Abstract
Tornou-se cada vez mais evidente que a distribuição espacial eo movimento de componentes da membrana, como lipídios e proteínas são fatores-chave na regulação de muitas funções celulares. No entanto, devido à dinâmica rápida e as pequenas estruturas envolvidas, uma resolução espaço-temporal muito elevada é necessário para captar o comportamento real do moléculas. Aqui apresentamos o protocolo experimental para o estudo da dinâmica de proteínas e lipídios plasmáticos à membrana marcados com fluorescência em células vivas, com alta resolução espaço-temporal. Notavelmente, esta abordagem não é necessário para controlar cada molécula, mas calcula o comportamento população usando todas as moléculas numa dada região da membrana. O ponto de partida é uma imagem rápida de uma determinada região na membrana. Em seguida, uma função completa autocorrelação espaço-temporal é calculada correlacionando imagens adquiridas em aumentar os atrasos, por exemplo, a cada 2, 3, n repetições. É possível demonstrar que a largurado pico dos aumentos espaciais da função de autocorrelação em aumentar o tempo de atraso em função do movimento de partículas devido à difusão. Portanto, ajuste da série de funções de autocorrelação permite extrair a proteína real deslocamento médio quadrado de imagem (iMSD), aqui apresentada na forma de aparente diffusivity vs deslocamento médio. Isso gera uma visão quantitativa da dinâmica média de moléculas individuais com precisão nanométrica. Ao utilizar uma variante de GFP marcada com o Receptor de Transferrina (TfR) e uma ATTO488 identificada como 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (PPE), é possível observar a regulação espaço-temporal de proteína e lípido de difusão em regiões de membrana de tamanho micrometros de tempo na gama de micro-a-mili-segundo.
Introduction
A partir do "mosaico fluido" modelo original por Singer e Nicolson, a imagem da membrana plasmática celular tem sido continuamente atualizado durante as últimas décadas, a fim de incluir o papel emergente do citoesqueleto e lipídios domínios 1,2.
As primeiras observações foram obtidos por recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) revelação de que uma fração significativa de proteínas de membrana é imóvel 3-5. Estes estudos pioneiros, embora muito informativo, sofreu com a relativamente baixa resolução no espaço (microns) e de tempo (segundos) de setups FRAP. Além disso, sendo uma medição de média conjunto, FRAP falta em dar informações sobre o comportamento única molécula.
Neste contexto, a possibilidade de marcar especificamente uma única molécula com marcações muito brilhantes (permitindo o estudo do processo de difusão de uma molécula de cada vez), tem sido muito bem sucedida. Particularmente, empurrando otempo de resolução da abordagem única partícula Tracking (SPT) para a escala de tempo microssegundos, Kusumi, et al. acesso ganhou a recursos desconhecidos de lipídeos e proteínas dinâmica que muito contribuíram para o reconhecimento do papel do esqueleto da membrana à base de actina na fisiologia da membrana 6 , 7. Essas descobertas geraram a chamada do "piquete e cerca 'modelo, em que lipídios e proteínas difusão é regulada por esqueleto à base de actina. No entanto, a fim de ter acesso à enorme quantidade de informações fornecidas pelo SPT muitas questões experimentais têm de ser abordadas. Particularmente, o processo de marcação é tipicamente composta por várias etapas, como produção, purificação e introdução das espécies marcadas no sistema. Além disso, grandes gravadoras, como pontos quânticos ou nanopartículas de metal, muitas vezes são necessárias para alcançar a escala de tempo sub-milissegundo ea reticulação das moléculas alvo pelo rótulo não pode ser evitado em muitos casos. Finalmente, muitas trajetóriaster de ser de forma a caber critérios estatísticos e concomitantemente uma baixa densidade da etiqueta é necessária para permitir o rastreamento.
Comparado a SPT, espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), superando muitos destes inconvenientes, representa uma abordagem muito promissora para o estudo de dinâmica molecular. Na verdade, FCS funciona bem também com rótulos escuros e densos, permitindo estudar a dinâmica das moléculas marcadas em proteínas fluorescentes em células transfectadas transitoriamente. Além disso, permite alcançar altas estatísticas em uma quantidade limitada de tempo. Por fim, apesar da "alta" densidade de rótulos FCS fornece moléculas únicas informações. Graças a todas essas propriedades, FCS representa uma abordagem muito simples e tem sido amplamente utilizada no estudo da dinâmica de lipídeos e proteínas, tanto em membranas modelo e em células vivas 8-10. Muitas abordagens diferentes têm sido propostos para aumentar a capacidade de FCS para revelar os detalhes de difusão molecular. Por exemplo, foi shprópria, que através da realização FCS em áreas de observação de diferentes tamanhos pode-se definir uma "lei de difusão FCS" recursos escondidos esclarecedoras do movimento molecular 11,12. Além de ser variaram em tamanho, a área focal também foi duplicada 13, mudou-se no espaço ao longo das linhas 14-20 ou conjugadas com câmeras rápidas 21,22. Usando estes correlação 'espaço-temporal' abordagens, os parâmetros biológicos relevantes para vários componentes da membrana foram quantitativamente descrito em ambas as membranas modelo e as biológicas reais, portanto, uma visão rendimento em membrana de organização espacial.
No entanto, em todas as aplicações e FRAP FCS descrito até agora, a dimensão da área focal representa um limite de resolução espacial, em que não podem ser ultrapassados. Vários métodos de imagem de super-resolução foram recentemente desenvolvidos para contornar este limite. Alguns são baseados em precisão de localização, tais como microscopia óptica reconstrução estocástica (STORM) <sup> 23,24, microscopia fotoativação localização (PALM) 25, PALM fluorescência (FPALM) 26 e de uma única partícula de rastreamento PALM (sptPALM) 27: a quantidade relativamente grande de fótons necessários em cada snapshot, no entanto, limita o tempo de resolução de estes métodos para, pelo menos, vários milissegundos, prejudicando assim a sua aplicabilidade in vivo.
Em contraste, uma alternativa promissora para a resolução de imagem de super ter sido aberto por espacialmente modulando a emissão de fluorescência com os métodos de depleção de emissão estimulada (STED ou reversíveis transições saturáveis óptica de fluorescência (RESOLFT)) 28,29. Estas abordagens combinar a formação de um volume de observação bem abaixo do limite de difracção, com a possibilidade de utilização de microscópios varrimento rápido e sistemas de detecção. Em combinação com a análise de variação de fluorescência, microscopia STED permissão para investigar diretamente a dinâmica espaço-temporais em nanoescala de lipídeos e proteins em membranas de células vivas 30,31.
As mesmas quantidades físicas de microscopia-STED base pode ser obtida por uma espectroscopia modificado espaço-temporal correlação imagem (STICS 32,33) método que é adequado para o estudo da dinâmica das proteínas marcadas com fluorescência de membrana e / ou lípidos em células vivas e por um microscópio comercial. O protocolo experimental aqui apresentada é composta por poucos passos. O primeiro exige uma imagem rápida da região de interesse na membrana. Em seguida, a pilha resultante de imagens é usada para calcular as funções de correlação espaço-temporais médios. Ajustando-se a série de funções de correlação, a molecular "lei difusão" pode ser obtida directamente a partir de imagens na forma de uma difusividade aparente (D app) - vs -Média plotagem de deslocamento. Este lote depende criticamente sobre o meio ambiente explorado pelas moléculas e permite reconhecer diretamente os modos de difusão reaisdo lípido / proteína de interesse.
Em mais detalhes, como demonstrado anteriormente 34, a função de auto-correlação espaço-temporal da série imagem adquirida de forma crítica depende da dinâmica das moléculas em movimento na série de imagens coletadas (por favor, note que o mesmo raciocínio pode ser aplicado em uma aquisição de linha onde apenas uma dimensão do espaço é considerado). Em particular, podemos definir a função de correlação como:
(1)
onde 
representa a intensidade da fluorescência medida, na posição x, y e no momento t, 
e 
representa a distância em x edireções y respectivamente, 
representa o intervalo de tempo, e 
representa a média. Esta função pode ser expressa como:
(2)
onde "N" representa o número médio de moléculas na área de observação, 
representa a operação de convolução no espaço, e 
representa a autocorrelação da cintura instrumental. Este último pode ser interpretada como uma medida de como os fotões de um único emissor estão espalhados no espaço, devido à configuração óptica / gravação (o chamado ponto de propagação função, PSF, generali bem aproximada por uma função de Gauss). Finalmente, 
representa a probabilidade de encontrar uma partícula a uma distância e depois de um tempo de atraso . Se considerarmos uma dinâmica difusos, em que as partículas se movem aleatoriamente em todas as direções e fluxos líquidos não estão presentes, esta função também é bem aproximada por uma função de Gauss, onde a variância pode ser identificado como o Mean Square Deslocamento (MSD) da partícula em movimento . Assim, a cintura da função de correlação (também referida como 
), Pode ser definido como a soma das perturbações músculo-esqueléticas e de partículas da cintura instrumental e pode ser medido por um ajuste de Gaussção da função de correlação, para cada intervalo de tempo. A medida MSD i pode ser utilizada para calcular uma difusividade aparente das moléculas que se deslocam 
e uma média de deslocamento 
como:
(3)
(4)
Algumas considerações sobre a configuração experimental utilizada pode guiar o leitor ao longo das próximas seções. A fim de estimular selectivamente os fluoróforos na membrana basal de células que irão utilizar uma iluminação de reflexão interna total (TIR), vivo, usando uma fluorescência TIR comercial (TIRF) microscópio (detalhes podem ser encontrados na secção de material). Além disso, a fim de recolher the fluorescência usaremos um objectivo ampliação elevada (100X NA 1,47, abertura numérica elevada é necessária para a iluminação TIRF) e uma câmara EMCCD (tamanho físico do pixel no chip 16 mm). Para chegar a um tamanho de pixel de 100 nm, aplicamos uma lente de ampliação adicional de 1.6X. Como discutido abaixo, uma resolução temporal inferior a 1 ms seria necessário para descrever adequadamente a dinâmica dos lípidos da membrana rápidos abaixo de 100 nm. Para chegar a esta resolução temporal, precisamos selecionar uma região de interesse (ROI) menor do que todo o chip da câmera (512 x 512). Desta forma, a câmara irá ler um número reduzido de linhas de aumentar a resolução de tempo. No entanto, neste regime de tempo de leitura do quadro seria limitada pelo tempo necessário para mudar as taxas de exposição ao chip de leitura na câmara e é geralmente da ordem de milissegundos para 512 x 512 pixels EMCCD. Para vencer esse limite, uma tecnologia emergente permite deslocar as linhas de ROI só que ao invés de todo o quadro, wom uma redução efetiva prática do tamanho do chip exposto (chamado Modo Sensor recortada em nosso EMCCD). Para esta configuração para ser eficaz, o chip de fora do ROI deve ser coberta por um par de fendas montadas no caminho óptico. Graças a esta configuração de uma resolução de tempo até 10 segundos -4 pode ser alcançado. Observe, porém, que esta abordagem pode ser acoplado com muitas montagens experimentais diferentes, como explicado na seção "discussão".
Demonstração do método irá ser fornecida em células vivas, utilizando tanto uma ATTO488 identificada como 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) e uma variante marcada com GFP do Receptor de Transferrina (GFP TFT). No caso de ATTO488-PPE esta abordagem pode recuperar com sucesso um aplicativo D quase constante como uma função da média de deslocamento que indica uma difusão maior parte livre, como relatado anteriormente 30,35. Por contraste, o TfR-GFP demonstra uma diminuição D
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Protocol
Calibração do sistema 1.
- Espalhe Ponto de Função (PSF) de calibração
- Dilui-se 10 ul de solução de 30 nm talão fluorescente (cerca de 5 mM) em 90 mL de água destilada e, em seguida, sonicar a solução durante 20 min. Corte um quadrado (1 cm x 1 cm) de gel de agarose a peça (3%) e de depósito de 10 ul da solução sobre a superfície do gel. Derrubar o pedaço de gel no vidro de fundo de uma placa de Petri de dois centímetros e espremer a gota sobre o vidro.
- Ligue a configuração de aquisição, colocar a amostra no suporte, definir a exposição da câmera e EMgain (100 ms e 1000 são bons parâmetros, mas otimizar acordo com o sistema) e esperar que a câmara arrefecer.
- Defina a exposição da câmera para 100 ms, câmera EMgain para 1000, o modo de aquisição para o Quadro de Transferência, 100 repetição e auto definição de poupança.
- Usando a ocular e transmitida foco de luz, na fronteira com o gel e depois passar o objetivo para o centro do gel, ajustar o foco e start o procedimento de alinhamento a laser (em LAS AF, selecione 'setup TIRF "e siga o procedimento de alinhamento automático).
- Encontre um campo de visão com pontos isolados simples, precisa se concentrar no local mais brilhante (que geralmente representa contas agregado) como referência, adquirir 100 quadros e repita o passo 5-6 vezes, a fim de adquirir vários pontos individuais.
- Importe a série adquiriu a um programa de processamento de dados e, em média, a pilha no tempo (Figura 1A) e selecionar um único grânulo isolado. Tome o cuidado de selecionar os mais pequenos para evitar agregados de partículas.
- Coloque a distribuição selecionada intensidade (um exemplo único perfil contas é apresentado na Figura 1B) com uma função de Gauss usando o comando "gaussfit" (nas ferramentas ICS-Matlab nos Materiais em Matlab). Verificar a qualidade do ajuste, inspecionando os resíduos obtidos (um exemplo de perfil Gaussian equipada com os resíduos correspondentes é apresentado in Figura 1B).
- Calibração da câmara
- Ligue a câmera e espere que a câmara arrefecer. Defina a configuração de aquisição da câmera (ou seja, para a câmera usada montamos a exposição a 0,5 ms, câmera EMgain de 1000, o modo de aquisição de modo recortada, o tamanho do ROI de 32 x 128, 10.000 repetições) e começar a aquisição do fundo da câmara sinal.
- Importação adquirido série de quadros para um programa de processamento de dados. Calcule e verifique a intensidade média em cada pixel, a fim de verificar se o fundo da câmara é de aproximadamente plana na região selecionada do chip. No modo recortado, remover a primeira e as últimas linhas horizontais (3 a 10, dependendo do tamanho do ROI) para cada quadro, pois o fundo da câmara é normalmente enviesados nas linhas de fronteira.
- Criar um histograma dos valores (também definido Nível Digital, DL) em imagens adquiridas pilha (usando o comando 'hist' em Matlab) e traçar o logaritmoresultando de frequência (usando o comando semilogy em Matlab). Um exemplo de distribuição DL para o fundo da câmara é apresentado na Figura 2.
NOTA: Se a câmara está a funcionar bem, a trama vai mostrar um pico de cerca de Gauss (um perfil parabólico no diário de escala) representa a distribuição dos valores associados a zero fóton seguido de um decaimento exponencial (uma linha com inclinação negativa no log escala ) que representa a distribuição de valores associados a um fotão (Figura 2). Em particular, o centro e a variância da função de Gauss representam o deslocamento da câmara e erro, respectivamente, enquanto que a constante de decaimento exponencial da parte representa uma estimativa do DL atribuído pela câmara para cada um único fotão. Em Matlab use a seção "CalibrateCamera" do Script em materiais de apoio. - Repita a operação para toda a câmera selecionada EMGain e Gain.
2. RotuladoPreparação celular
- Para preparar os lipossomas necessários para a incorporação de lípido 36, dissolver separadamente 1 mg de DOPE (1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfoetanolamino), 1 mg de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano), e 1 mg de EPI-ATTO488 em 1 ml de clorofórmio. Misture 0,5 ml de solução de DOPE, 0,5 ml de solução de DOTAP, e 25 ul de solução de EPI-ATTO488 e seco sob vácuo durante 24 horas. Adicionar 0,5 ml de tampão HEPES 20 mM, vortex durante 15 min e sonicado durante 15 minutos a 40 ° C.
- Para preparar a célula, lavar 3 vezes com PBS, um prato p100 confluente de células CHO-K1 (ovário de hamster chinês), adicionar 1 ml de tripsina e armazenar na incubadora durante 5 min. Suspender as células isoladas adição de 9 ml de meio DMEM / F12 suplementado com 10% de FBS e semear 150 mL de solução de células em uma placa de Petri contendo 800 ul do mesmo meio.
- Loja na incubadora durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Para a incorporação de lípidos, substitua com meio de células 500ul de meio isento de soro; depois de 30 min, adicionar 2 ml de solução de lipossomas; após 15 minutos de lavagem com PSB e adicionar novo meio DMEM / F12 para geração de imagens.
- Para a transfecção, as células transfectar acordo com o protocolo Lipofectamina (as instruções do fabricante), utilizando TfR-GFP plasmídeo e loja 24 horas na incubadora antes de imagem.
3 Aquisição de Dados
- Preparação Setup
- A fim de o termostato microscópio, 24 h antes do experimento de ligar a incubadora.
- A fim de aplicar o tempo de aquisição mais rápido possível, trabalhar em modo Sensor recortada (ver introdução) e usar uma primeira câmera para imagens (câmera 1) e segunda câmera para selecionar a célula (câmera 2). Um esquema da configuração de instalação é apresentado na Figura Suplementar S1. Então, para alinhar a vez duas câmeras no microscópio e esperar que as câmeras para esfriar.
- Situado em ambas as câmaras os parâmetros para transmissão de imagens de luz (ou seja,
- Coloque as amostras no suporte e focar através da ocular, envie a luz para a câmera 1 e empurre as fendas permitindo que a luz apenas no ROI usado para imagens de células (aqui um ROI de 32 x 32 pixels).
- Mover uma célula na região seleccionada e enviar a luz para a câmara 2, então desenhar um ROI no software que controla câmara 2, a fim de ter uma referência.
- Imagem (Figura 3A)
- Primeiro de tudo, alinhe o laser TIRF de acordo com o procedimento de sua configuração. Em nossa configuração, selecione o 'setup TIRF' e iniciar o procedimento de alinhamento automático. Quando o laser é alinhado configurado 70 nm de profundidade de penetração (cerca de 70 °).
- Definir o tempo de exposição a 70 ms e EMGain a 100 em ambos câmera 1 e câmera de 2; em seguida, selecione uma célula usando a câmera 1, em seguida, enviar a luz na câmera 2 e focar com precisão a membrana celular. Defina a exposição mínima em caMera 2, 1000 EMGain, Modo Sensor Curta, 10 5 repetições e definir autosave como arquivos FITS (Flexible Image Transport System, um formato que pode ser facilmente gerenciado).
- Comece a aquisição de gravar a série imagem. Solte o ganho eo Modo cortada para permitir a estabilização da temperatura antes de adquirir um novo celular, em seguida, repita as duas últimas etapas, a fim de adquirir 8-10 células.
4 Cálculo do Mean Square Deslocamento de Imagem (i MSD)
NOTA: O protocolo a seguir podem ser aplicados diretamente aos dados brutos. Ao mesmo tempo, todo o protocolo é válido para aquisição de dados simulados tanto em Matlab e em SimFCS. O link para os tutoriais correspondentes podem ser encontradas na seção "Materiais".
- Cálculo pelo Matlab
- Importe a série adquiriu ao Matlab utilizando roteiro ImportImageSeries. Calcula-se a média de intensidade de cada imagem em tempo utilizando o command dizer sobre as duas primeiras dimensões e usar complô para ver o vetor resultante.
- Se mais do que 10% de foto-branqueamento se encontra presente, a série descartar ou remover a primeira parte deles. Se for inferior, tentar corrigir o efeito sobre a função de correlação, subtraindo a cada imagem sua intensidade média, como mostrado antes de 37.
- Calcule a intensidade média de cada pixel, utilizando média na terceira dimensão e ver imagem resultante.
É necessária uma atenção especial para evitar correlações de artefatos: NOTA. De fato, como demonstrado anteriormente por técnicas semelhantes 38, os contornos das células, bem como de vesículas foco poderia introduzir uma correlação forte. Se a inspecção da imagem média revela os contornos das células ou de vesículas de foco, tente excluir a região envolvida caso contrário descartar a aquisição. Para corrigir o efeito destas estruturas imóveis subtrair a intensidade média temporal de cada pixel 39. - Calcule tele correlação espaço-temporal (G (ξ, χ, τ)) usando a função CalculateSTICScorrfunc. Remover G (ξ, χ, 0), porque a correlação devido ao ruído tiro no regime de pouca luz domina G (0,0,0); a correlação devido ao detector domina o L (± 1,0,0), e o movimento das partículas durante o tempo de exposição pode deformar-se L (ξ, χ, τ) para τ = 0 através do aumento da cintura medida (este efeito desaparece para τ > 0) 34.
- Média G (ξ, χ, τ> 0), utilizando um time-bin logarítmica para reduzir o ruído usando a função "LogBinStack" no material de apoio e, em seguida, encaixar o G resultante (ξ, χ, τ), utilizando a função "gaussfit" de as ferramentas ICS-Matlab em Materiais para recuperar o i MSD (a segunda coluna da matriz resultante).
- Traça-se a σ obtido cintura (τ) 2 (i RIA) como uma função do tempo. Se os dados são muito barulhento, tentar aumentar o número de acququadros IRED, aumentar a potência do laser, a média mais G (ξ, χ, τ) juntos.
- Cálculo por SimFCS
- Abra os arquivos adquiridos com ImageJ usando BioFormat importador plugin e salvar séries adquiridas como Tiff sequência.
- Abrir ferramenta SimFCS e selecionar RICS e selecione Arquivo> Importar várias imagens (Figura S2 Suplementar).
- Selecione Fit, inserir os parâmetros de aquisição corretos e fechar a janela fit (Figura S3 Suplementar).
- Selecione Tela> Intensidade Média> CH1 e verificar a presença de fotodegradação (Figura S4 Suplementar).
- Se mais do que 10% de fotobranqueamento está presente descarte da série ou, se é possível a carga de novo a sequência de imagens de remover a primeira parte da série.
- Se o clareamento é inferior a 10% selecione Ferramentas> i MSD> Definir parâmetros, marque "Use média móvel ', situado no painel de ROI na esquerda umúmero de moldura para o pagamento de média móvel atenção que o tempo correspondente for maior do que o tempo de difusão característica (para partículas movendo-se a 1 mM 2 seg -1 um tempo de 10 segundos é um bom média móvel)
- Selecione Ferramentas> iMSD> Calcule i MSD (Figura Suplementar S5) e apto e exportar o i MSD a partir do bloco de notas (Figura Suplementar S6).
5 Cálculo da Lei de Difusão do i MSD
- Coloque os primeiros pontos para extrapolar a interceptação (σ 0 2) (5 pontos são geralmente suficiente, mas mais pontos podem ser montados se mostram um comportamento linear) e comparar esse valor com o PSF medido anteriormente 2. Se eles são comparáveis, a dinâmica de fluoróforos isolados estão sendo seguidas. Por outro lado, se σ 0 2 2 >> PSF tentar adquirir mais rápido para garantir quedinâmica não ocultas estão presentes 34.
- Calcule a difusividade aparente (app D) eo deslocamento médio (R), utilizando equações 3 e 4 (ver Introdução).
- App Lote D como uma função de R para se obter uma lei de difusão comparável com o que é medido com variação local baseada FCS 12 (Figura 3D).
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Representative Results
A fim de calibrar o instrumento de cintura, a imagem de um único nano-grânulo fluorescente pode ser medida como descrito no protocolo passo 1.1. A imagem de fluorescência típica destes grânulos é apresentada na Figura 1. O encaixe de distribuição de intensidade por uma função de Gauss 2D devolve boas resíduos e permite a medição da cintura instrumental a 270 nm. Este valor está em boa concordância com o limite de difracção esperado estimada pela equação de Rayleigh. Esta calibração não é necessário para a medição da dinâmica das partículas, mas é necessária para medir o tamanho de partícula aparente.
A distribuição de frequência típica de fundo da câmara é apresentado na Figura 2. Pico a cerca de 180 DL é devido à resposta a qualquer câmara de fotões, e representa a contribuição de analógico digital (AD) do conversor. Esta contribuição pode ser aproximada como uma distribuição de Gauss para estimar o deslocamento ea variânciaintroduzida pela gravação do sinal. Acima de 200 DL a distribuição do nível digital torna-se exponencial (linear em escala logarítmica) e representa a resposta média da câmera para um único fóton. Montagem esta parte com uma distribuição exponencial permite as medições da média DL atribuído a cada fotão único. Quanto maior é a proporção entre o limite de detecção médio atribuído a cada fotão e o conversor AD de erro, menor será o ruído na função de correlação calculado. Além disso, a resposta média de fotão único permite estimar o intervalo dinâmico da câmara.
Um diagrama do procedimento experimental completo encontra-se resumida na Figura 3 e uma imagem de inserção Atto488-EPP na membrana é representado na figura 4A. Uma imagem representativa TIRF da membrana basal de um células CHO marcadas com Atto488-PPE é apresentado na Figura 4B. Vários pontos brilhantes podem estar presentes fora da célula devido a liposomes empilhado sobre o vidro. Eles podem ser descartados por selecção de um ROI sobre uma porção de membrana principalmente uniforme da fluorescência (isto é., A membrana plasmática celular). Como esperado, a lei de difusão medido (Figura 4C) para esse lípido é plana, o que indica uma difusão maior parte livre como anteriormente demonstrado por medições STED-FCS 30,35. Vale ressaltar que todos os valores de deslocamento são apresentados abaixo do limite de difração, indicando claramente a capacidade desta abordagem para super-resolver deslocamentos moleculares médias bem abaixo do limite de difração e até algumas dezenas de nanômetros.
A esquematização da inserção dímero TfR-GFP para a membrana está representada na Figura 5A. Muitos estudos mostraram que a cauda citoplasmática de este receptor interage com o esqueleto da membrana, que por sua vez, actua como uma barreira para a mobilidade 12,40 receptor. Uma imagem representativa TIRF de uma célula CHO expressando TfR-GFP é presented na Figura 5B. As células de baixa intensidade de fluorescência, deve ser preferida, como a membrana é mais próximo do estado nativo e a probabilidade de artefactos relacionados com a expressão é minimizado. Além disso, a parte central da célula deve ser evitada, porque os efeitos de fluorescência para fora de foco (a partir de citoplasma, por exemplo) podem estar presentes. Como esperado, a lei de difusão medido (Figura 5C) para o TfR-GFP demonstra uma primeira conduta plana inferior a 100 nm, com uma média app D de cerca de 0,7 mM 2 seg -1, seguido pelo consequente diminuição rápida na difusividade aparente até 0,2 m 2 seg -1 (o valor normalmente medido por FCS 12 limitado por difração). Este resultado mostra que a nossa abordagem pode medir facilmente o deslocamento médio das proteínas GFP marcadas com uma resolução de algumas dezenas de nanometros. Além disso, a escala espacial na qual app D começa a diminuir sets a característicaescala espacial de proteína confinamento parcial pelo esqueleto da membrana em torno de 120 nm, de acordo com estimativas anteriores 6.
Figura 1 Calibração do Spread Function Point. (A) imagem de um pseudo-cordão e grânulos isolados agregados. (B) trama 3D do perfil de intensidade de um grânulo isolado mostra um perfil gaussiano bem definida. (C) Ajuste da distribuição de intensidade por uma função de Gauss (painel superior) com os resíduos correspondentes (painel inferior). A boa concordância entre a distribuição equipada eo perfil intensidade medida é também uma prova de que o PSF instrumental pode ser aproximada por uma função de Gauss. Clique aqui para vi ew uma versão maior dessa figura.
Figura 2 Calibração de resposta da câmera de fótons individuais. A figura mostra a distribuição de Nível Digital (DL) para o fundo da câmera em um ROI de 32 x 128, a exposição de 0,5 ms, no modo Sensor recortada. O pico a cerca de 180 DL representa a resposta da câmera para não fótons. Particularmente, representa a contribuição do conversor analógico digital (AD) e pode ser aproximado por uma função de Gauss para estimar o deslocamento e a variação introduzida pela gravação do sinal. Acima de 200 DL a distribuição dos níveis digitais torna-se exponencial e representa a resposta média da câmera para um único fóton. A medição destes parâmetros permite estimar a densidade de fótons que são registrados durante a aquisição.s / ftp_upload / 51994 / "target =" 51994fig2highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. esquematização de método. (A) imagem de campo amplo por câmara EMCCD é aplicada para alcançar resolução sub-milissegundos, enquanto TIRF microscopia é explorada para proporcionar o corte óptico precisa da membrana plasmática. (B) A pilha resultante de imagens é autocorrelacionada, a fim de calcular a média espacial função de correlação -temporal. Esta função de correlação é bem aproximada por uma função de Gauss (ver Introdução) e ela se espalha no tempo de acordo com os deslocamentos de partículas. (C) Assim, a fim de quantificar a propagação da função de correlação devido ao deslocamento molecular, combinando com a Gauss ian função é executada. Isto permite medir a molecular "lei difusão" diretamente de imagem, na forma de aparente diffusivity vs enredo média cilindrada. (D) Graças a esta trama, modos de difusão molecular pode ser diretamente identificado sem a necessidade de um modelo interpretativo ou suposições sobre o organização espacial da membrana. Na verdade, as moléculas que difundem livremente exibirá uma difusividade aparente constante como a sua mobilidade não depende da escala espacial da medição. Por outro lado, as moléculas parcialmente confinados exibirá uma difusividade aparente bastante constante para deslocamentos menores do que o tamanho de confinamento, em seguida, uma difusividade decrescente para escalas espaciais maiores que o tamanho do confinamento. Assim, o aparecimento de uma diminuição da difusividade aparente pode ser interpretado como uma impressão digital de confinamento transiente, enquanto que a escala espacial relacionada pode ser utilizado para estimar a extensão espacial do confinamento. .jove.com / files / ftp_upload / 51994 / "target =" 51994fig3highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 ATTO488-PPE lei de difusão em membranas de células vivas (A) Representação esquemática de ATTO488-PPE inserção na membrana celular (B) imagem TIRF de CHO membrana basal marcado com ATTO488-EPP.:. Um ROI (caixa vermelha) é selecionado em uma parte principalmente uniforme da célula, evitando borda da célula e manchas altamente fluorescentes. (C) A lei de difusão medido no ROI selecionado mostra um comportamento plano confirmando um modelo de difusão livre para esse componente. Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 5 TfR-GFP lei de difusão em membranas de células vivas (A) Representação esquemática de TfR-GFP inserção na membrana celular:. Da cauda citoplasmática do receptor interage com o esqueleto da membrana, que funciona como uma barreira para a mobilidade do receptor (B. ) TIRF imagem de CHO expressando o TfR-GFP: um ROI é seleccionado preferindo células que expressam baixos para evitar artefactos devido a sobre-expressão (C) A lei de difusão de TfR (pontos negros), ao contrário de PPE (linha cinzenta, feita a partir da Figura 4),. mostra o comportamento típico de difusão parcialmente fechados, onde a primeira parte plana é seguido por uma diminuição na aplicação D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Rastreamento de partículas Individual (SPT) representa uma das estratégias mais comuns para o estudo da dinâmica molecular e tem a grande vantagem de medir as trajetórias das partículas. Isto por sua vez permite que o comportamento de sondagem até poucas partículas marcadas em um sistema complexo. No entanto, para chegar a esta vantagem SPT normalmente precisa de uma baixa densidade da sonda e rótulos muito brilhantes. Em particular, para obter alta resolução temporal (gama ms) sonda inorgânico são normalmente necessários (por exemplo, quantum dots ou nanopartículas metálicas): neste caso, é necessário um procedimento complexo de produção, à rotulagem e inserção no sistema. Comparado com SPT o presente método apresenta algumas vantagens importantes. Em primeiro lugar, esta abordagem pode ser utilizada em conjugação com proteínas fluorescentes. Assim, em relação ao SPT, uma resolução temporal maior é alcançado (na mesma etiqueta), graças à menor quantidade de fótons necessários 34. Mais em pormenor, esta propriedade permite empurrar a resol temporaisution abaixo 10-3 seg também pelo uso de codificação de proteínas fluorescentes, e este calendário dá acesso exclusivo à dinâmica nanoescala de constituintes da membrana. Finalmente, é importante notar que as leis de difusão molecular são descritos através da análise da função de correlação completa do espaço-tempo, sem a necessidade de acompanhar cada molécula.
A comparação com FCS baseado em STED também é interessante. Numa medição STED-FCS a média de tempo de trânsito de moléculas para uma redução dos volumes de observação é medido pela correlação temporal do sinal de fluorescência. Isto permite a obtenção de uma medição de locais de dinâmica molecular, também abaixo do limite de difracção. Na abordagem apresentada a lei de difusão é medida como a média de todas as partículas em movimento no ROI seleccionado, observada por meio de padrão, de difracção limitada, o volume de observação. No entanto, relataram resultados demonstram que este método não é limitado pela difracção, mas apenas por the resolução temporal disponível. Na verdade, embora a aquisição limitado por difração é utilizado para detectar flutuações (de forma análoga ao que é feito em outras técnicas de super-resolução, como PALM e STORM), deslocamentos moleculares bem abaixo do limite de difração pode ser (diretamente) calculado, como já demonstrada utilizando STICS molecular para medir fluxos 32. Além disso, ao contrário STED-FCS, esta abordagem pode ser facilmente aplicada a uma ampla gama de configurações de microscopia e comerciais existentes, como os microscópios de varredura raster ou campo grande microscópios à base da câmera. É digno de menção que as medições STED-FCS de leis difusão molecular imperativamente uma calibração dependente do fluoróforo do tamanho da cintura instrumental. Ao contrário, a medição aqui apresentado não requer um sistema de calibragem (apenas necessário para a estimativa do tamanho da partícula).
A resolução real na medição de deslocamentos de partículas pelo método apresentado depende sobre a precisão que podemos medir a função de correlação. Por conseguinte, não é inerentemente limitada pela difracção, analogamente ao caso onde a resolução SPT depende da precisão com a "imagem" de partícula é medido. Para medir uma correlação significativa em menos de 1 min para as experiências propostas, poucos fotões (geralmente inferior a 10 fotões) de cada partícula de cada quadro são suficientes. Na verdade, a contribuição de todos os observados partículas é calculada a média em conjunto, quando a função de correlação é calculado, mesmo se as partículas não são isolados. Esta propriedade é intrínseca de métodos de correlação de flutuação e permite o uso de rótulos escuros e densos, tais como proteínas fluorescentes transfectadas em células vivas.
Com isto em mente, parece claro que o deslocamento mensurável mínimo depende da difusividade da partícula e na resolução de tempo de configuração de imagem. Como um exemplo, considere a difusão de moléculas na membrana da célula,onde a difusibilidade máxima medida para proteínas ou lípidos é de cerca de 5 m 2 seg -1. Sob estas condições, precisamos de uma resolução de tempo de cerca de 10 -4 segundos para pegar um deslocamento médio de 50 nm. Esta resolução de tempo pode ser conseguido através de microscópios de varredura rápida ao longo de linhas individuais ou por câmara EMCCD rápido, em que a resolução de tempo coincide com o tempo de exposição, como mostrado aqui.
Um requisito essencial adicional para este método de descrever com precisão a dinâmica molecular é uma amostragem espacial correta. Na verdade, a fim de se ajustar a função de correlação que precisa de uma amostragem espacial (tamanho do pixel) menor do que a cintura do PSF instrumental. Na maioria dos microscópios comerciais (campo confocal ou largura), a cintura PSF se estende a partir de 200 nm a 500 nm (dependendo principalmente da abertura numérica da objectiva seleccionada e do comprimento de onda utilizado) e pode ser facilmente medido por uma experiência de calibração utilizando nano partículas fluorescentes porte. Thus, um tamanho de pixel de 70-150 nm (3 vezes menor do que a cintura instrumental) pode ser suficiente. No entanto, o tamanho do pixel pode ser adaptado para o sistema em estudo, tendo em conta uma regra simples: reduzir o tamanho do pixel, o maior precisão na descrição da função de correlação. Além disso, o tamanho mínimo da imagem a ser adquirida tem de ser pelo menos 3 vezes maior do que o deslocamento máximo de interesse (além da cintura instrumental). Isto é requerido a fim de alcançar um bom convergência do algoritmo de ajuste e uma amostra estatisticamente significativa de deslocamentos moleculares. Como um exemplo, para estudar os deslocamentos moleculares médios menores do que algumas centenas de nanómetros (por exemplo, 200 nm), um tamanho de imagem de alguns micra é suficiente. Além disso, o número total de pixels (tendo o tamanho do pixel) constantes impactos sobre a qualidade da função de correlação. Na verdade, uma imagem maior permite uma média de mais informações na função de correlação, mesmo que à custa da RESOLUÇ tempoião. Quanto ao sistema baseado em câmera usada aqui, por favor, note que o tamanho físico do pixel do CCD é fixo. Consequentemente, diminuindo o tamanho do pixel reduz o sinal em cada pixel (que depende do quadrado do tamanho do pixel), diminui o campo de visão, e requer maior capacidade de ampliação. Por outro lado, em um sistema de varrimento, onde a área de observação é fixo, diminuindo o tamanho do pixel geralmente resulta num aumento do número de pixels, a expensas da resolução temporal.
Poucos detalhes sobre o detector utilizado tem que ser discutido. Ao contrário dos detectores de fotões único, sistemas EMCCD medir uma intensidade média (nível digital, DL) que não é directamente proporcional à luz recolhido devido à presença de um deslocamento. Mesmo que esse deslocamento é baixa em comparação com a gama dinâmica da câmara (algumas centenas de comparação a 2 em 16 de 16 bit de leitura) e negligenciável em experiências onde muitos fotões são recolhidos, tem de ser tida em conta paraobter uma normalização correcta da função de correlação. Além disso, o deslocamento pode ser usado como uma referência em condições de luz fraca, a fim de identificar a quantidade de sinal recolhido. Além disso, a fim de estimar a quantidade média de fótons que são coletados durante a aquisição, o nível digital média associada a cada fóton coletado tem de ser medido. Esta quantidade pode ser recuperado por expor a câmera à uma baixa intensidade de luz (por exemplo, a luz de fundo no quarto); Na verdade, neste caso, pode-se razoavelmente supor que os fótons individuais apenas alcançar a câmera, ou seja, a intensidade medida pode estar relacionada a apenas zero ou um fóton.
Finalmente, vamos comentar sobre a forma como alguns sistemas de aquisição de alternativa (ou seja, diferentes configurações de microscopia) pode ser usado para realizar as medições apresentadas. Primeiro de tudo, a 'W'factor na Equação 2 (que representa a autocorrelação do PSF instrumental) pode ser adaptado para tele determinado sistema de aquisição utilizado para ajustar a função de correlação experimental. Como demonstrado anteriormente 34, um caso fácil é a aquisição whit um microscópio de varredura a laser, quando a velocidade de digitalização é significativamente maior do que a dinâmica de partículas. Em tal caso, de facto, o movimento de partículas durante o tempo de aquisição (ou seja, tempo de linha) podem ser considerados negligenciáveis e a função de correlação é bem aproximada por uma função de Gauss. No contexto dos emergentes tecnologias de imagem, uma abordagem interessante é baseada na possibilidade de produzir folhas de luz muito finos (1-2 um) através da amostra 41. A folha de luz permite que a iluminação seletiva de um único plano (microscopia de iluminação um único plano, SPIM) na amostra e, combinado com um sistema de aquisição baseado em câmera, seccionamento óptico rápido em 3D 42. Devido a estas características, SPIM foi conjugado com sucesso com FCS 43 e poderia representar uma valid ferramenta para estender a análise apresentada para ambientes 3D, tal como do citoplasma ou no núcleo das células vivas.
Resumindo, a partir de um ponto de vista experimental, esta abordagem exige apenas o acesso a um microscópio equipado com um módulo de aquisição rápida. A proteína de interesse pode ser marcado com qualquer proteína fluorescente ou fluoróforo orgânica, permitindo, assim, também a imagem multicolor. Neste contexto, nós encaramos a possibilidade de usar cruzada análise i MSD para selecionar sub-populações de moléculas e revelam interações e co-difusão nas membranas de células vivas. Por fim, acreditamos que esta abordagem pode representar uma ferramenta poderosa para estudar proteínas e / ou lipídios submetidos a partição dinâmica dentro nanodomains na membrana plasmática. Neste caso, o tamanho altamente variável e vida útil dos nanodomains introduzir um nível adicional de complexidade em dados reais que exigiria novas implementações metodológicas, incluindo imagens de 2 cores, locaisanálise (por exemplo, a correlação 2D par) e / ou anisotropia de fluorescência.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iXon Ultra 897 | Andor | DU-897U-CS0 | |
| Solis | Andor | ||
| CHO-K1 | ATCC | CCL-61 | |
| ATTO 488 labeled PPE | ATTO-TEC GmbH | AD 488-151 | |
| DOPE | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850725 | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids, Inc. | 890890 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331 | |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| HEPES | Gibco | 15630-106 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| SimFCS 3.0 | Globals Software | the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/ | |
| DMI6000 with TIRF modulus | Leica | ||
| LAS AF | Leica | ||
| Lipofectamine 2000 | Lipofectamine | 11668019 | |
| Matlab | MathWork | ||
| ImageJ | NIH |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor | OriGene | RG200980 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A5306 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 528730 | |
| Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm | Sigma Aldrich | L5155 | |
| SONICA Ultrasonic Cleaners | SOLTEC | ETH S3 | |
| Petri Dishes | Willco | GWSt-3522 | |
| Bio-Format importer for Matlab | http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/ | ||
| ICS-MatLab Tools | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip | ||
| Simulation by Matlab Tutorial | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html | ||
| Simulation by SimFCS Tutorial | https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt |
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