Abstract
È diventato sempre più evidente che la distribuzione spaziale e il moto dei componenti della membrana, come i lipidi e le proteine sono fattori chiave nella regolazione di molte funzioni cellulari. Tuttavia, a causa della dinamica veloci e le minuscole strutture coinvolte, risoluzione spazio-temporale molto elevata è necessaria per catturare il reale comportamento delle molecole. Qui vi presentiamo il protocollo sperimentale per lo studio della dinamica delle proteine e dei lipidi plasmatici-membrana fluorescenza marcata nelle cellule vive con alta risoluzione spazio-temporale. In particolare, questo approccio non ha bisogno di tenere traccia di ogni molecola, ma calcola comportamento popolazione utilizzando tutte le molecole in una regione della membrana. Il punto di partenza è una immagine veloce di una regione determinata sulla membrana. Successivamente, una completa funzione di autocorrelazione spazio-temporale è calcolato correlando immagini acquisite ad aumentare i ritardi, per esempio ogni 2, 3, n ripetizioni. E 'possibile dimostrare che la larghezzadel picco dei spaziali aumenti funzione di autocorrelazione al crescente temporizzazione in funzione del movimento delle particelle a causa della diffusione. Pertanto, il montaggio della serie di funzioni di autocorrelazione consente di estrarre la proteina effettiva media cilindrata piazza da immagini (IMSD), qui presentato in forma di apparente diffusività vs spostamento medio. Questo produce una visione quantitativa della dinamica medi delle singole molecole con precisione nanometrica. Utilizzando una variante GFP-tagged della transferrina recettore (TFR) e un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (PPE) è possibile osservare la regolazione spazio-temporale di proteine e lipidi diffusione su micron-sized regioni membrana nell'intervallo di tempo di micro-to-milli-secondi.
Introduction
Partendo dal modello originale "mosaico fluido" di Singer e Nicolson, l'immagine di membrana plasmatica cellulare è stato costantemente aggiornato nel corso degli ultimi decenni, al fine di comprendere il ruolo emergente del citoscheletro e lipidi domini 1,2.
Le prime osservazioni sono state ottenute da recupero fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) svelamento che una frazione significativa di proteine di membrana è immobile 3-5. Questi studi pionieristici, anche se molto informativo, sofferto dalla relativamente scarsa risoluzione spaziale (micron) e di tempo (secondi) di configurazioni FRAP. Inoltre, essendo una misura media insieme, FRAP manca di dare informazioni sul comportamento singola molecola.
In questo contesto, la possibilità di etichettare specificamente una singola molecola di etichetta molto luminosi (permettono lo studio del processo di diffusione una molecola alla volta) ha avuto molto successo. In particolare, spingendo l'risoluzione temporale dell'approccio singola particella di monitoraggio (SPT) per i tempi microsecondi, Kusumi, et al. accesso maturata alle funzioni sconosciute della dinamica dei lipidi e delle proteine che grandemente contribuito al riconoscimento del ruolo di base di actina-membrana scheletro in membrana fisiologia 6 , 7. Questi risultati hanno generato il così chiamato il 'picchetto recinto e' il modello, in cui lipidi e proteine diffusione è regolata da scheletro a base actina-. Tuttavia, al fine di avere accesso alla enorme quantità di informazioni fornite da SPT molte questioni sperimentali devono essere affrontate. In particolare, la procedura di etichettatura è tipicamente composta da molte fasi come la produzione, la purificazione e l'introduzione di specie marcate nel sistema. Inoltre, le grandi etichette, come punti quantici o nanoparticelle metalliche, sono spesso necessari per raggiungere la scala cronologica inferiore al millisecondo e la reticolazione delle molecole bersaglio per l'etichetta non poteva essere evitato in molti casi. Infine, molte traiettoriedevono essere registrati per adattarsi criteri statistici e contemporaneamente è richiesta una bassa densità dell'etichetta per consentire il monitoraggio.
Rispetto a SPT, spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS), superando molti di questi inconvenienti, rappresenta un approccio molto promettente per studiare la dinamica molecolare. In realtà, FCS funziona bene anche con le etichette dim e densi, consentendo di studiare la dinamica di molecole proteiche-tag fluorescenti nelle cellule trasfettate. Inoltre, permette di raggiungere elevate statistiche in un periodo di tempo limitato. Infine, nonostante la densità "alta" delle etichette FCS fornisce informazioni di singole molecole. Grazie a tutte queste proprietà, FCS rappresenta un approccio molto semplice ed è stato ampiamente applicato a studiare la dinamica dei lipidi e proteine sia in membrane modello e in vivo cellule 8-10. Molti approcci diversi sono stati proposti per aumentare la capacità di FCS per rivelare i dettagli di diffusione molecolare. Per esempio, è stato shproprio che eseguendo FCS sulle aree di osservazione di diverse dimensioni si può definire un "diritto FCS diffusione" caratteristiche illuminanti nascosti del moto molecolare 11,12. Oltre ad essere variato in termini di dimensioni, l'area focale è stato ripetuto anche il 13, si trasferisce in uno spazio lungo le linee 14-20 o coniugati con telecamere veloci 21,22. L'utilizzo di questi correlazione 'spazio-temporale' approcci, parametri biologici rilevanti dei diversi componenti di membrana sono stati quantitativamente descritti su entrambe le membrane modello e quelle biologiche attuali, quindi visione cedimento in membrana organizzazione spaziale.
Tuttavia, in tutti gli FRAP e applicazioni FCS descritto finora la dimensione della zona focale rappresenta un limite di risoluzione spaziale che non può essere superata. Diversi metodi di imaging super-risoluzione sono state recentemente sviluppate per aggirare questo limite. Alcuni sono basati sulla precisione di localizzazione, come ad esempio stocastico la microscopia ottica ricostruzione (STORM) <sup> 23,24, la microscopia localizzazione fotoattivazione (PALM) 25, fluorescenza PALM (FPALM) 26, e single-particelle di tracking PALM (sptPALM) 27: relativamente grande quantità di fotoni necessari ad ogni snapshot, tuttavia, limita la risoluzione temporale di questi metodi per almeno diversi millisecondi, ostacolando così la loro applicabilità in vivo.
Al contrario, una promettente alternativa per Super Resolution Imaging sono stati aperti dal spazialmente modulando l'emissione di fluorescenza con i metodi di deplezione emissione stimolata (STED o reversibili saturabili transizioni ottiche di fluorescenza (RESOLFT)) 28,29. Questi approcci combinano la sagomatura del volume osservazione ben al di sotto del limite di diffrazione con la possibilità di utilizzare microscopi a scansione veloce e sistemi di rilevazione. In combinazione con l'analisi di fluorescenza fluttuazione, microscopia STED permesso di sondare direttamente le dinamiche spazio-temporali nanoscala di lipidi e proteins in membrane cellulari dal vivo 30,31.
Le stesse grandezze fisiche di microscopia basata STED possono essere ottenuti da un spettroscopia immagine correlazione spazio-temporale modificato (STICS 32,33) metodo che è adatto per lo studio della dinamica delle proteine fluorescenti-taggato membrana e / o lipidi in cellule vive e da un microscopio commerciale. Il protocollo sperimentale qui presentata è composta da pochi passi. Il primo richiede l'imaging veloce della regione di interesse sulla membrana. Poi, la pila risultante di immagini viene utilizzato per calcolare le funzioni di correlazione medi spazio-temporali. Con il montaggio della serie di funzioni di correlazione, la 'legge di diffusione' molecolare può essere ottenuto direttamente dalle immagini sotto forma di una diffusività apparente (D app) - vs medi di equipaggio grafico di spostamento. Questa trama dipende in modo critico l'ambiente esplorato dalle molecole e permette di riconoscere direttamente le modalità di diffusione attualidel lipide / proteina di interesse.
In più particolari, come precedentemente indicato 34, la funzione di autocorrelazione spazio-temporale della serie dell'immagine acquisita dipende in modo critico dalla dinamica delle molecole si muovono nella serie di immagini raccolte (si ricorda che lo stesso ragionamento può essere applicato in una linea di acquisizione dove solo una dimensione nello spazio è considerato). In particolare, si definisce la funzione di correlazione come:
(1)
dove 
rappresenta l'intensità di fluorescenza misurata nella posizione x, y, al tempo t, 
e 
rappresenta la distanza in x eindicazioni y rispettivamente, 
rappresenta l'intervallo di tempo, e 
rappresenta la media. Questa funzione può essere espressa come:
(2)
dove 'N' rappresenta il numero medio di molecole nella zona di osservazione, 
rappresenta l'operazione di convoluzione nello spazio, e 
rappresenta l'autocorrelazione della vita strumentale. Quest'ultimo può essere interpretato come una misura di quanto i fotoni di un singolo emettitore sono sparsi nello spazio a causa della configurazione ottica / registrazione (la cosiddetta Point Spread Function, PSF, geneRALLY ben approssimata da una funzione gaussiana). Infine, 
rappresenta la probabilità di trovare una particella a distanza e dopo un ritardo . Se consideriamo una dinamica diffusiva, in cui le particelle si muovono in modo casuale in tutte le direzioni e flussi netti non sono presenti, questa funzione è anche ben approssimata da una funzione gaussiana dove la varianza può essere identificato come il Mean Square Displacement (MSD) della particella in movimento . Così, la vita della funzione di correlazione (indicato anche come 
), Può essere definito come la somma dei DMS particelle e la vita strumentale e può essere misurata con una misura gaussianazione della funzione di correlazione per ogni ritardo. La misurato i MSD può essere usato per calcolare un diffusività apparente delle molecole in movimento 
e uno spostamento medio 
come:
(3)
(4)
Poche considerazioni sul setup sperimentale utilizzato può guidare il lettore attraverso i seguenti sezioni. Al fine di eccitare selettivamente i fluorofori sulla membrana basale delle cellule useremo una riflessione interna (TIR) illuminazione totale vivente, utilizzando una fluorescenza TIR commerciale (TIRF) microscopio (i dettagli si possono trovare nella sezione materiali). Inoltre, al fine di raccogliere the fluorescenza useremo un obiettivo ad alto ingrandimento (100X NA 1,47, alta apertura numerica è necessaria per l'illuminazione TIRF) e una fotocamera EMCCD (dimensione fisica del pixel sul chip 16 micron). Per raggiungere una dimensione di pixel di 100 nm applichiamo una lente di ingrandimento supplementare di 1.6X. Come discusso in seguito, una risoluzione temporale inferiore a 1 msec sarebbe necessario per descrivere correttamente le dinamiche di lipidi di membrana veloci sotto i 100 nm. Per raggiungere questa risoluzione temporale dobbiamo selezionare una regione di interesse (ROI) più piccolo dell'intero circuito integrato della fotocamera (512 x 512). In questo modo, la fotocamera leggerà un numero ridotto di linee aumentando la risoluzione temporale. Tuttavia, in questo regime lettura il lasso di tempo sarebbe limitata dal tempo necessario per spostare le cariche dalla esposizione al chip di lettura sulla fotocamera e di solito dell'ordine di millisecondi per 512 x 512 pixel EMCCD. Per battere questo limite, una tecnologia emergente consente di spostare le ROI linee solo che invece di tutta la struttura, won una riduzione effettiva pratica della dimensione del chip esposto (chiamata modalità ritagliata sensore nel nostro EMCCD). Per questa configurazione sia efficace, il chip di fuori della ROI deve essere coperta da una coppia di feritoie montati nel percorso ottico. Grazie a questa configurazione di risoluzione tempo fino a 10 -4 secondi può essere raggiunto. Si prega di notare, tuttavia, che questo approccio può essere accoppiato con molte diverse configurazioni sperimentali, come spiegato nella sezione 'discussione'.
Dimostrazione del metodo sarà fornito in cellule vive, utilizzando sia un ATTO488 contrassegnata con 1-palmitoil-2-idrossi-sn -glycero-3-fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) e una variante di GFP-etichetta della transferrina recettore (GFP TFR). Nel caso di ATTO488-PPE questo approccio può recuperare correttamente un'applicazione D pressoché costante in funzione di spostamento medio indica una diffusione prevalentemente libera, come precedentemente riportato 30,35. Al contrario, TFR-GFP mostra una diminuzione D
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Protocol
Calibrazione 1 Sistema
- Point Spread Function (PSF) calibrazione
- Diluire 10 ml di soluzione di 30 nm perline fluorescenti (circa 5 mM) in 90 ml di acqua distillata e poi sonicare la soluzione per 20 min. Tagliare un quadrato (1 cm x 1 cm) pezzo di gel di agarosio (3%) e deposito 10 microlitri della soluzione sulla superficie del gel. Capovolgere il pezzo di gel sul vetro fondo di un piatto 2 centimetri Petri e spremere la goccia sul vetro.
- Accendere il setup di acquisizione, mettere il campione nel supporto, impostare l'esposizione della fotocamera e EMgain (100 msec e 1.000 sono buoni parametri ma ottimizzano secondo il sistema) e attendere che la fotocamera si raffreddi.
- Impostare esposizione della fotocamera a 100 msec, fotocamera EMgain a 1.000, modalità di acquisizione al fotogramma Transfer, 100 ripetizione automatica e impostazione di risparmio.
- Usando l'oculare e la messa a fuoco luce trasmessa al confine del gel e quindi spostare l'obiettivo verso il centro del gel, regolare la messa a fuoco e start la procedura di allineamento laser (in LAS AF, selezionare 'installazione TIRF' e seguire la procedura di allineamento automatico).
- Trovare un campo di vista con isolati singoli punti, esattamente concentrarsi sul punto più luminoso (che di solito rappresenta perline aggregato) come riferimento, acquisire 100 fotogrammi e ripetere l'operazione 5-6 volte al fine di acquisire diversi punti singoli.
- Importare la serie acquisita ad un programma di elaborazione dei dati e la media dello stack nel tempo (Figura 1A) e selezionare una singola goccia isolato. Fare attenzione a selezionare i più piccoli per evitare di aggregati di particelle.
- Montare la distribuzione selezionata intensità (un esempio di singolo profilo perline è presentato in Figura 1B) con una funzione gaussiana con il comando "gaussfit" (negli strumenti ICS-Matlab nei Materiali in Matlab). Verificare la bontà del fit ispezionando i residui ottenuti (un esempio di profilo gaussiano attrezzata con i residui corrispondenti viene presentato in Figura 1B).
- Calibrazione della fotocamera
- Accendere la fotocamera e attendere che la fotocamera si raffreddi. Impostare l'impostazione di acquisizione della fotocamera, (vale a dire, per la fotocamera utilizzata impostiamo l'esposizione a 0.5 msec, fotocamera EMgain a 1.000, modalità di acquisizione alla modalità ritagliata, la dimensione del ROI di 32 x 128, 10.000 ripetizioni) e iniziare l'acquisizione del fondo telecamera segnale.
- Import acquisito serie telaio di un programma di elaborazione dei dati. Calcolare e controllare l'intensità media in ogni pixel per verificare che lo sfondo fotocamera circa piatto nella regione selezionata del chip. In modalità crea, rimuovere la prima e le ultime linee orizzontali (da 3 a 10 a seconda delle dimensioni della ROI) per ogni frame perché lo sfondo fotocamera è solitamente polarizzato nelle linee di confine.
- Creare un istogramma dei valori (definito anche livello digitale, DL) nelle immagini acquisite pila (usando il comando 'cron' in Matlab) e tracciare il logaritmodi conseguente frequenza (utilizzando il comando semilogy in Matlab). Un esempio di distribuzione DL per telecamera sfondo è presentata nella Figura 2.
NOTA: Se la fotocamera funziona bene, la trama mostra un picco di circa gaussiano (a profilo parabolico in log-scala) che rappresenta la distribuzione dei valori associati al fotone zero seguito da un decadimento esponenziale (una retta con pendenza negativa in log-scala ) che rappresenta la distribuzione dei valori associati a 1 fotone (Figura 2). In particolare, il centro e la varianza della funzione gaussiana rappresentano la telecamera di offset e l'errore, rispettivamente, mentre la costante di decadimento esponenziale della parte rappresenta una stima della DL assegnato dalla fotocamera per ogni singolo fotone. In Matlab utilizzare la sezione "CalibrateCamera" dello Script in materiali di supporto. - Ripetere l'operazione per tutti la telecamera selezionata EMGain e Gain.
2 etichettatiPreparazione delle cellule
- Per preparare i liposomi richiesti per incorporazione di lipidi 36, sciogliere separatamente 1 mg di DOPE (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina), 1 mg di DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano), e 1 mg di PPE-ATTO488 in 1 ml di cloroformio. Mescolare 0,5 ml di soluzione DOPE, 0,5 ml di soluzione di DOTAP, e 25 ml di soluzione di PPE-ATTO488 e secco sotto vuoto per 24 ore. Aggiungere 0,5 ml di tampone di HEPES 20 mM, vortex per 15 minuti e ultrasuoni per 15 min a 40 ° C.
- Per preparare la cella, lavare 3 volte con PBS un piatto p100 di confluenti CHO-K1 (ovaio di criceto cinese), aggiungere 1 ml di tripsina e conservare in incubatrice per 5 min. Sospendere le cellule staccate aggiungendo 9 ml di terreno DMEM / F12 supplementato con 10% di FBS e sementi 150 ml di soluzione di cellule in una capsula di Petri contenente 800 ml dello stesso terreno.
- Conservare in incubatore per 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Per incorporazione di lipidi, sostituire medio cella con 500microlitri di terreno privo di siero; dopo 30 min, aggiungere 2 ml di soluzione di liposomi; dopo 15 minuti di lavaggio con PSB e aggiungere nuovo medium DMEM / F12 per l'imaging.
- Per la trasfezione, le cellule trasfezione secondo il protocollo Lipofectamine (istruzioni del produttore) utilizzando TFR-GFP plasmide e conservare 24 ore in incubatrice prima di imaging.
3 Acquisizione Dati
- Preparazione di installazione
- Al fine di termostato al microscopio, 24 ore prima dell'esperimento accendere l'incubatore.
- Al fine di applicare il tempo di acquisizione più veloce realizzabile, opera in modalità ritagliata sensore (vedi introduzione) e utilizzare una prima telecamera per l'imaging (fotocamera 1) e seconda fotocamera per selezionare la cella (2 macchina fotografica). Uno schema di configurazione di setup è presentato in Figura supplementare S1. Poi, per allineare le due telecamere Accendere il microscopio e attendere che le telecamere si raffreddino.
- Situato su entrambe le fotocamere, i parametri per l'imaging luce trasmessa (cioè
- Mettere i campioni nel supporto e mettere a fuoco utilizzando oculare, inviare la luce alla telecamera 1 e spingere delicatamente le fessure che consentono la luce solo sul ROI utilizzato per l'imaging cellulare (qui un ROI di 32 x 32 pixel).
- Spostare una cella nella regione selezionata e trasmettere la luce alla telecamera 2, quindi disegnare una ROI nel software che controlla la telecamera 2 per avere un riferimento.
- Imaging (Figura 3A)
- Prima di tutto, allineare il laser TIRF secondo la procedura di configurazione. Nel nostro setup, selezionare il 'impostazione TIRF' e avviare la procedura di allineamento automatico. Quando il laser è allineato set 70 nm di profondità di penetrazione (circa 70 °).
- Impostare il tempo di esposizione di 70 msec e EMGain a 100 su entrambi videocamera 1 e la videocamera 2; quindi, selezionare una cella utilizzando la fotocamera 1, quindi inviare la luce fotocamera da 2 e mettere a fuoco con precisione la membrana cellulare. Impostare l'esposizione minima camera 2, 1000 EMGain, modalità corta del sensore, 10 5 ripetizioni e salvataggio automatico impostato come file FITS (Flexible Image Transport System, un formato che può essere facilmente gestito).
- Avviare l'acquisizione di registrare la serie di immagini. Rilasciare il guadagno e la modalità ritagliata per consentire la stabilizzazione della temperatura prima di acquisire una nuova cella, quindi ripetere gli ultimi due passaggi al fine di acquisire 8-10 cellule.
4 Calcolo del Mean Square Cilindrata da Imaging (i MSD)
NOTA: Il seguente protocollo può essere applicato direttamente ai dati grezzi. Allo stesso tempo, l'intero protocollo è valido per acquisizioni dati simulati sia in Matlab e in SimFCS. Il link per il tutorial corrispondenti si possono trovare nella sezione 'Materials'.
- Calcolo con Matlab
- Importare la serie acquisita Matlab utilizzando ImportImageSeries copione. Calcolare l'intensità media di ogni immagine nel tempo utilizzando il command dire sui primi 2 dimensioni e utilizzare complotto per vedere il vettore risultante.
- Se più del 10% di fotoscolorimento è presente, scartare la serie o rimuovere la prima parte di essi. Se è inferiore, provare a correggere l'effetto sulla funzione di correlazione sottraendo ad ogni immagine la sua intensità media, come mostrato prima 37.
- Calcolare l'intensità media di ciascun pixel mediante medio sulla terza dimensione e visualizzare l'immagine risultante.
NOTA: Particolare attenzione è richiesta al fine di evitare correlazioni artefatti. Infatti, come precedentemente indicato per tecniche simili 38, i bordi delle celle nonché su vescicole fuoco potrebbe introdurre una forte correlazione. Se l'ispezione di immagine media rivela i bordi delle celle o di vescicole fuoco, cercare di escludere la regione coinvolta altrimenti scartare l'acquisizione. Per correggere l'effetto di queste strutture immobili sottrarre l'intensità media temporale da ogni pixel 39. - Calcola tegli correlazione spazio-temporale (G (ξ, χ, τ)) utilizzando la funzione CalculateSTICScorrfunc. Rimuovere G (ξ, χ, 0) in quanto la correlazione a causa del rumore girato in regime di scarsa luminosità domina G (0,0,0); la correlazione dovuta al rivelatore domina la G (± 1,0,0), e il movimento delle particelle durante il tempo di esposizione potrebbe deformare G (ξ, χ, τ) per τ = 0, aumentando la vita misurata (questo effetto scompare per τ > 0) 34.
- Media G (ξ, χ, τ> 0) con un tempo-bin logaritmico per ridurre il rumore utilizzando la funzione "LogBinStack" per il sostegno materiale e poi montare il G risultante (ξ, χ, τ) utilizzando la funzione "gaussfit" di gli strumenti di ICS-Matlab nei Materiali per recuperare l'i MSD (la seconda colonna della matrice risultante).
- Tracciare la σ ottenuta vita (τ) 2 (i MSD) in funzione del tempo. Se i dati sono troppo rumorosi, cercare di aumentare il numero di acqucornici IRED, aumentano la potenza del laser, media più G (ξ, χ, τ) insieme.
- Calcolo da SimFCS
- Aprire i file acquisiti con ImageJ usando BIOFORMAT importatore plug-in e salvare serie acquisite Tiff sequenza.
- Aprire strumento SimFCS e selezionare RICS e selezionare File> Importa immagini multiple (complementare Figura S2).
- Selezionare Fit, inserire i parametri di acquisizione corretti e chiudere la finestra di misura (complementare figura S3).
- Selezionare Display> Intensità Media> CH1 e verificare la presenza di photobleaching (complementare figura S4).
- Se più del 10% di fotoscolorimento è presente scarti serie o se è possibile caricare nuovamente la sequenza di immagini rimuovendo la prima parte della serie.
- Se lo sbiancamento è inferiore del 10% selezionare Strumenti> i MSD> Impostazione dei parametri, controllare 'Usa media mobile', ambientato nel pannello ROI sulla sinistra unumero di telaio per il movimento attenzione media pagatore che il tempo corrispondente è superiore al tempo di diffusione caratteristica (per particella che si muove a 1 micron 2 sec -1 un tempo di 10 secondi è una buona media mobile)
- Selezionare Strumenti> IMSD> Calcola i MSD (Figura complementare S5) e in forma ed esportare la i MSD dalla memo pad (figura complementare S6).
5 Calcolo della Legge Diffusione del I MSD
- Montare i primi punti per estrapolare l'intercetta (σ 0 2) (5 punti sono sufficienti di solito, ma più punti possono essere montati se essi mostrano un comportamento lineare) e confrontare questo valore con il PSF precedentemente misurato 2. Se sono comparabili, sono state seguite le dinamiche di fluorofori isolate. Per contro, se σ 0 2 >> FPF 2 tentativo di acquisire velocemente per garantire chedinamiche non nascosti sono presenti 34.
- Calcolare la diffusività apparente (D app) e lo spostamento medio (R) utilizzando le equazioni 3 e 4 (vedi Introduzione).
- Terreno D app come funzione di R per ottenere una legge di diffusione paragonabile a quello che viene misurata con variazione posto a base FCS 12 (Figura 3D).
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Representative Results
Per calibrare la vita strumentale, l'immagine di una singola fluorescente nano-tallone può essere misura come descritto nel protocollo punto 1.1. Una tipica immagine fluorescente di queste perle è presentato in Figura 1. Il montaggio della distribuzione dell'intensità da una funzione gaussiana 2D restituisce buoni residui e permette che misura la vita strumentale a 270 nm. Questo valore è in buon accordo con il limite di diffrazione atteso stimato con l'equazione di Rayleigh. Questa taratura non è necessaria per la misura della dinamica delle particelle ma è necessario misurare la dimensione delle particelle apparente.
Una distribuzione di frequenza tipica di fotocamera sfondo è presentato in Figura 2. Il picco a circa 180 DL è dovuto alla risposta della fotocamera a nessun fotone, e rappresenta il contributo di analogico digitale (AD) convertitore. Questo contributo può essere approssimata da una distribuzione gaussiana per stimare l'offset e la varianzaintrodotto dalla registrazione del segnale. Sopra 200 DL la distribuzione del livello digitale diventa esponenziale (lineare in scala logaritmica) e rappresenta la risposta media fotocamera a un singolo fotone. Il fissaggio della piastra con una distribuzione esponenziale permette misure del DL media assegnata a ciascun singolo fotone. Più alto è il rapporto tra la DL media assegnata a ciascun fotone e l'errore convertitore AD, minore sarà il rumore in funzione di correlazione calcolato. Inoltre, la risposta media fotone singolo permette di stimare il range dinamico della telecamera.
Un diagramma della procedura sperimentale completo è riassunto in Figura 3 e un'immagine di inserimento Atto488-PPE nella membrana è rappresentato nella Figura 4A. Una immagine rappresentativa TIRF della membrana basale di un cellule CHO marcate con Atto488-PPE è presentato nella Figura 4B. Diversi punti luminosi possono essere presenti al di fuori della cellula a causa di liposomes impilati sul vetro. Essi possono essere scartati selezionando una ROI su una porzione della membrana prevalentemente uniforme della fluorescenza (cioè., La membrana plasmatica cellulare). Come previsto la legge di diffusione misurato (Figura 4C) per questo lipide è piatta, indicando una diffusione per lo più gratuiti come precedentemente dimostrato dalle misurazioni STED-FCS 30,35. Vale la pena ricordare che tutti i valori di spostamento indicati sono al di sotto del limite di diffrazione, indicando chiaramente la capacità di questo approccio a super-risoluzione spostamenti molecolari medi ben al di sotto del limite di diffrazione e fino a poche decine di nanometri.
Una schematizzazione di TfR-GFP inserimento dimero nella membrana è rappresentato nella Figura 5A. Molti studi hanno dimostrato che la coda citoplasmatica di questo recettore interagisce con lo scheletro membrana, che a sua volta agisce come un recinto per il 12,40 mobilità recettore. Una immagine rappresentativa TIRF di una cellula CHO che esprimono TFR-GFP è Presented nella Figura 5B. Cellule a bassa intensità di fluorescenza dovrebbe essere preferito, come la membrana è più vicino alla condizione nativa e la probabilità di artefatti collegati con la sovraespressione è minimizzato. Inoltre, la parte centrale della cella deve essere evitato, poiché gli effetti della fluorescenza fuori fuoco (dal citoplasma, per esempio) possono essere presenti. Come previsto la legge di diffusione misurato (Figura 5C) TFR-GFP mostra un primo piatto comportamento sotto i 100 nm, con una D app media di circa 0,7 micron 2 sec -1, seguito da conseguente rapida diminuzione diffusività apparente fino a 0,2 micron 2 sec -1 (il valore tipicamente misurata mediante diffrazione limitata FCS 12). Questo risultato dimostra che il nostro approccio può facilmente misurare lo spostamento medio di proteine marcate con GFP risoluzione di poche decine di nanometri. Inoltre la scala spaziale alla quale D app inizia a diminuire set la caratteristicascala spaziale delle proteine confinamento parziale scheletro membrana a circa 120 nm, in linea con le stime precedenti 6.
Figura 1 Calibrazione di Point Spread Function. (A) Pseudocolor immagine di un isolato di perle e perline aggregati. (B) grafico 3D del profilo di intensità di un cordone isolato mostra un profilo gaussiano ben definito. (C) Fit della distribuzione di intensità da una funzione gaussiana (pannello superiore) con i residui corrispondenti (pannello inferiore). Il buon accordo tra la distribuzione arredata e il profilo di intensità misurata è anche una prova che il PSF strumentale può essere approssimata da una funzione gaussiana. Cliccare qui a vi ew una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Calibrazione della risposta Fotocamera per singoli fotoni. La figura mostra la distribuzione di livello digitale (DL) per lo sfondo fotocamera in un 32 x 128 ROI, l'esposizione di 0,5 msec, in modalità corta del sensore. Il picco a circa 180 DL rappresenta la risposta della fotocamera a nessun fotoni. In particolare, esso rappresenta il contributo del convertitore analogico digitale (AD) e può essere approssimata da una funzione gaussiana per stimare l'offset e la varianza introdotto dalla registrazione del segnale. Sopra 200 DL la distribuzione dei livelli digitali diventa esponenziale e rappresenta la risposta media fotocamera a un singolo fotone. La misurazione di questi parametri permette di stimare la densità di fotoni che vengono registrati durante l'acquisizione.s / ftp_upload / 51994 / 51994fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Schematizzazione del metodo. (A) Ampio campo dell'imaging dalla fotocamera EMCCD viene applicata per raggiungere risoluzione sub-millisecondo, mentre TIRF microcopy viene sfruttata per fornire sezionamento ottico preciso della membrana plasmatica. (B) La pila risultante di immagini viene autocorrelato per calcolare la media spaziale funzione di correlazione -temporal. Questa funzione di correlazione è ben approssimata da una funzione gaussiana (vedere Introduzione) e si diffonde nel tempo secondo spostamenti di particelle. (C) Pertanto, al fine di quantificare la diffusione della funzione di correlazione dovuti allo spostamento molecolare, sagomata con un Gauss viene eseguita la funzione ian. Ciò consente di misurare la 'legge di diffusione' molecolare direttamente dalle immagini, in forma di apparente diffusività vs media grafico di spostamento. (D) Grazie a questa trama, le modalità di diffusione molecolare possono essere identificati direttamente senza la necessità di un modello interpretativo o ipotesi circa la organizzazione spaziale della membrana. Infatti, le molecole diffondenti liberamente visualizzano una diffusività apparente costante la loro mobilità non dipende scala spaziale della misura. Al contrario, le molecole parzialmente confinati visualizzano una diffusività apparente abbastanza costante per spostamenti più piccoli di dimensioni confino, poi una diffusività decrescente per scale spaziali più grandi di dimensioni confinamento. Così, l'aspetto di una riduzione della diffusività apparente può essere interpretato come una impronta digitale di confinamento transitoria, mentre la scala spaziale relativa può essere utilizzata per stimare l'estensione spaziale del confinamento. .jove.com / files / ftp_upload / 51994 / 51994fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Viene selezionato un ROI (riquadro rosso): Figura 4 legge ATTO488-PPE diffusione in membrane cellulari dal vivo (A) Rappresentazione schematica di inserimento ATTO488-PPE a membrana cellulare (B) immagine TIRF di CHO membrana basale marcato con ATTO488-PPE.. in una parte per lo più uniforme della cellula, evitando bordo della cella e le macchie altamente fluorescenti. (C) La legge diffusione misurata nella ROI selezionata mostra un comportamento piatto confermando un modello di diffusione gratuito per questa componente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura legge TfR 5.-GFP diffusione nelle membrane cellulari vivi (A) Rappresentazione schematica di inserimento TfR-GFP in membrana cellulare:. Coda citoplasmatica del recettore interagisce con lo scheletro membrana, che agisce come un recinto per la mobilità recettore (B. ) immagine TIRF di CHO che esprimono TFR-GFP: un ROI viene selezionato preferendo cellule che esprimono bassi per evitare artefatti dovuti alla sovraespressione (C) La legge diffusione del TFR (punti neri), a differenza di DPI (linea grigia, presa dalla Figura 4),. mostra il comportamento tipico di diffusione di parziale contenimento in cui una prima parte pianeggiante è seguito da una diminuzione D app. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
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Discussion
Tracciamento singola particella (SPT) rappresenta una delle strategie più comuni per lo studio della dinamica molecolare e ha il grande vantaggio di misurare traiettorie delle particelle. Questo a sua volta permette di sondare il comportamento anche di poche particelle etichettati in un sistema complesso. Tuttavia, per raggiungere questo vantaggio SPT bisogno tipicamente una bassa densità della sonda ed etichette molto luminosi. In particolare, per ottenere l'alta risoluzione temporale (intervallo msec) sonda inorganico è in genere necessario (ad esempio, i punti quantici o nanoparticelle metalliche): in questo caso è necessaria una procedura complessa di produzione, etichettatura e inserimento nel sistema. Rispetto al SPT presente metodo mostra alcuni vantaggi chiave. Prima di tutto, questo approccio può essere utilizzato in coniugazione con proteine fluorescenti. Quindi, rispetto a SPT, risoluzione temporale maggiore si ottiene (sulla stessa etichetta), grazie alla minore quantità di fotoni richiesto 34. Più in dettaglio, questa struttura permette spingendo il risol temporaleution sotto 10 - 3 secondi anche quando si utilizza proteine fluorescenti codificabili, e questo lasso di tempo dà accesso esclusivo alla dinamica su scala nanometrica dei costituenti della membrana. Infine, è opportuno notare che le leggi di diffusione molecolare sono descritte analizzando la piena funzione di correlazione spazio-tempo, senza necessità di monitorare ogni molecola.
Il confronto con sede a STED FCS è anche interessante. In una misura STED-FCS il tempo medio di transito di molecole per la riduzione dei volumi di osservazione è misurata dalla correlazione temporale del segnale di fluorescenza. Questo permette di ottenere una misura locale delle dinamiche molecolari anche al di sotto del limite di diffrazione. Nell'approccio presentato la legge di diffusione è misurato come la media di tutte le particelle in movimento nel ROI selezionata, osservato per mezzo di standard di diffrazione limitata, il volume osservazione. Tuttavia, hanno riportato risultati dimostrano che questo metodo non è limitato dalla diffrazione, ma solo da the risoluzione temporale disponibile. In realtà, anche se un'acquisizione di diffrazione limitata viene utilizzato per rilevare fluttuazioni (analogamente a quanto fatto in altre tecniche di super-risoluzione, come PALM e STORM), spostamenti molecolari ben al di sotto del limite di diffrazione può essere (direttamente) calcolato, come già dimostrata utilizzando TICHE per misurare flussi molecolare 32. Inoltre, a differenza STED-FCS, questo approccio può essere facilmente applicato a una vasta gamma di configurazioni di microscopia e commerciali esistenti, come microscopi a scansione raster o ampio campo microscopi basati su telecamere. E 'degno di menzione che le misure STED-FCS di leggi di diffusione molecolare rigorosamente richiedono una calibrazione fluoroforo-dipendente della dimensione della vita strumentale. Opposto, la misura qui presentato non necessita di calibrazione del sistema (necessario solo per la stima della dimensione delle particelle).
La risoluzione effettiva nella misurazione degli spostamenti delle particelle con il metodo de presentatopende su come possiamo misurare con precisione la funzione di correlazione. Di conseguenza, non è intrinsecamente limitato dalla diffrazione, analogamente al caso SPT in cui la risoluzione dipende dalla precisione con la "immagine" particella viene misurata. Per misurare una correlazione significativa in meno di 1 minuto per gli esperimenti proposti, pochi fotoni (di solito sotto i 10 fotoni) per ogni particella in ogni fotogramma sono sufficienti. Infatti, il contributo di tutte le particelle osservate è la media insieme quando si calcola la funzione di correlazione, anche se le particelle non sono isolati. Questa proprietà è intrinseca dei metodi di correlazione di fluttuazione e permette di utilizzare dim e densi etichette, come ad esempio le proteine fluorescenti trasfettate in cellule vive.
In questa prospettiva risulta evidente che lo spostamento minimo misurabile dipende dalla diffusività della particella e la risoluzione temporale del setup di imaging. Come esempio, perche diffusione delle molecole sulla membrana cellulare,dove la massima misurata diffusività per le proteine o lipidi è di circa 5 micron 2 sec -1. In queste condizioni, abbiamo bisogno di una risoluzione temporale di circa 10 -4 secondi per catturare uno spostamento medio di 50 nm. Questo risoluzione temporale può essere ottenuto microscopi veloce scansione lungo linee singole o con fotocamera EMCCD veloce, dove risoluzione temporale coincide per il tempo di esposizione, come mostrato qui.
Un ulteriore requisito essenziale per questo metodo di descrivere con precisione dinamica molecolare è un corretto campionamento spaziale. Infatti, al fine di adattare la funzione di correlazione occorre un campionamento spaziale (dimensione dei pixel) inferiore alla vita della PSF strumentale. Nella maggior parte dei microscopi commerciali (campo confocale o estesa), la vita FPF va da 200 nm a 500 nm (in funzione principalmente l'apertura numerica dell'obiettivo selezionato e dalla lunghezza d'onda utilizzata) e può essere facilmente misurata da un esperimento di calibrazione utilizzando nano perline fluorescenti dimensioni. Thus, una dimensione del pixel di 70-150 nm (3 volte inferiore rispetto alla vita strumentale) può essere sufficiente. Tuttavia, la dimensione dei pixel può essere adattato al sistema studiato tenendo conto di una regola semplice: ridurre la dimensione dei pixel, maggiore è la precisione nella descrizione della funzione di correlazione. Inoltre, la dimensione minima dell'immagine da acquisire deve essere almeno 3 volte più grande del massimo spostamento di interesse (più la vita strumentale). Questo è necessario al fine di raggiungere una buona convergenza dell'algoritmo raccordo e un campione statisticamente significativo di spostamenti molecolari. Ad esempio, per studiare spostamenti molecolari medi inferiori a qualche centinaia di nanometri (ad esempio 200 nm) una dimensione dell'immagine di pochi micron è sufficiente. Inoltre, il numero totale di pixel (prendendo la dimensione del pixel costanti) impatto sulla qualità della funzione di correlazione. Infatti, l'immagine ingrandita consente media ulteriori informazioni in funzione di correlazione, anche se a scapito del tempo Resolutione. Per quanto riguarda il sistema basato su telecamera-usato qui, si ricorda che la dimensione fisica del pixel sul chip è fisso. Di conseguenza, diminuendo la dimensione dei pixel diminuisce il segnale in ogni pixel (che dipende dal quadrato della dimensione dei pixel), riduce il campo visivo, e richiede una potenza maggiore ingrandimento. D'altra parte, in un sistema di scansione, dove l'area di osservazione è fisso, riducendo la dimensione dei pixel solito si traduce in un aumento del numero di pixel a scapito della risoluzione temporale.
Pochi dettagli circa il rivelatore utilizzato devono essere discussi. A differenza di rivelatori di singoli fotoni, sistemi EMCCD misurano un'intensità media (livello digitale, DL) che non è direttamente proporzionale alla luce raccolta a causa della presenza di un offset. Anche se questo offset è basso rispetto al range dinamico della telecamera (poche centinaia rispetto a 2 16 a 16 bit lettura) e trascurabile in esperimenti in cui sono raccolti molti fotoni, deve essere preso in considerazione perottenere una corretta normalizzazione della funzione di correlazione. Inoltre, può essere utilizzato come riferimento in condizioni di scarsa illuminazione per identificare la quantità di segnale raccolto l'offset. Inoltre, al fine di stimare la quantità media di fotoni che vengono raccolti durante l'acquisizione, il livello digitale medio associato a ciascun fotone raccolta deve essere misurato. Questa quantità può essere recuperato esporre la fotocamera a una bassa intensità di luce (ad esempio, la luce di sfondo in camera); infatti, in questo caso, si può ragionevolmente supporre che solo singoli fotoni raggiungono la telecamera, ossia l'intensità misurata può essere correlato al solo zero o uno fotone.
Infine, dobbiamo commentare come alcuni sistemi di acquisizione alternativi (ad esempio, diverse configurazioni microscopia) possono essere utilizzati per eseguire le misurazioni presentate. Prima di tutto, il 'W'factor in Equazione 2 (che rappresenta l'autocorrelazione della PSF strumentale) può essere adattato a tegli particolare sistema di acquisizione utilizzato per adattare la funzione di correlazione sperimentale. Come precedentemente illustrato 34, un caso semplice è l'acquisizione di Pentecoste un microscopio a scansione laser quando la velocità di scansione è significativamente superiore dinamica delle particelle. In tal caso, infatti, il movimento delle particelle durante il tempo di acquisizione (cioè, il tempo linea) può essere considerato trascurabile e la funzione di correlazione è ben approssimata da una funzione gaussiana. Nel contesto delle tecnologie di imaging emergenti, un approccio interessante è basato sulla possibilità di produrre lastre di luce molto sottili (1-2 micron) attraverso il campione 41. Il foglio di luce permette l'illuminazione selettiva di un solo piano (Single microscopia illuminazione piano, SPIM) nel campione e, combinato con un sistema di acquisizione basato su telecamera, sezionamento ottico veloce in 3D 42. A causa di queste caratteristiche, SPIM è stato coniugato con successo con FCS 43 e potrebbe rappresentare una valid utensile per estendere l'analisi presentata per ambienti 3D, come il citoplasma o nel nucleo delle cellule viventi.
Riassumendo, da un punto di vista sperimentale questo approccio richiede soltanto l'accesso ad un microscopio dotato di un modulo di acquisizione rapida. La proteina di interesse può essere etichettato con qualsiasi proteina fluorescente o fluoroforo organico, consentendo così anche per l'imaging multicolor. In questo contesto, prevediamo la possibilità di utilizzare l'analisi incrociata i MSD per selezionare sotto-popolazioni di molecole e rivelare interazioni e co-diffusione sulle membrane delle cellule vive. Infine, riteniamo che questo approccio può rappresentare un potente strumento per studiare le proteine e / o lipidi in fase di partizionamento dinamico all'interno nanodomini sulla membrana plasmatica. In questo caso, la dimensione altamente variabile e durata del nanodomini introducono un ulteriore livello di complessità nei dati reali che richiederebbe ulteriori implementazioni metodologiche tra cui l'imaging a 2 colori, localeanalisi (ad esempio, coppia correlazione 2D) e / o fluorescenza anisotropia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon Ultra 897 | Andor | DU-897U-CS0 | |
| Solis | Andor | ||
| CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| ATTO 488 labeled PPE | ATTO-TEC GmbH | AD 488-151 | |
| DOPE | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850725 | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids, Inc. | 890890 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331 | |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| HEPES | Gibco | 15630-106 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| SimFCS 3.0 | Globals Software | the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/ | |
| DMI6000 with TIRF modulus | Leica | ||
| LAS AF | Leica | ||
| Lipofectamine 2000 | Lipofectamine | 11668019 | |
| Matlab | MathWork | ||
| ImageJ | NIH |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor | OriGene | RG200980 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A5306 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 528730 | |
| Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm | Sigma Aldrich | L5155 | |
| SONICA Ultrasonic Cleaners | SOLTEC | ETH S3 | |
| Petri Dishes | Willco | GWSt-3522 | |
| Bio-Format importer for Matlab | http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/ | ||
| ICS-MatLab Tools | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip | ||
| Simulation by Matlab Tutorial | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html | ||
| Simulation by SimFCS Tutorial | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt |
References
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