Introduction
Humaine de type 1 du virus de l'immunodéficience (HIV-1) d'entrée, à médiation par les glycoprotéines de l'enveloppe virale (Env) trimères est la première étape du cycle infectieux. Étant le seul antigène viral exposé présenté à la surface des virions, le trimère Env suscite des anticorps neutralisants et nonneutralizing. En tant que tel, il représente un candidat intéressant pour la conception d'un vaccin immunogène. Cependant, les essais de vaccination avec Env dans des formes solubles ou recombinantes suscité des réponses avec seulement l'efficacité minimale contre la plupart des isolats primaires du VIH-1 1-3. Néanmoins, l'efficacité partielle observée dans l'essai de vaccin RV144 4 regain d'intérêt pour le VIH-1 Env comme candidat immunogène. Cela a été corroboré par une étude récente décrivent que les anticorps anti-Env vaccination suscité étaient suffisantes pour générer un certain degré de protection contre les SIV et les défis du VIH 5.
Après avoir été synthétisée dans le réticulum endoplasmique, la glycoprote Enven précurseur, gp160, subit diverses modifications post-traductionnelles qui sont critiques pour sa capacité à alimenter le processus de fusion virale. Le précurseur Env doit se replier correctement et associé dans trimères avant d'être coupé dans ses gp120 et gp41 transmembranaire extra-cytoplasmiques des sous-unités 6-10, avec des interactions non covalentes le maintien de la liaison gp120-gp41. La machinerie de la cellule infectée est également responsable de glycosylation fortement Env, comprenant environ 50% de sa masse totale 11,12. La structure complexe qui en résulte permet Env être conformation souple 13,14, tout en offrant une métastabilité qui est pensé pour permettre Env de s'adapter et de cacher certains épitopes hautement immunogènes qui autrement seraient exposés 15-19, soulignant l'importance de mieux comprendre les différentes conformations échantillonné par le Env trimère natif.
A ce jour, plusieurs techniques ont été développées avec succès et utilisé pour étudier la conformation Env changes. Toutefois, ils varient dans leurs limites, étant souvent limitée à des contextes spécifiques Env. Par exemple, la résonance plasmonique de surface ou des analyses d'immunoprécipitation en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques de conformation (Acm), reposent soit sur des molécules Env monomères solubles ou solubilisés qui sont connus pour être différents de leurs immunogénétiquement formes trimères 20,21. Des études récentes suggèrent également que le clivage affecte conformations Env résultant de l'exposition des épitopes essentiellement reconnus par des anticorps nonneutralizing 14,22,23.
Nous décrivons ici en détail une méthode qui permet de déterminer rapidement et facilement la conformation de cellulairement exprimé Env trimères 18,24-26. Après la transfection transitoire de Env dans une lignée humaine de cellules adhérentes de la liaison d'anticorps spécifiques à Env est détecté en utilisant une réaction de chimioluminescence simple. Cette technique peut également être utilisée pour caractériser la conformation de préférence de conformation dépend de l-anticorps dent. Par conséquent, ce dosage fournit un procédé de détection très robuste et souple.
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Protocol
1 Jour 1 - Culture Cellulaire
- Planche 2 x 10 4 ostéosarcome humain (HOS) des cellules par puits dans une, plaque à 96 puits de culture cellulaire opaque approprié pour la lecture de luminescence. Utilisation du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U / ml de pénicilline-streptomycine. Incuber jusqu'au lendemain à 37 ° C, 5% CO 2.
2 Jour 2 - Polyéthylènimine (PEI) de transfection
- Préparer mélange de transfection selon les étapes suivantes. Ajuster les réactifs et les quantités d'ADN en fonction du nombre de puits qui doivent être transfectées avec le même Env.
- Tube A: Ajouter 10 ng Tat plasmide codant (comme pTAT-III 27) et 150 ng Env plasmide codant pour 5 pi DMEM supplémenté avec 25 mM d'HEPES.
- Le plasmide Tat-codage n'est nécessaire lors de l'utilisation des plasmides Tat-dépendante Env-codant tels que pSVIII.
- Tube B: Ajouter 450 ng PEI (à partir d'un 1ug / ul solution) à 5 pi DMEM.
- Ajouter le contenu d'un tube B au tube A. Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes et incuber mélange de transfection 10 min à température ambiante (22 ° C).
- Ajouter 10 ul du mélange de transfection par puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 48 heures à 37 ° C, 5% CO 2.
3 Jour 4 - ELISA
- Effectuer toutes les expériences à température ambiante pour minimiser possible endocytose de Env / anticorps complexes.
- Préparer 250 ml de tampon de lavage par plaque étant utilisés en même temps. Tampon de lavage est une solution saline tamponnée 1 x Tris (TBS) à pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM), supplémenté avec 1 mM de MgCl2 et 1,8 mM de CaCl2.
- Préparer 125 ml de tampon de blocage par plaque en ajoutant du lait en poudre écrémé 1% et 5 mM Tris pH 8,0 à tampon de lavage.
- Retirer les milieux de culture cellulaire et transfection mélange (surnageant) de la plaque à 96 puits.
- Ajouter 100 μ; L de tampon de blocage par puits et incuber 20 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et ajouter 50 ul d'anticorps (ou sérum) par puits, dilué à la concentration appropriée en tampon de blocage. Typiquement, en utilisant une concentration de 1 ug / ml. Incuber 1 heure à température ambiante.
- Laver 3 fois avec 100 pi tampon de blocage et puis répétez lavage 3x processus avec 100 ul du tampon de lavage.
- Retirer le surnageant, ajouter 100 ul tampon de blocage, et incuber 5 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et ajouter 50 ul d'anticorps secondaire dilué 1/3000 en tampon de blocage. Varier la dilution optimale de l'anticorps selon l'une des différences du fabricant. Incuber 40 minutes à température ambiante.
- Laver 3 fois avec 100 pi tampon de blocage et puis répétez lavage 3x processus avec 100 ul du tampon de lavage.
4. d'acquisition de données
- Retirer le surnageant de la plaque et ajouter 30 ul 1x chimioluminescence amplifiée (ECL) substrat par puits.
- Acquérir chemsignal de iluminescence pour 1 sec / puits sur une plaque-lecteur approprié conformément aux instructions du fabricant. Temps de lecture peut varier en fonction des différences matérielles.
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Representative Results
En utilisant la procédure générale décrite ci-dessus, nous avons adapté le protocole de dosage de l'impact de CD4 soluble (sCD4) cellulaire CD4 et co-exprimées sur l'exposition d'épitopes sur CD4i de type sauvage (wt) ou mutée Env, 18,24, comme décrit précédemment, 25,28. figure 1 représente schématiquement la procédure générale et l'exposition d'épitopes CD4i après un traitement avec sCD4 ou par la co-expression de CD4 cellulaire 18. Dans la figure 2, nous avons utilisé sCD4 pour induire des changements conformationnels Env qui exposent CD4i Acm 17b et 48d épitopes qui se chevauchent le site de liaison de corécepteur 24,29, tandis que l'extérieur du domaine reconnaissant mAb 2G12 n'est pas affectée par ce traitement comme prévu 18,24.
L'impact des mutations ponctuelles dans Env conformation peut également être évaluée en utilisant ce test, tel que présenté dans la figure 3. Ici, nous avons utilisé soit la couche 1 Env H66A mutant, connu pour avoir une diminutiond propension à goûter spontanément la conformation de CD4 lié 18,24,30,31 ou un mutant (S375W) qui prédispose Env à l'état de CD4 liée 32 et a obtenu des résultats concordants (figure 3A). Dans le cas où différentes exprimant le Env sont utilisés, il est souvent nécessaire de normaliser les données brutes exprimés en unités relatives de lumière (RLU) en fonction des niveaux d'expression. Dans ce cas, nous avons utilisé PGT121, une partie de mAb reconnaissant du bouclier glycane Env 33-35, que l'anticorps normalisation (figure 3B).
Comme nous l'avons récemment décrit 18, interaction de Env et CD4 dans la même cellule conduit à env changements conformationnels qui exposent épitopes CD4i. Sur la figure 4, on a cotransfecté des quantités croissantes d'un expresseur de CD4 avec Env dans le dosage ELISA à base de cellules obtenu et des signaux de plus en plus pour CD4i mAb A32 et C11 18,36-38, qui reconnaissent des épitopes discontinus dans le domaine intérieur de gp120, alors que Env reconnaissance par l'anticorps conformationnel indépendant 2G12 n'a pas été affectée (Figure 4A). Afin de contrôler l'efficacité de transfection entre les conditions, les données brutes ont été normalisées à 2G12 (figure 4B). L'augmentation des signaux obtenus pour les anticorps A32 et C11 dépendaient interaction Env-CD4, comme indiqué par l'absence de A32 et C11 modulation lorsque Env a été co-transfectées avec un mutant de CD4 (de F43H) avec diminution de la capacité d'interagir avec les 39 Env.
Figure 1: Représentation schématique de l'anti-Env ELISA à base de cellules. (A) Schéma général de la procédure dans laquelle les cellules HOS sont transfectées pour exprimer trimérique Env à la surface de la cellule. Env conformation peut alors être prélevé à l'aide de différents anticorps reconnaissant spécifiqueconformations (comme CD4i Acm). Les signaux sont détectés par chimiluminescence après coloration par les mAb anti-humain conjugué à la HRP. sCD4 (B) ou la co-expression de CD4 cellulaire (C) peut être utilisé pour induire des changements conformationnels Env qui conduisent à l'exposition d'épitopes CD4i.
Figure 2: Env sCD4 induit des changements de conformation conduisant à l'exposition des epitopes CD4i. Interaction de sCD4 par le VIH-1 CO-JRFL ACt Env améliore la reconnaissance par des anticorps ciblant des epitopes de CD4i (17b, 48d), mais pas par l'anticorps reconnaissant le domaine externe gp120 2G12. Un plasmide codant pour le VIH-1 CO-JRFLΔCT Env a été transfecté dans chaque puits et 48 heures plus tard, les cellules ont été lavées et incubées à la présence ou l'absence de 4 ug / ml de sCD4 pendant 30 min à température ambiante avant de continuing avec le protocole standard (Jour 4 - ELISA). Env conformation a ensuite été sondée par incubation avec 0,25 pg / ml 2G12, 1 ug / ml 17b ou 48d mAb anti-Env pendant 1 heure à température ambiante. Les signaux ont été détectés par chimiluminescence après incubation avec un anticorps anti-humain conjugué à la HRP pendant 45 min à température ambiante. Sont représentés les valeurs RLU moyenne ± ET de six répétitions avec le signal provenant de puits transfectées avec un plasmide pertinent (pas Env) soustrait. Données sont représentatives des résultats obtenus dans trois expériences indépendantes, avec une signification testé par deux voies d'analyse de variance (ns, non significatif; ****, p <0,0001).
Figure 3 Modulation de conformation Env. VIH-1 YU2 ACt couche 1 Env mutant (H66A) diminue CD4i 17b reconnaissance alors que la variante exposition S375Ws augmenté signal et 17b est suffisante pour restaurer le phénotype du mutant une couche (A). valeurs RLU des signaux obtenus à l'aide d'anti-Env et 17b PGT121 mAb. PGT121 signaux normalisés de CD4i mAb 17b après le traitement avec ou sans sCD4 (B). Sont représentées les valeurs moyennes ± SD de triples exemplaires avec un signal obtenu à partir des puits transfectés avec un plasmide non pertinent (pas Env) soustrait. Les données sont représentatives de résultats obtenus dans trois expériences indépendantes, avec une signification testée par ANOVA à deux voies (**, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001).
Figure 4 La co-expression de CD4 cellulaire améliore la reconnaissance par des anticorps CD4i. Un plasmide codant pour CD4 a été co-transfecté avec le VIH1 Env YU2 ACt pour favoriserla conformation de CD4 liée 18. (A) les valeurs RLU des signaux obtenus à l'aide d'anti-Env 2G12, A32 ou C11 et le mAb anti-CD4 OKT4 mAb. Signaux 2G12-normalisées de CD4i mAb A32 et C11 (B). Sont représentées les valeurs moyennes ± SD de triples exemplaires avec un signal obtenu à partir des puits transfectés avec un plasmide non pertinent (pas Env) soustrait. Les données sont représentatives de résultats obtenus dans trois expériences indépendantes. barre de gris indique en l'absence de CD4, alors que la barre bleue augmentation indique une augmentation progressive de la quantité de CD4 expressor être transfectées (1,7 ng, 3,5 ng, et 7 ng) et barre rouge indique la transfection d'un mutant de CD4 (F43H , 7 ng) avec diminution de la capacité à interagir avec la gp120.
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Discussion
Ce dosage est optimisé pour détecter l'interaction d'Acm spécifiques de HIV-1 Env trimérique exprimée à la surface cellulaire. Une fois que le protocole a été établi, il peut être utilisé au moyen de débits élevés avec de faibles coûts globaux des matières et des petites quantités d'anticorps. Etant donné que ce dosage est basé transfection, il peut facilement être adapté pour la co-expression de protéines cellulaires telles que les cellules CD4 dans le but d'étudier leurs effets sur la conformation de Env.
Cependant, la base de la transfection de ce protocole implique également que c'est l'une de ses plus importantes pièges. Tout d'abord, les antigènes doivent être étudiés avec cette technique sont tenus d'être disponibles dans un vecteur d'expression indépendante. En tant que tel, les gènes Env provenant de diverses sources cliniques ou des constructions provirales devraient être sous-cloné dans des vecteurs d'expression de mammifères. Alors que toute la longueur constructions provirales peuvent également être utilisés dans cette technique (voir Veillette et al. 18), ce qui implique également acteive la production de particules virales qui nécessite le travail dans des installations de confinement biologique appropriées.
En outre, le succès de cette technique est intimement liée à l'efficacité de la transfection. Faibles signaux obtenus sont souvent dues à une mauvaise expression des antigènes transfectées. Les sources typiques de problèmes de qualité de l'ADN plasmidique, des réactifs de transfection. et la viabilité des cellules. Si nécessaire, l'optimisation des conditions de transfection peut également être effectuée en utilisant d'autres techniques, telles que la cytométrie de flux ou transfert de Western. Fait à noter, il est également important d'être conscient que l'expression de certaines constructions Env pourrait être sous-optimale et pourrait donc affecter l'issue de la technique.
Ici nous nous sommes concentrés sur le sondage du VIH-1 conformation Env utilisant décrit précédemment CD4i Acm. Ce paramètre permet à un large éventail d'analyses telles que sonder l'effet de Env mutations ponctuelles ou les conséquences de conformation des protéines co-exprimées. En outre, la technique a décritre peut également être utilisé avec des mutants Env bien caractérisés avec propension conformation différente afin de sonder la spécificité de mAb différents pour différentes conformations Env. Cela permet une caractérisation facile et rapide de mAb nouvellement isolées tout en ne nécessitant pas de matériel très spécialisé ou de savoir-faire.
Bien que nous n'avons utilisé cette méthode contre Env de diverses VIH-1 clades et d'autres lignées d'un proche (VIH-2, SIV / Mac) 18, nous croyons que ce test pourrait être adapté pour des antigènes de surface supplémentaires, tels que ceux d'autres familles de virus.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr James Robinson pour son généreux don de la A32, 17b, 48d, et C11 Acm. PGT 121 a été obtenue par le programme réactif NIH SIDA, Division du sida, NIAID, NIH (Cat # 12343). Ce travail a été soutenu par une Fondation canadienne pour chef de programme Innovation # 29866, par un fonctionnement des IRSC # 257792, par un FRQS création de Young Scientist accorder # 24639 à AF et par un continuum subvention au CRCHUM ainsi que par une subvention de catalyseur des IRSC # 126630 AF et MR. AF est le destinataire d'un FRSQ Chercheur Boursier junior 1 bourse # 24639. MV a été soutenue par une bourse de recherche au doctorat des IRSC # 291485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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