Introduction
삼량 바이러스 엔벨로프 당 단백질 (봉투)에 의해 매개되는 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 항목은 전염성주기의 첫 번째 단계입니다. 비리의 표면에서 발표 만 노출 바이러스 항원이기 때문에, 봉투 삼량은 중화 및 nonneutralizing 항체를 이끌어 낸다. 따라서, 그것은 백신의 면역원 디자인에 대한 흥미있는 후보를 나타냅니다. 그러나, 수용성 또는 재조합 형태로 봉투와 함께 예방 접종 시험 차 HIV-1가 1-3 분리 대부분에 대한 최소한의 효과와 반응을 이끌어 냈다. 그럼에도 불구하고, 부분적인 효능 면역원 후보로 HIV-1 봉투의 RV144 백신 재판 4 새로운 관심에서 관찰. 이는 백신 유도 항 봉투 항체는 SIV에 대한 보호의 어느 정도를 생성하기에 충분했고, HIV 5 도전 것을 나타내는 최근 연구에 의해 확증되었다.
소포체에서 합성되고, 봉투의 glycoprote 후전구체, gp160에, 바이러스 성 융합 프로세스 연료하는 능력에 중요한 다양한 번역 후 변형을 겪는다. 봉투 전구체는 gp120의-gp41의 연락을 유지 비공유 상호 작용으로, 그 여분의 세포질 gp120의 및 횡단 gp41 서브 유닛 6-10로 분해되기 전에 삼량에 적절하고 동료 접어해야합니다. 감염된 세포는 주로 기계의 전체 질량 (11, 12)의 50 % 정도를 포함하는, 봉투 glycosylating을 담당한다. 더 나은 다른 입체 형태를 이해하는 중요성을 강조 봉투는 적응하고, 그렇지 않으면 15 ~ 19 노출 될 수있는 특정 높은 면역 원성 항원을 숨길 수 있도록 생각하는 준 안정성을 제공하면서 그 결과 복잡한 구조는, 봉투는 13, 14 구조적으로 유연하게 할 수 있습니다 기본 봉투 삼량 체에 의해 샘플링.
지금까지 여러 가지 기술들이 개발되고 성공적 봉투 구조적 CH를 연구하는데 사용되어왔다Anges의. 그러나, 그들은 종종 특정 봉투 컨텍스트로 제한되고, 자신의 한계에 따라 다릅니다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 형태 또는 특정 모노클로 날 항체를 사용하여 면역 침전 분석법 (모노클로 날 항체)은, 하나는 자신의 삼량 체 형태 20,21 immunogenetically에서 상이한 것으로 알려진 모노머 용해 또는 가용화 된 봉투 분자에 의존한다. 최근의 연구는 분열은 주로 항체 14,22,23를 nonneutralizing 인식 항원의 노출이 봉투의 입체 형태에 영향을 미치는 것이 좋습니다.
여기에서 우리는 세부 사항에서 cellularly 발현 봉투의 삼량 18,24-26의 형태를 빠르고 쉽게 결정을 허용하는 방법을 설명합니다. 인간 점착성 세포주에서 봉투의 일시적인 형질 감염에 이어 봉투 특정 항체의 결합은 단순한 화학 발광 반응을 이용하여 검출된다. 이 기술은 또한 환경의 구조적 특성을 사용할 수있는 형태를-의존적이다덴트 항체. 따라서, 이러한 분석은 강력하고 매우 유연한 검출 방법을 제공한다.
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Protocol
1 일 한 - 세포 배양
- 플레이트 2 × 10 4 인간 골육종 (HOS) 발광 읽기에 적합한 불투명, 96 웰 세포 배양 접시에 잘 당 세포. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 다음 날까지 품어.
2 2 일 - 폴리에틸렌 이민 (PEI) 형질
- 다음 단계에 따라 형질 믹스를 준비합니다. 동일한 봉투 형질하여야 웰의 수에 따른 시약 및 DNA의 양을 조정한다.
- 튜브는 25 mM의 HEPES와 보충 5 μL의 DMEM에 봉투 인코딩 플라스미드 NG 10 NG 문신 인코딩 (예 : PTAT-III 27)를 플라스미드와 150를 추가합니다.
- 같은 pSVIII으로 문신에 의존 봉투를 코딩하는 플라스미드를 사용하는 경우 문신 인코딩 플라스미드에만 필요합니다.
- 튜브 B : 1에서 450 ng의 PEI를 (추가5 ㎕의 DMEM에 μg / μL 용액).
- 철저하게 10 초 동안 볼 텍싱에 의해 튜브 A. 믹스에 관 B의 내용을 추가하고 형질 믹스에서 객실 온도 (22 ° C에서)에서 10 분을 품어.
- 96 - 웰 플레이트 잘 당 형질 믹스 10 μl를 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 배양한다.
3 일 4 - ELISA
- 봉투 / 항체 복합체의 가능한 엔도 사이토 시스를 최소화하기 위해 실온에서 모든 실험을 수행합니다.
- 동시에 사용되는 접시 당 세척 완충액 250 ㎖를 준비한다. 세척 버퍼 1X 트리스 - 완충 생리 식염수 (TBS)의 pH 7.5 (50 mM 트리스 - 염소, pH가 7.5, 150 밀리미터의 NaCl) 1 mM의 MgCl2를 1.8 mM의 염화칼슘이 보충.
- 1 %의 탈지 분유 및 세척 버퍼에 5 mM 트리스 산도 8.0을 추가하여 접시 당 버퍼를 차단 125 ML을 준비합니다.
- 96 웰 플레이트에서 세포 배양 매체와 형질 믹스 (뜨는)를 제거합니다.
- 100 μ 추가; 잘 당 버퍼를 차단하고 실온에서 20 분을 품어의 리터.
- 상층 액을 제거하고 버퍼를 차단에 적절한 농도로 희석 아니라 당 항체 (혈청)의 50 μl를 추가합니다. 통상적으로, 1 μg / ml의 농도를 사용한다. 실온에서 1 시간을 품어.
- 100 μL가 버퍼를 차단 한 후 100 ㎕의 세척 버퍼로 세척 공정의 3 배를 반복 씻을 배.
- , 상층 액을 제거 버퍼를 차단 100 μl를 추가하고, 실온에서 5 분을 품어.
- 상층 액을 제거하고 버퍼를 차단에서 1 / 3000로 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다. 제조 업체의 차이에 따라 최적의 항체 희석 다릅니다. 실온에서 40 분을 품어.
- 100 μL가 버퍼를 차단 한 후 100 ㎕의 세척 버퍼로 세척 공정의 3 배를 반복 씻을 배.
(4) 데이터 수집
- 판으로부터 상층 액을 제거하고 잘 당 30 ㎕의 1 배 강화 된 화학 발광 (ECL) 기판을 추가합니다.
- 화학 획득1 초 동안 iluminescence 신호 / 웰에 대한 제조사의 지시에 따라 적절한 플레이트 리더. 시간을 읽는 것은 하드웨어의 차이에 따라 다를 수 있습니다.
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Representative Results
상술 한 일반적인 절차를 사용하여, 우리는 야생형 (중량) 또는 돌연변이 된 봉투 하나에 CD4i 에피토프의 노출에 가용성 CD4 (sCD4)과 동시 발현 세포 CD4의 영향을 검정 프로토콜을 적응 18,24 전술 한 바와 같이, 25, 28. 한 개략적 일반적 절차와 sCD4 또는 CD4 세포 (18)의 동시 발현에 의해 치료 다음 CD4i 에피토프의 노출을 나타내는 도표. 18,24 예상대로 단클론 항체 2G12을 인식하는 외부 도메인이 처리에 의해 영향을받지 않는 반면, 그림 2에서, 우리는 CD4i 모노클로 날 항체의 17 (b)와 공 수용체 결합 부위 24,29 중복 48D 항원에 노출 봉투 구조 변화를 유도하기 위해 sCD4을 사용했다.
도 3에 제시된 바와 같이 입체 봉투에서 점 돌연변이의 영향은 또한 여기.,이 분석을 이용하여 평가 될 수는 a 감소하는 것으로 알려져 층 돌연변이 H66A 1 봉투를 사용D 성향은 자발적으로 CD4 결합 된 형태 18,24,30,31 또는 CD4 바인딩 상태 32에 봉투를 걸리기과 조화 된 결과 (그림 3A)를 얻은 돌연변이 (S375W)을 샘플링합니다. 다른 봉투의 익스가 사용되는 경우, 이는 발현 수준에 따른 상대적인 광 유니트 (RLU)로 표현 된 원시 데이터를 정규화하는 것이 필요하다. 이 경우, 우리는 정규화 된 항체 (도 3b)로서, PGT121, 봉투 실드 33-35 글리 칸의 부분을 인식하는 항체를 사용.
우리가 최근 18과 같이, 동일한 셀에있는 봉투와의 상호 작용이 CD4 CD4i 에피토프를 노출 구조 변화를 ENV하도록 이끈다. 도 4에서는, 셀 기반 ELISA 분석에서 봉투와 함께 CD4의 익스 양의 증가와 동시 형질 감염된 gp12의 내부 영역에서 불연속 에피토프를 인식 CD4i A32 모노클로 날 항체 및 C11 18,36-38위한 신호를 증가 수득영, 구조적 독립적 2G12 항체에 의해 봉투 인식 (그림 4A)를 영향을받지 않았다 반면. 조건 사이의 형질 전환 효율을 제어하기 위해, 원시 데이터는 2G12 (도 4b)로 정상화시켰다. 증가 된 신호 A32에 대해 획득 및 C11 항체는 봉투가 봉투 (39)와 상호 작용할 수 감소 능력 CD4 돌연변이 (F43H)로 동시 형질 감염된 때 A32과 C11 변조의 부재로 나타내는 바와 같이 봉투-CD4 상호 작용에 의존.
HOS 세포가 세포 표면에서 삼량 봉투 표현 형질되는 프로 시저의 방지 봉투 셀 기반 ELISA. (A) 일반 구조도 1의 도식 표현. 봉투의 형태이어서 다른 구체적인 인식 항체를 사용하여 샘플링 될 수있다(예 : CD4i 단클론 항체 등) 입체 형태. 신호는 HRP-결합 된 항 - 인간 단클론 항체로 염색 한 후 화학 발광에 의해 검출된다. sCD4 (B) 또는 CD4 세포 (C)의 동시 발현은 CD4i 에피토프의 노출을 초래할 봉투 형태 적 변화를 유도하기 위해 사용될 수있다.
그림 2 sCD4는 CD4i 항원 결정기와 sCD4의. 상호 작용의 노출로 이어지는 봉투 구조 변화를 유도 HIV-1 CO-JRFL ΔCT 봉투는 CD4i의 항원 결정기 (17B, 48D)을 대상으로 항체에 의해 인식,하지만 gp120의 외부 도메인 인식하는 항체에 의해 강화 2G12. HIV-1 CO-JRFLΔCT 봉투를 코딩하는 플라스미드로 형질 전환 된 각각의 웰 이상 세포가 계속되기 전에 RT에서 30 분 동안 존재 또는 4 μg / ㎖ sCD4의 부재 하에서 세정 및 배양 48 시간표준 프로토콜 inuing (4 일 - ELISA). 봉투의 형태는 다음 실온에서 1 시간 동안 0.25 μg / ml의 2G12, 1 μg / ml의 17B 또는 48D 방지 봉투 모노클로 날 항체와 함께 배양하여 프로빙했다. 신호 RT에서 45 분 동안 HRP-공액 항 - 인간 항체와 인큐베이션 후, 화학 발광에 의해 검출 하였다. 관련이없는 플라스미드로 형질 우물에서 얻은 신호 여섯 반복 실험의 SD ± 평균 RLU 값을 보이고있는 바와 같다 (더 봉투는) 차감하지 않습니다. 중요성이 일원 분산 분석에 의해 테스트와 데이터, 3 개의 독립적 인 실험에서 얻은 결과를 나타낸다 (NS, 중요하지, ****, p <0.0001).
봉투의 형태의 그림 3 변조. HIV-1 YU2 ΔCT 층 한 봉투 돌연변이 (H66A)는 S375W 변형 전시 반면 CD4i의 17B 인식을 감소S 17B는 신호 증가 및 층 (1)의 돌연변이 표현형을 회복하기에 충분하다. (A) 항 봉투 PGT121 및 17B 모노클로 날 항체를 사용하여 얻은 신호의 값을 RLU. (B) 또는 sCD4 치료없이 다음 CD4i 단클론 항체 (17B)의 PGT121 정규화 신호. 관련이없는 플라스미드로 형질 우물에서 얻은 신호에서 삼중의 SD ± 평균 값을 보이고있는 바와 같다 (더 봉투)를 차감하지 않습니다. 중요성이 일원 분산 분석에 의해 테스트와 데이터, 3 개의 독립적 인 실험에서 얻은 결과를 나타낸다 (** p <0.01, *** p <0.001, ****, p <0.0001).
세포 CD4의 그림 4와 동시 발현은 CD4i 항체에 의해 인식을 향상시킵니다. CD4 인코딩 플라스미드를 선호하기 위해 HIV1 YU2 ΔCT 봉투와 동시 형질 감염된했다CD4 결합 된 형태 18. (A) 항 봉투 2G12, 또는 C11 A32 모노클로 날 항체 및 항-CD4 OkT4 단클론 항체를 사용하여 얻은 신호의 값 RLU. (B) CD4i 모노클로 날 항체 A32과 C11의 2G12 정규화 신호. 관련이없는 플라스미드로 형질 우물에서 얻은 신호에서 삼중의 SD ± 평균 값을 보이고있는 바와 같다 (더 봉투)를 차감하지 않습니다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험에서 얻어진 결과의 대표입니다. 증가 파란색 막대는 CD4의 양을 단계적 증가를 나타냅니다 익스 (1.7 NG, 3.5 NG, 7 NG)를 형질 전환되는과 빨간색 막대 (F43H을 CD4 돌연변이의 형질을 나타내는 반면, 회색 바, CD4의 부재에 표시 gp120의 상호 작용으로 감소 용량, 7 NG).
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Discussion
이 분석은 HIV-1 삼량 봉투는 세포 표면에 발현하여 특정 모노클로 날 항체의 상호 작용을 검출하기 위해 최적화된다. 프로토콜이 확립 한 후에는 전체적으로 낮은 재료 비용 및 항체의 적은 양의 높은 처리량으로 매체에서 사용될 수있다. 이 분석은 형질 기반이기 때문에, 용이하게 봉투의 형태에 미치는 영향을 연구하기 위해 같은 CD4와 같은 세포 단백질의 동시 발현을 위해 적응 될 수있다.
그러나,이 프로토콜의 형질베이스는 또한 가장 중요한 함정 한 것을 의미한다. 첫째, 항원이 기술로 연구 할 독립적 인 발현 벡터에 사용할 수 있도록해야합니다. 이와 같이, 다양한 임상 소스 또는 프로 바이러스 구조 유전자 봉투로부터 포유 동물 발현 벡터로 서브 클로닝 될 필요가있을 것이다. 전장 프로 바이러스 구조가 또한 이러한 방법에 사용할 수 있지만 (Veillette 외 참조. 18)이 또한 법을 암시필자 바이러스 입자 생산 따라서 적절한 biocontainment 시설에서 작업을 필요로.
또한,이 기술의 성공은 밀접하게 형질 전환 효율이 연결되어 있습니다. 얻어진 낮은 신호는 종종 형질 항원의 가난한 발현에 기인. 문제의 일반적인 소스는 플라스미드 DNA 품질, 형질 전환 시약입니다. 및 세포 생존 능력. 필요한 경우, 형질 전환 조건의 최적화는 또한 유동 세포 계측법 또는 웨스턴 블 롯팅과 같은 다른 기술을 사용하여 수행 될 수있다. 참고로, 그것은 몇 가지 봉투 구조의 발현이 최적이 될 수 있으므로 기술의 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다.
여기에서 우리는 이전에 설명 CD4i 모노클로 날 항체를 사용하여 HIV-1 봉투의 형태를 프로빙에 초점을 맞추었다. 이 설정은 봉투의 점 돌연변이 또는 동시 발현 단백질의 구조적 결과에 영향을 프로빙 분석 등의 폭 넓은 범위를 허용한다. 더욱이, 그 기술은 설명다시 다양한 봉투의 입체 형태에 대해 서로 다른 단클론 항체의 특이성을 조사하기 위해 서로 다른 형태 적 성향과 잘 특성화 된 봉투 돌연변이와 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 고도의 전문 장비 또는 노하우를 필요로하지 않는 동안 새로 고립 된 모노클로 날 항체의 쉽고 빠른 특성을 수 있습니다.
우리는 다양한 HIV-1 clades 다른 가까운 친척 계통 (HIV-2, SIV / Mac 용) 18 봉투에 대해이 방법을 사용하지만, 우리는이 분석은 다른 바이러스 가정들과 같은 추가 표면 항원에 대해 적용 할 수 있으리라 생각합니다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그의 관대 한 A32, 17B, 48D의 선물 및 C11 모노클로 날 항체 박사 제임스 로빈슨 감사합니다. PGT (121)는 NIH AIDS 시약 프로그램, AIDS, NIAID, NIH (고양이 # 12343) 부문을 통해 얻었다. 이 작품은 과학자 AF와 CRCHUM 연속체 보조금에 의해뿐만 아니라 CIHR 촉매 부여 # 126630로 # 24639을 부여 영 FRQS 설립하여, CIHR 운영 # 257792로, 혁신 프로그램 리더 # 29866에 대한 캐나다 재단에 의해 지원되었다 AF 및 MR합니다. AF는 FRSQ Chercheur Boursier 주니어 1 교제 번호에 24639를받는 사람이다. MV는 CIHR 박사 연구 상 번호 291485에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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