने,.

चित्रा 1
बात फैल समारोह चित्रा 1 अंशांकन. (ए) एक अलग मनका और मोती समुच्चय के pseudocolor छवि. एक अलग मनका की तीव्रता प्रोफ़ाइल (बी) 3 डी साजिश एक अच्छी तरह से परिभाषित गाऊसी प्रोफाइल से पता चलता है. (सी) एक गाऊसी समारोह से तीव्रता वितरण के फ़िट (ऊपरी पैनल) इसी बच (कम पैनल) के साथ. फिट वितरण और मापा तीव्रता प्रोफाइल के बीच अच्छा समझौता भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाई पीएसएफ एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated किया जा सकता है कि एक सबूत है. छठे के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण EW.

चित्रा 2
फोटॉनों के लिए कैमरा प्रतिक्रिया की चित्रा 2 अंशांकन. आंकड़ा फसली सेंसर मोड में एक 32 x 128 आरओआई में कैमरा पृष्ठभूमि, जोखिम 0.5 मिसे, के लिए डिजिटल स्तर (डीएल) वितरण से पता चलता है. लगभग 180 डीएल पर पीक कोई फोटॉनों को कैमरे प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. विशेष रूप से, यह एनालॉग से डिजिटल (ई) कनवर्टर के योगदान का प्रतिनिधित्व करता है और ऑफसेट और संकेत रिकॉर्डिंग द्वारा शुरू विचरण अनुमान लगाने के लिए एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated किया जा सकता है. 200 डीएल से ऊपर डिजिटल स्तर का वितरण घातीय हो जाता है और एक फोटान के लिए औसत कैमरा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. इन मानकों का मापन अधिग्रहण के दौरान दर्ज की गई हैं कि फोटॉनों के घनत्व का आकलन की अनुमति देता है.एस / ftp_upload / 51994 / 51994fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
विधि की चित्रा 3 Schematization. (ए) EMCCD कैमरे द्वारा व्यापक क्षेत्र इमेजिंग TIRF microcopy प्लाज्मा झिल्ली की सटीक ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रदान करने के लिए शोषण किया जाता है, जबकि उप millisecond संकल्प तक पहुँचने के लिए लागू किया जाता है. (बी) छवियों के परिणामस्वरूप ढेर औसत स्थानिक गणना के क्रम में autocorrelated है -temporal सहसंबंध समारोह. इस संबंध समारोह में अच्छी तरह से एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated है (परिचय देखें) और यह कण विस्थापन के अनुसार समय में बाहर फैलता है. (सी) इस प्रकार, कारण आणविक विस्थापन के लिए सहसंबंध समारोह के प्रसार यों के क्रम में, एक गॉस के साथ फिटिंग इयान समारोह किया जाता है. यह औसत विस्थापन साजिश बनाम स्पष्ट diffusivity के रूप में, सीधे इमेजिंग से आणविक 'प्रसार कानून' को मापने के लिए अनुमति देता है. (डी) धन्यवाद इस साजिश के लिए, आणविक प्रसार मोड सीधे बारे में एक अर्थ का मॉडल या मान्यताओं के लिए कोई जरूरत के साथ पहचाना जा सकता है झिल्ली के स्थानिक संगठन. उनकी गतिशीलता माप के स्थानिक पैमाने पर निर्भर नहीं करता है के रूप में वास्तव में, स्वतंत्र रूप से diffusing अणु एक निरंतर स्पष्ट diffusivity प्रदर्शित करेगा. इसके विपरीत, आंशिक रूप से सीमित अणुओं कारावास आकार की तुलना में छोटे विस्थापन के लिए एक काफी स्थिर स्पष्ट diffusivity प्रदर्शित करेगा, तो कारावास आकार से भी बड़ा स्थानिक तराजू के लिए एक कम diffusivity. संबंधित स्थानिक पैमाने कारावास की स्थानिक विस्तार का अनुमान किया जा सकता है जबकि इस प्रकार, स्पष्ट diffusivity में कमी की उपस्थिति, क्षणिक कारावास की एक अंगुली की छाप के रूप में व्याख्या की जा सकती है. .jove.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 51994 / 51994fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
जीवित कोशिका झिल्ली में चित्रा 4 ATTO488-पीपीई प्रसार कानून (ए) कोशिका झिल्ली में ATTO488-पीपीई प्रविष्टि की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (बी) ATTO488-पीपीई के साथ लेबल चो बेसल झिल्ली के TIRF छवि:.. एक रॉय (लाल बॉक्स) का चयन किया है चयनित आरओआई में मापा प्रसार कानून इस घटक के लिए एक नि: शुल्क प्रसार मॉडल की पुष्टि एक फ्लैट व्यवहार से पता चलता सेल सीमा और अत्यधिक फ्लोरोसेंट स्पॉट से बचने सेल के ज्यादातर वर्दी भाग में. (सी). का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

हमेशा ">:" रखने together.within पृष्ठ = के लिए "jove_content चित्रा 5
जीवित कोशिका झिल्ली में चित्रा 5 टीएफआर-GFP प्रसार कानून (ए) कोशिका झिल्ली में टीएफआर-GFP प्रविष्टि की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व:. रिसेप्टर के cytoplasmic पूंछ रिसेप्टर गतिशीलता के लिए एक बाड़ के रूप में कार्य करता है कि झिल्ली कंकाल के साथ सूचना का आदान प्रदान (बी. ) चो व्यक्त टीएफआर-GFP के TIRF छवि: एक आरओआई कारण overexpression को कलाकृतियों से बचने के लिए कम व्यक्त कोशिकाओं पसंद चयन किया जाता है (सी) टीएफआर (काले बिंदु के प्रसार कानून), पीपीई के विपरीत (ग्रे लाइन,) चित्रा 4 से ली गई है,. पहली बार एक फ्लैट भाग डी अनुप्रयोग में कमी के बाद है जहां आंशिक रूप से सीमित प्रसार के विशिष्ट व्यवहार. शो इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक कण ट्रैकिंग (SPT) आणविक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सबसे आम रणनीतियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है और यह कण trajectories मापने के महान लाभ है. यह बदले में एक जटिल प्रणाली में भी कुछ लेबल कणों के व्यवहार की जांच की अनुमति देता है. हालांकि, SPT आम तौर पर जांच और बहुत उज्ज्वल लेबल के एक कम घनत्व की जरूरत है यह लाभ तक पहुँचने के लिए. प्रणाली में उत्पादन, लेबलिंग और प्रविष्टि की एक जटिल प्रक्रिया के लिए आवश्यक है कि इस मामले में: विशेष रूप से, उच्च अस्थायी समाधान (μsec रेंज) अकार्बनिक जांच आम तौर पर आवश्यक हैं (उदाहरण के लिए, क्वांटम डॉट्स या धातु नैनोकणों) हासिल करने के लिए. SPT की तुलना में वर्तमान विधि कुछ महत्वपूर्ण लाभ से पता चलता है. सबसे पहले, इस दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, SPT की तुलना में एक उच्च अस्थायी समाधान फोटॉनों की कम राशि के लिए धन्यवाद (एक ही लेबल पर) हासिल की है 34 की आवश्यकता है. विस्तार से अधिक है, इस संपत्ति अस्थायी Resol धकेलने की अनुमति देता है10 से नीचे ution - 3 सेकंड भी encodable फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करते समय, और इस timescale झिल्ली घटक के nanoscale गतिशीलता के लिए विशेष पहुँच देता है. अंत में, यह आणविक प्रसार कानूनों प्रत्येक अणु को ट्रैक करने के लिए कोई जरूरत के साथ, पूरा समय अंतरिक्ष सहसंबंध समारोह का विश्लेषण करके बताए गए ध्यान देने योग्य है.

STED आधारित एफसीएस के साथ तुलना भी दिलचस्प है. एक STED-एफसीएस माप में अवलोकन मात्रा में कम करने के लिए अणुओं की औसत पारगमन समय प्रतिदीप्ति संकेत के अस्थायी सहसंबंध द्वारा मापा जाता है. यह भी विवर्तन सीमा से नीचे आणविक गतिशीलता की एक स्थानीय माप प्राप्त करने की अनुमति देता है. प्रस्तुत दृष्टिकोण में प्रसार कानून मानक, विवर्तन सीमित, अवलोकन मात्रा के माध्यम से मनाया चयनित आरओआई में आगे बढ़ सभी कणों का औसत, के रूप में मापा जाता है. लेकिन, परिणाम इस विधि विवर्तन द्वारा सीमित नहीं दिखाना है कि है, लेकिन केवल वें द्वारा रिपोर्टई अस्थायी समाधान उपलब्ध. एक विवर्तन सीमित अधिग्रहण अच्छी तरह विवर्तन सीमा से नीचे (तुलनात्मक रूप से इस तरह के पाम और तूफान के रूप में अन्य सुपर संकल्प तकनीक, में किया जाता है क्या करने के लिए) के उतार चढ़ाव, आणविक विस्थापन का पता लगाने के लिए किया जाता है, हालांकि वास्तव में, के रूप में पहले से ही, (सीधे) हो गणना कर सकते हैं आणविक मापने के लिए stics का उपयोग करके प्रदर्शन 32 बहती है. इसके अलावा, STED-एफसीएस के विपरीत, इस दृष्टिकोण आसानी से ऐसे रेखापुंज स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी या वाइड फील्ड कैमरा आधारित सूक्ष्मदर्शी के रूप में वाणिज्यिक और मौजूदा माइक्रोस्कोपी setups, की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. यह आणविक प्रसार कानूनों की STED-एफसीएस माप सख्ती वाद्य कमर के आकार का एक फ्लोरोफोरे निर्भर अंशांकन आवश्यकता है कि उल्लेख के योग्य है. Oppositely, माप (कण आकार के आकलन के लिए केवल आवश्यक) एक प्रणाली अंशांकन आवश्यकता नहीं है यहाँ प्रस्तुत किया.

प्रस्तुत विधि डे द्वारा कण विस्थापन की माप में वास्तविक संकल्पहम सहसंबंध समारोह उपाय कर सकते हैं कैसे सही पर pends. नतीजतन, यह स्वाभाविक तुलनात्मक संकल्प कण "छवि" मापा जाता है सही कैसे पर निर्भर करता है, जहां SPT मामले को, विवर्तन द्वारा सीमित नहीं है. प्रस्तावित प्रयोगों के लिए कम से कम 1 मिनट में एक महत्वपूर्ण संबंध को मापने के लिए, प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक कण के लिए कुछ फोटॉनों (आमतौर पर 10 से नीचे फोटॉनों) पर्याप्त हैं. सहसंबंध समारोह गणना की है जब वास्तव में, सभी मनाया कणों का योगदान कणों अलग नहीं कर रहे हैं, भले ही एक साथ औसत निकाला जाता है. इस संपत्ति अस्थिरता सहसंबंध तरीकों की आंतरिक है और इस तरह के जीवित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में मंद और घने लेबल, का उपयोग की अनुमति देता है.

इसे ध्यान में रखते यह न्यूनतम औसत दर्जे का विस्थापन कण की diffusivity पर और इमेजिंग की स्थापना के समय संकल्प पर निर्भर करता है कि स्पष्ट दिखाई देता है. एक उदाहरण के रूप में, कोशिका झिल्ली पर अणुओं के प्रसार पर विचार करें,प्रोटीन या लिपिड के लिए अधिकतम मापा diffusivity लगभग 5 माइक्रोन 2 सेकंड -1 है जहां. इन शर्तों के तहत, हम 50 एनएम के एक औसत विस्थापन को पकड़ने के लिए लगभग 10 -4 सेकंड के समय संकल्प की जरूरत है. यहाँ से पता चला है के रूप में इस बार संकल्प, एकल लाइनों के साथ या समय संकल्प जोखिम समय तक मेल खाता है जहां तेजी EMCCD कैमरा, द्वारा तेजी से स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

सही रूप में आणविक गतिशीलता का वर्णन करने के लिए इस विधि के लिए एक अतिरिक्त अनिवार्य आवश्यकता एक सही स्थानिक नमूना है. वास्तव में, सहसंबंध समारोह फिट करने के क्रम में हम महत्वपूर्ण भूमिका निभाई पीएसएफ की कमर से कम एक स्थानिक नमूना (पिक्सेल आकार) की जरूरत है. सबसे वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी (confocal या व्यापक क्षेत्र) में, पीएसएफ कमर 200 एनएम से 500 एनएम तक फैला (प्रयुक्त चयनित उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर पर और तरंग दैर्ध्य पर मुख्य रूप से निर्भर करता है) और आसानी से एक अंशांकन प्रयोग का उपयोग नैनो से मापा जा सकता है आकार फ्लोरोसेंट मोती. टीपति, (वी कमर से 3 गुना कम) 70-150 एनएम के एक पिक्सेल आकार पर्याप्त हो सकता है. हालांकि, पिक्सेल आकार के खाते में एक सरल नियम लेने अध्ययन के तहत प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है: सहसंबंध समारोह के विवरण में पिक्सेल आकार, उच्च सटीकता कम है. इसके अलावा, हासिल किया जा करने के लिए छवि का न्यूनतम आकार ब्याज की अधिकतम विस्थापन (प्लस वाद्य कमर) की तुलना में कम से कम 3 गुना बड़ा हो गया है. इस फिटिंग एल्गोरिथ्म का एक अच्छा अभिसरण और आणविक displacements के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नमूना तक पहुँचने के लिए आवश्यक है. एक उदाहरण के रूप में, नैनोमीटर के कुछ सैकड़ों (जैसे, 200 एनएम) कुछ माइक्रोन की एक छवि का आकार काफी है की तुलना में छोटे औसत आणविक विस्थापन का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, सहसंबंध समारोह की गुणवत्ता पर प्रभाव डालता है (निरंतर पिक्सेल आकार ले रही है) पिक्सल की कुल संख्या. वास्तव में, एक बड़ी छवि भले ही समय resolut की कीमत पर, सहसंबंध समारोह में अधिक जानकारी के औसत की अनुमति देता हैआयन. यहां इस्तेमाल किया कैमरा आधारित प्रणाली के संबंध में, चिप पर पिक्सेल की शारीरिक आकार तय हो गई है कि कृपया ध्यान दें. नतीजतन, पिक्सेल आकार कम (पिक्सेल आकार के वर्ग पर निर्भर करता है कि) प्रत्येक पिक्सेल में संकेत कम करती देखने के क्षेत्र कम हो जाती है, और उच्च बढ़ाई बिजली की आवश्यकता है. दूसरी ओर, अवलोकन क्षेत्र पिक्सेल आकार आमतौर पर समय संकल्प की कीमत पर एक बढ़ा पिक्सेल संख्या में परिणाम कम तय हो गई है, जहां एक स्कैनिंग प्रणाली में.

इस्तेमाल किया डिटेक्टर के बारे में कुछ विवरण पर चर्चा किया जाना है. एकल फोटॉन डिटेक्टरों के विपरीत, EMCCD सिस्टम की वजह से एक ऑफसेट की उपस्थिति के लिए एकत्र प्रकाश को सीधे आनुपातिक नहीं है कि एक औसत तीव्रता (डिजिटल स्तर, डीएल) को मापने. ऑफसेट इस कैमरे की गतिशील रेंज की तुलना में कम है, यहां तक कि अगर और नगण्य कई फोटॉनों एकत्र कर रहे हैं, जहां प्रयोगों में (कुछ सौ 2 16 बिट readout 16 में की तुलना में), यह ध्यान में रखा जाना हैसहसंबंध समारोह का एक सही सामान्यीकरण प्राप्त करते हैं. इसके अलावा, एकत्र संकेत की राशि की पहचान करने के क्रम में कम रोशनी की स्थिति में एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ऑफसेट. इसके अलावा, अधिग्रहण के दौरान एकत्र कर रहे हैं कि फोटॉनों की औसत राशि का अनुमान लगाने के क्रम में, औसत डिजिटल स्तर प्रत्येक एकत्र फोटोन के लिए जुड़े मापा जाना है. यह मात्रा एक बहुत कम प्रकाश की तीव्रता को कैमरे के सामने बेनकाब कर लिया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कमरे में पृष्ठभूमि प्रकाश); वास्तव में, इस मामले में, हम यथोचित मापा तीव्रता शून्य या एक फोटान केवल से संबंधित हो सकता है यानी कि सिर्फ एक फोटॉनों, कैमरा तक पहुंचने की कल्पना कर सकते हैं.

अंत में, हमें कुछ वैकल्पिक अधिग्रहण प्रणाली (यानी, विभिन्न माइक्रोस्कोपी setups) प्रस्तुत माप प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर टिप्पणी करते हैं. सबसे पहले, 2 समीकरण में 'W'factor (उस वाद्य पीएसएफ के autocorrelation का प्रतिनिधित्व करता है) टी के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैप्रयोगात्मक सहसंबंध समारोह फिट करने के क्रम में इस्तेमाल किया वह विशेष अधिग्रहण प्रणाली. पहले 34 दिखाया गया है, एक आसान मामला स्कैनिंग गति कण गतिशीलता की तुलना में काफी अधिक है जब अधिग्रहण एक लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन कण है. ऐसे एक मामले में, वास्तव में, अधिग्रहण के समय के दौरान कणों के आंदोलन (यानी, लाइन समय) नगण्य माना जा सकता है और सहसंबंध समारोह में अच्छी तरह से एक गाऊसी समारोह द्वारा approximated है. उभरते इमेजिंग तकनीक के संदर्भ में एक दिलचस्प दृष्टिकोण नमूना 41 के माध्यम से बहुत पतली प्रकाश शीट (1-2 माइक्रोन) का उत्पादन करने की संभावना पर आधारित है. प्रकाश शीट 3 डी 42 में एक कैमरा आधारित अधिग्रहण प्रणाली, तेज ऑप्टिकल सेक्शनिंग के साथ संयुक्त एक भी नमूना में विमान (एकल विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी, SPIM) और, के चुनिंदा रोशनी की अनुमति देता है. क्योंकि इन विशेषताओं के, SPIM सफलतापूर्वक एफसीएस 43 के साथ संयुग्मित किया गया है और एक vali प्रतिनिधित्व कर सकता हैडी उपकरण ऐसे कोशिका द्रव्य या जीवित कोशिकाओं के नाभिक के रूप में 3 डी वातावरण, को प्रस्तुत विश्लेषण का विस्तार करने के लिए.

देखने का एक प्रयोगात्मक बिंदु से, सारांश इस दृष्टिकोण एक तेजी से अधिग्रहण मॉड्यूल के साथ सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप के लिए ही उपयोग की आवश्यकता है. ब्याज की प्रोटीन इस प्रकार बहुरंगा इमेजिंग के लिए भी अनुमति देता है, किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जैविक फ्लोरोफोरे साथ चिह्नित किया जा सकता है. इस संदर्भ में हम अणुओं के उप आबादी का चयन करें और लाइव कोशिका झिल्ली पर बातचीत और सह प्रसार प्रकट करने के लिए मैं एमएसडी विश्लेषण पार का उपयोग करने की संभावना कल्पना. अंत में, हम इस दृष्टिकोण प्लाज्मा झिल्ली पर nanodomains भीतर गतिशील विभाजन के दौर से गुजर प्रोटीन और / या लिपिड अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि विश्वास करते हैं. इस मामले में, nanodomains के उच्च चर आकार और जीवनकाल 2 रंग इमेजिंग सहित आगे पद्धति कार्यान्वयन की आवश्यकता होगी जो वास्तविक आंकड़ों में जटिलता का एक अतिरिक्त स्तर परिचय, स्थानीयविश्लेषण (जैसे, 2 डी जोड़ी सहसंबंध) और / या प्रतिदीप्ति anisotropy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iXon Ultra 897 Andor DU-897U-CS0
Solis Andor
CHO-K1 ATCC CCL-61
ATTO 488 labeled PPE ATTO-TEC GmbH AD 488-151
DOPE Avanti Polar Lipids, Inc. 850725
DOTAP Avanti Polar Lipids, Inc. 890890
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine Gibco 10378-016
DMEM/F-12 Gibco 21331
FBS Gibco 10082147
HEPES Gibco 15630-106 
PBS Gibco 10010-023
SimFCS 3.0 Globals Software the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 with TIRF modulus Leica
LAS AF Leica
Lipofectamine 2000 Lipofectamine 11668019
Matlab MathWork
ImageJ NIH
Name Company Catalog Number Comments
C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor OriGene RG200980
Agar Sigma Aldrich A5306
Chloroform Sigma Aldrich 528730
Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm Sigma Aldrich L5155
SONICA Ultrasonic Cleaners SOLTEC ETH S3
Petri Dishes Willco GWSt-3522
Bio-Format importer for Matlab http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Tools https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
Simulation by Matlab Tutorial https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
Simulation by SimFCS Tutorial https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Vereb, G., et al. yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).
  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
  4. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).
  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
  6. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).
  7. Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules. Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).
  8. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36, 176-182 (1999).
  9. Gielen, E., et al. Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy. C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).
  10. Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).
  11. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  12. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  13. Ries, J., Schwille, P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  14. Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS). Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).
  15. Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation. Biophys. J. 71, 410-420 (1996).
  16. Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise. Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).
  17. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).
  18. Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).
  19. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes. Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).
  20. Di Rienzo, C., et al. Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset. Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).
  21. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  22. Kannan, B., et al. Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy. Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).
  23. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).
  24. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3 (10), 793-795 (2006).
  25. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  26. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  27. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  28. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  29. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  30. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).
  31. Hedde, P. N., et al. Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells. Nat. Commun. 4, Forthcoming.
  32. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  33. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).
  34. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  35. Mueller, V., et al. STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells. Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).
  36. Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization. Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).
  37. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  38. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).
  39. Digman, M. A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).
  40. Ritchie, K., et al. Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking. Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).
  41. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, 229-236 (1993).
  42. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  43. Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 92 प्रतिदीप्ति प्रोटीन गतिशीलता लिपिड गतिशीलता झिल्ली विविधता क्षणिक कारावास एक अणु GFP
एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप में लाइव कोशिका झिल्ली पर आण्विक प्रसार कानून को फास्ट प्रतिदीप्ति इमेजिंग से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, … More

Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope. J. Vis. Exp. (92), e51994, doi:10.3791/51994 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter