Introduction
Trimeric वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (पर्यावरण) द्वारा मध्यस्थता मानव इम्यूनो वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) प्रविष्टि, संक्रामक चक्र का पहला कदम है. Virions की सतह पर प्रस्तुत केवल उजागर वायरल प्रतिजन होने के नाते, पर्यावरण trimer निष्क्रिय और nonneutralizing एंटीबॉडी elicits. जैसे, यह टीका immunogen डिजाइन के लिए एक दिलचस्प उम्मीदवार का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि, घुलनशील या पुनः संयोजक रूपों में पर्यावरण के साथ टीकाकरण परीक्षणों प्राथमिक एचआईवी -1 1-3 आइसोलेट्स सबसे खिलाफ केवल न्यूनतम प्रभाव के साथ प्रतिक्रियाओं हासिल. बहरहाल, आंशिक प्रभावकारिता एक immunogen उम्मीदवार के रूप में एचआईवी -1 लि में RV144 टीका परीक्षण 4 नए सिरे से ब्याज में मनाया. इस टीके हासिल विरोधी लि एंटीबॉडी SIV के खिलाफ संरक्षण की एक निश्चित डिग्री उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त थे और एचआईवी 5 कि चुनौतियों का वर्णन हाल के एक अध्ययन से पुष्टि की गई थी.
Endoplasmic जालिका में संश्लेषित किया जा रहा है, पर्यावरण glycoprote बादअग्रदूत, gp160 में, वायरल संलयन की प्रक्रिया को ईंधन की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि विभिन्न बाद translational संशोधनों आए. लि अग्रदूत gp120-gp41 संपर्क बनाए रखने noncovalent बातचीत के साथ, अपनी अतिरिक्त cytoplasmic gp120 और transmembrane gp41 सब यूनिटों 6-10 में cleaved किए जाने से पहले trimers में ठीक से और सहयोगी गुना चाहिए. संक्रमित कोशिका मशीनरी भी भारी इसकी कुल द्रव्यमान 11,12 के बारे में 50%, जिसमें पर्यावरण glycosylating के लिए जिम्मेदार है. बेहतर विभिन्न रचना को समझने के महत्व पर प्रकाश डाला, पर्यावरण के अनुकूल है और नहीं तो 15-19 उजागर किया जाएगा कि कुछ अत्यधिक immunogenic epitopes छिपाने के लिए अनुमति देने के लिए सोचा है कि एक metastability प्रदान करते हुए जिसके परिणामस्वरूप जटिल संरचना, पर्यावरण 13,14 conformationally लचीला होना करने की अनुमति देता देशी लि trimer से जांचा.
तिथि करने के लिए, कई तकनीक विकसित की है और सफलतापूर्वक लि गठनात्मक चर्चा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैAnges. हालांकि, वे अक्सर विशिष्ट पर्यावरण संदर्भों के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा है, अपनी सीमाओं में भिन्नता है. उदाहरण के लिए, सतह plasmon अनुनाद या रचना विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitation assays (MABS), या तो उनके trimeric रूपों 20,21 से immunogenetically अलग हो जाना जाता है जो मोनोमेरिक घुलनशील या solubilized लि अणुओं पर भरोसा करते हैं. हाल के अध्ययनों से भी दरार मुख्य रूप से एंटीबॉडी 14,22,23 nonneutralizing द्वारा मान्यता प्राप्त epitopes के जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप पर्यावरण रचना को प्रभावित करता है कि सुझाव है.
यहाँ हम विस्तार से cellularly व्यक्त लि trimers 18,24-26 की रचना की तेज और आसान निर्धारण के लिए अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णन. एक मानव पक्षपाती सेल लाइन में पर्यावरण के क्षणिक अभिकर्मक के बाद पर्यावरण विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन एक सरल chemiluminescence प्रतिक्रिया का उपयोग का पता चला है. इस तकनीक को भी की गठनात्मक वरीयता चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता रचना-निर्भरतासेंध एंटीबॉडी. इस प्रकार, इस परख एक मजबूत और अत्यधिक लचीला पहचान पद्धति प्रदान करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 दिन 1 - सेल संस्कृति
- प्लेट 2 एक्स 10 4 मानव ऑस्टियो सार्कोमा (अस्पताल) luminescence पढ़ने के लिए उपयुक्त एक अपारदर्शी, 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) का प्रयोग करें. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर अगले दिन जब तक सेते हैं.
2 दिन 2 - Polyethylenimine (पी) अभिकर्मक
- बाद के चरणों के अनुसार अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें. एक ही पर्यावरण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हो रहे हैं कि कुओं की संख्या के हिसाब से अभिकर्मकों और डीएनए मात्रा समायोजित करें.
- ट्यूब एक: 25 मिमी HEPES के साथ पूरक 5 μl DMEM को पर्यावरण एन्कोडिंग प्लाज्मिड एनजी 10 एनजी जैसे एन्कोडिंग (जैसे pTat-III 27) के रूप में प्लाज्मिड और 150 जोड़ें.
- ऐसे pSVIII रूप गूंथना निर्भर लि एन्कोडिंग plasmids का उपयोग करते समय जैसे एन्कोडिंग प्लाज्मिड ही आवश्यक है.
- ट्यूब बी: एक 1 से 450 एनजी पी (जोड़ें5 μl DMEM को माइक्रोग्राम / μl समाधान).
- अच्छी तरह से 10 सेकंड के लिए vortexing द्वारा ट्यूब ए मिक्स करने के लिए ट्यूब बी की सामग्री जोड़ें और अभिकर्मक मिश्रण कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट सेते हैं.
- 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण के 10 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 48 घंटे के लिए सेते हैं.
3 दिन 4 - एलिसा
- लि / एंटीबॉडी परिसरों के संभावित endocytosis कम करने के लिए कमरे के तापमान पर सभी प्रयोगों प्रदर्शन.
- एक ही समय में इस्तेमाल किया जा रहा प्लेट प्रति धोने बफर के 250 मिलीलीटर तैयार करें. वॉशिंग बफर 1x Tris-buffered खारा (टीबीएस) पीएच 7.5 (50 मिमी Tris सीएल, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl) 1 मिमी 2 MgCl और 1.8 मिमी 2 CaCl के साथ पूरक.
- 1% नोनफेट शुष्क दूध और धोने बफर के लिए 5 मिमी Tris 8.0 पीएच जोड़कर प्लेट प्रति बफर अवरुद्ध 125 मिलीलीटर तैयार करें.
- 96 अच्छी तरह से थाली से सेल संस्कृति मीडिया और अभिकर्मक मिश्रण (सतह पर तैरनेवाला) निकालें.
- 100 μ जोड़ें; प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर और आरटी पर 20 मिनट सेते के एल.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और अवरुद्ध बफर में उपयुक्त एकाग्रता को पतला अच्छी तरह से प्रति एंटीबॉडी (या सीरम) के 50 μl, जोड़ें. आमतौर पर, 1 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता का उपयोग करें. आरटी पर 1 घंटा सेते हैं.
- 100 μl अवरुद्ध बफर और फिर 100 μl धोने बफर के साथ कपड़े धोने की प्रक्रिया 3x दोहराने के साथ 3X धो.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें अवरुद्ध बफर 100 μl जोड़ने के लिए, और आरटी पर 5 मिनट सेते हैं.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और अवरुद्ध बफर में 1/3000 पतला एंटीबॉडी के 50 μl, जोड़ें. निर्माता मतभेदों के अनुसार इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने से भिन्न हो. आरटी पर 40 मिनट सेते हैं.
- 100 μl अवरुद्ध बफर और फिर 100 μl धोने बफर के साथ कपड़े धोने की प्रक्रिया 3x दोहराने के साथ 3X धो.
4 डाटा अधिग्रहण
- थाली से सतह पर तैरनेवाला निकालें और अच्छी तरह से प्रति 30 μl 1x बढ़ाया chemiluminescence (ईसीएल) सब्सट्रेट जोड़ें.
- केम मोल1 सेकंड के लिए iluminescence संकेत / अच्छी तरह से निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त प्लेट रीडर. समय पढ़ने हार्डवेयर मतभेद के अनुसार अलग हो सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ऊपर वर्णित सामान्य प्रक्रिया का उपयोग करना, हम जंगली प्रकार (WT) या उत्परिवर्तित लि या तो पर CD4i epitopes के जोखिम पर घुलनशील सीडी 4 (sCD4) और coexpressed सेलुलर सीडी 4 के प्रभाव परख के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित, 18,24 पहले वर्णित के रूप में, 25,28. 1 रेखाचित्र सामान्य प्रक्रिया और sCD4 साथ या सेलुलर सीडी 4 की 18 coexpression द्वारा इलाज के बाद CD4i epitopes के जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है चित्रा. 18,24 उम्मीद के रूप में मैब 2G12 पहचानने बाहरी डोमेन इस उपचार से प्रभावित नहीं है, जबकि चित्रा 2 में, हम, CD4i MABS 17B और coreceptor बाध्यकारी साइट 24,29 ओवरलैप जो 48d epitopes बेनकाब कि पर्यावरण गठनात्मक परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए sCD4 इस्तेमाल किया.
चित्रा 3 में प्रस्तुत के रूप में पर्यावरण रचना में बिंदु उत्परिवर्तन के प्रभाव का यहां., इस परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है कि हम या तो कमी है जाना परत 1 लि उत्परिवर्ती H66A, प्रयोगडी प्रवृत्ति अनायास सीडी 4 बाध्य रचना 18,24,30,31 या सीडी 4 बाध्य राज्य में 32 को पर्यावरण predisposes और सहमत परिणाम (चित्रा 3) प्राप्त जो एक उत्परिवर्ती (S375W) नमूने के लिए. विभिन्न पर्यावरण expressors उपयोग किया जाता है जहां मामलों में, यह अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों (RLU) के रूप में व्यक्त कच्चे डेटा मानक के अनुसार अक्सर आवश्यक है. इस मामले में, हम सामान्य एंटीबॉडी (3B चित्रा) के रूप में, PGT121, पर्यावरण glycan ढाल 33-35 के मैब पहचानने हिस्सा इस्तेमाल किया.
हम हाल ही में 18 में वर्णित के रूप में, एक ही सेल में पर्यावरण और सीडी 4 की बातचीत CD4i epitopes बेनकाब कि गठनात्मक परिवर्तन लि की ओर जाता है. चित्रा 4 में, हम सेल आधारित एलिसा परख में पर्यावरण के साथ एक सीडी 4 expressor की बढ़ती मात्रा cotransfected और gp12 के भीतरी क्षेत्र में टूटनेवाला epitopes पहचान जो CD4i MABS A32 और C11 18,36-38, के लिए संकेत बढ़ती प्राप्त0, गठनात्मक स्वतंत्र 2G12 एंटीबॉडी द्वारा पर्यावरण मान्यता (चित्रा -4 ए) प्रभावित नहीं किया गया था जबकि. स्थितियों के बीच अभिकर्मक दक्षता के लिए नियंत्रित करने के लिए, कच्चे डेटा 2G12 (4B चित्रा) के लिए सामान्यीकृत किया गया था. बढ़ी हुई संकेतों A32 के लिए प्राप्त की और C11 एंटीबॉडी लि लि 39 के साथ बातचीत के लिए कम क्षमता के साथ एक सीडी 4 उत्परिवर्ती (F43H) के साथ cotransfected था जब A32 और C11 मॉडुलन के अभाव से संकेत के रूप में पर्यावरण-सीडी 4 बातचीत पर निर्भर करता था.
अस्पताल कोशिकाओं कोशिका की सतह पर trimeric पर्यावरण व्यक्त करने ट्रांसफ़ेक्ट हैं जिसमें प्रक्रिया के विरोधी पर्यावरण सेल आधारित एलिसा. (ए) सामान्य योजना के चित्रा 1 योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. लि रचना तो विशिष्ट पहचानने अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके जांचा जा सकता है(जैसे CD4i Mabs के रूप में) रचना. सिग्नल एचआरपी संयुग्मित विरोधी मानव Mabs साथ धुंधला के बाद chemiluminescence द्वारा पता चला रहे हैं. sCD4 (बी) या सेलुलर सीडी 4 (सी) के coexpression CD4i epitopes के जोखिम के लिए नेतृत्व कि पर्यावरण गठनात्मक परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 2 sCD4 CD4i epitopes साथ sCD4 की. सहभागिता के जोखिम के लिए अग्रणी पर्यावरण गठनात्मक परिवर्तन लाती एचआईवी -1 सह JRFL ΔCT लि CD4i epitopes (17B, 48d) को लक्षित एंटीबॉडी द्वारा मान्यता, लेकिन नहीं gp120 बाहरी डोमेन पहचानने एंटीबॉडी द्वारा बढ़ाता है 2G12. एचआईवी -1 सह JRFLΔCT लि एन्कोडिंग एक प्लाज्मिड में ट्रांसफ़ेक्ट था प्रत्येक अच्छी तरह से और बाद में कोशिकाओं के शेष भाग से पहले आरटी पर 30 मिनट के लिए उपस्थिति या 4 ग्राम / मिलीलीटर sCD4 के अभाव में धोया और incubated रहे थे 48 घंटेमानक प्रोटोकॉल के साथ inuing (दिन 4 - एलिसा). लि रचना तो आरटी पर 1 घंटे के लिए 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल 2G12, 1 ग्राम / मिलीलीटर 17B या 48d विरोधी लि Mabs साथ incubating द्वारा जांच की गई थी. सिग्नल आरटी पर 45 मिनट के लिए एक एचआरपी संयुग्मित विरोधी मानव एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद chemiluminescence द्वारा पता लगाया गया. एक अप्रासंगिक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कुओं से प्राप्त संकेत के साथ छह प्रतिकृति के एसडी मतलब ± RLU मान रहे हैं दिखाया गया है (कोई लि) घटाया. महत्व दो तरह एनोवा द्वारा परीक्षण के साथ डाटा, तीन स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधि है (एनएस, महत्वपूर्ण नहीं; ****, पी <0.0001).
लि रचना की चित्रा 3 Modulation. एचआईवी -1 YU2 ΔCT परत 1 लि उत्परिवर्ती (H66A) S375W संस्करण प्रदर्शनी जबकि CD4i 17B मान्यता घटता हैएस 17B संकेत वृद्धि हुई है और परत 1 उत्परिवर्ती के phenotype बहाल करने के लिए पर्याप्त है. (ए) विरोधी लि PGT121 और 17B Mabs का उपयोग कर प्राप्त संकेतों के RLU मूल्यों. (बी) के साथ या sCD4 बिना इलाज के बाद CD4i मैब 17B के PGT121 सामान्यीकृत संकेत. एक अप्रासंगिक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कुओं से प्राप्त संकेत के साथ triplicates के एसडी ± मतलब मूल्यों दिखाया (कोई लि) घटाया. महत्व दो तरह एनोवा द्वारा परीक्षण के साथ डाटा, तीन स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधि है (**, पी <0.01, ***, पी <0.001, ****, पी <0.0001).
सेलुलर सीडी 4 की 4 चित्र Coexpression CD4i एंटीबॉडी द्वारा मान्यता को बढ़ाता है. एक सीडी 4 एन्कोडिंग प्लाज्मिड पक्ष के क्रम में HIV1 YU2 ΔCT पर्यावरण के साथ cotransfected थासीडी 4 बाध्य रचना 18. (ए) विरोधी लि 2G12, A32 या C11 Mabs और विरोधी सीडी 4 OkT4 मैब का उपयोग कर प्राप्त संकेतों के RLU मूल्यों. (बी) CD4i MABS A32 और C11 के 2G12 सामान्यीकृत संकेत. एक अप्रासंगिक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कुओं से प्राप्त संकेत के साथ triplicates के एसडी ± मतलब मूल्यों दिखाया (कोई लि) घटाया. डाटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधि है. बढ़ती नीली पट्टी सीडी 4 की राशि में एक कदम के लिहाज से वृद्धि इंगित करता है expressor (1.7 एनजी, 3.5 एनजी, और 7 एनजी) ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहा है और लाल पट्टी (F43H एक सीडी 4 उत्परिवर्ती की अभिकर्मक इंगित करता है जबकि ग्रे बार, सीडी 4 के अभाव में इंगित करता है gp120 के साथ बातचीत के लिए कम क्षमता के साथ, 7 एनजी).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस परख एचआईवी -1 trimeric पर्यावरण कोशिका की सतह पर व्यक्त के साथ विशिष्ट Mabs की बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है. प्रोटोकॉल स्थापित हो जाने के बाद, यह कम समग्र माल की लागत और एंटीबॉडी के छोटे मात्रा के साथ उच्च throughputs के लिए माध्यम में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख अभिकर्मक आधारित है, यह आसानी से पर्यावरण रचना पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के क्रम में ऐसी सीडी 4 के रूप में सेलुलर प्रोटीन की coexpression के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
हालांकि, इस प्रोटोकॉल के अभिकर्मक आधार भी इसे अपनी सबसे महत्वपूर्ण नुकसान में से एक है कि निकलता है. सबसे पहले, एंटीजन इस तकनीक के साथ अध्ययन किया जा करने के लिए एक स्वतंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर में उपलब्ध होना आवश्यक है. जैसे, विभिन्न नैदानिक स्रोतों या proviral निर्माणों से पर्यावरण जीन स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर में subcloned करने की आवश्यकता होगी. पूर्ण लंबाई proviral निर्माणों को भी इस तकनीक में इस्तेमाल किया जा सकता है (Veillette एट अल देखें. 18), यह भी अधिनियम का तात्पर्यIve वायरल कणों उत्पादन इस प्रकार उचित biocontainment सुविधाओं में काम की आवश्यकता होती है.
इसके अलावा, इस तकनीक की सफलता अच्छी अभिकर्मक दक्षता के साथ जुड़ा हुआ है. प्राप्त कम संकेत अक्सर ट्रांसफ़ेक्ट एंटीजन के गरीब अभिव्यक्ति की वजह से कर रहे हैं. समस्याओं के विशिष्ट स्रोतों प्लास्मिड डीएनए गुणवत्ता, अभिकर्मक अभिकर्मकों हैं. और कोशिकाओं व्यवहार्यता. यदि आवश्यक हो, अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन भी ऐसे फ्लो या पश्चिमी सोख्ता के रूप में अन्य तकनीकों, का उपयोग किया जा सकता है. ध्यान से, यह कुछ पर्यावरण निर्माणों की अभिव्यक्ति suboptimal हो सकता है और इसलिए तकनीक के परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि बारे में पता होना भी जरूरी है.
यहाँ हम पहले से वर्णित CD4i Mabs का उपयोग एचआईवी -1 लि रचना की जांच पर जोर दिया. यह सेटिंग ऐसी लि बिंदु उत्परिवर्तन या coexpressed प्रोटीन के गठनात्मक परिणामों के प्रभाव की जांच के रूप में विश्लेषण की एक व्यापक श्रृंखला के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, तकनीक वह वर्णितफिर भी विभिन्न पर्यावरण रचना के लिए अलग Mabs की विशिष्टता की जांच के क्रम में विभिन्न गठनात्मक प्रवृत्ति के साथ अच्छी तरह से विशेषता लि म्यूटेंट के साथ प्रयोग किया जा सकता है. यह उच्च विशेष उपकरण या पता है कि कैसे की जरूरत नहीं है, जबकि नव पृथक Mabs का एक आसान और तेजी से लक्षण वर्णन अनुमति देता है.
हम केवल विभिन्न एचआईवी -1 clades और अन्य करीबी रिश्तेदार प्रजातियों (एचआईवी -2, SIV / मैक) 18 से पर्यावरण के खिलाफ इस विधि का इस्तेमाल किया है, हम इस परख इस तरह के अन्य वायरस परिवारों से लोगों के रूप में अतिरिक्त सतह एंटीजन, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
हम अपने उदार A32, 17B, 48d का उपहार, और C11 Mabs के लिए डॉ जेम्स रॉबिन्सन धन्यवाद. PGT 121 एनआईएच एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम, एड्स, NIAID, एनआईएच (बिल्ली # 12343) के डिवीजन के माध्यम से प्राप्त हुई थी. इस काम के वैज्ञानिक वायुसेना के लिए और एक CRCHUM सातत्य अनुदान के रूप में भी एक CIHR उत्प्रेरक अनुदान # 126630 द्वारा # 24639 अनुदान यंग की एक FRQS स्थापना करके, एक CIHR ऑपरेटिंग # 257792 द्वारा, अभिनव कार्यक्रम नेता # 29866 के लिए एक कनाडा फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया वायुसेना और श्री. वायुसेना एक FRSQ Chercheur BOURSIER जूनियर 1 फैलोशिप # 24639 के प्राप्तकर्ता है. एमवी एक CIHR डॉक्टरल अनुसंधान पुरस्कार # 291485 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
