Introduction
Humana tipo 1 del virus de inmunodeficiencia (VIH-1) de entrada, mediada por las glicoproteínas de la envoltura viral triméricos (ENV) es el primer paso del ciclo infeccioso. Siendo el único antígeno viral expuesto presentado en la superficie de los viriones, la Env trímero provoca anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Como tal, representa un candidato interesante para el diseño inmunógeno de la vacuna. Sin embargo, los ensayos de vacunación con Env en formas solubles o recombinantes suscitó respuestas con sólo una eficacia mínima contra más primaria del VIH-1 aislados de 1-3. No obstante, la eficacia parcial observada en el ensayo de la vacuna RV144 4 renovado interés en el VIH-1 Env como candidato inmunógeno. Esto fue corroborado por un reciente estudio describiendo que los anticuerpos anti-Env vacuna-suscitó fueron suficientes para generar un cierto grado de protección contra el VIS y el VIH desafía 5.
Después de ser sintetizada en el retículo endoplásmico, el glycoprote Enven precursora, gp160, experimenta varias modificaciones post-traduccionales que son críticos para su capacidad para alimentar el proceso de fusión viral. El precursor de Env debe doblar correctamente y asociado en trímeros antes de ser escindida en sus gp120 y gp41 transmembrana extra-citoplasmáticos subunidades 6-10, con interacciones no covalentes que mantienen el enlace con gp120-gp41. La maquinaria de la célula infectada también es en gran medida responsable de glicosilar Env, que comprende aproximadamente 50% de su masa total 11,12. La compleja estructura resultante permite Env para ser conformacionalmente flexible de 13,14, mientras que proporciona una metaestabilidad que se piensa para permitir Env para adaptarse y ocultar ciertos epítopos altamente inmunogénicos que de otro modo estar expuestos 15-19, subrayando la importancia de comprender mejor las diferentes conformaciones muestreada por el trimer Env nativa.
Hasta la fecha, varias técnicas se han desarrollado y utilizado con éxito para estudiar Env ch conformacionalanges. Sin embargo, varían en sus limitaciones, está a menudo restringido a contextos específicos Env. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie o ensayos de inmunoprecipitación utilizando anticuerpos monoclonales específicos de conformación (mAbs), se basan ya sea en moléculas Env solubles o solubilizados monoméricas que se sabe que son inmunogenéticamente diferentes de sus formas triméricas 20,21. Estudios recientes también sugieren que la escisión afecta conformaciones resultantes Env en la exposición de los epítopos reconocidos principalmente por anticuerpos no neutralizantes 14,22,23.
A continuación se describe en detalle un método que permite la determinación rápida y fácil de la conformación de celularmente-expresado Env trímeros 18,24-26. Después de la transfección transitoria de Env en una línea de células adherentes humana la unión de los anticuerpos de Env-específicos se detecta utilizando una reacción de quimioluminiscencia simple. Esta técnica también se puede utilizar para caracterizar la preferencia conformacional de conformación depen-anticuerpos abolladura. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método robusto y altamente flexible de detección.
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Protocol
1. Día 1 - Cultivo Celular
- Plate 2 x 10 4 células por pocillo en un 96 pocillos placa de cultivo celular opaco adecuado para la lectura de luminiscencia osteosarcoma humano (HOS). Utilice Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Incubar hasta el día siguiente a 37 ° C, 5% de CO 2.
2. Día 2 - Polietilenimina (PEI) Transfección
- Preparar la mezcla de transfección de acuerdo con los pasos subsiguientes. Ajuste reactivos y cantidades de ADN de acuerdo con el número de pozos que van a ser transfectadas con el mismo Env.
- Tubo A: Añadir 10 ng de plásmido Tat-codificación (tal como pTat-III 27) y 150 ng de plásmido que codifica la Env a 5 l de DMEM suplementado con 25 mM HEPES.
- El plásmido Tat-codificación sólo es necesaria para utilizar plásmidos Tat-dependientes Env-codifican como pSVIII.
- Tubo B: Añadir 450 ng PEI (desde un 1g / l solución) a 5 l de DMEM.
- Añadir el contenido del tubo B al tubo A. Mezclar bien por agitación durante 10 segundos e incubar la mezcla de transfección de 10 minutos a temperatura ambiente (22 ° C).
- Añadir 10 l de la mezcla de transfección por pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
3. Día 4 - ELISA
- Lleve a cabo todos los experimentos a temperatura ambiente para reducir al mínimo posible la endocitosis de los complejos Env / anticuerpos.
- Preparar 250 ml de tampón de lavado por placa que se utilizan al mismo tiempo. Tampón de Lavado es solución salina tamponada con Tris 1X (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; NaCl 150 mM), suplementado con 1 mM de MgCl 2 y 1,8 mM CaCl 2.
- Preparar 125 ml de tampón de bloqueo por plato añadiendo leche en polvo sin grasa 1% y 5 mM Tris pH 8,0 y tampón de lavado.
- Retire el medio de cultivo de células y mezcla de transfección (sobrenadante) de la placa de 96 pocillos.
- Añadir 100 μ; L de tampón de bloqueo por pocillo y se incuba 20 min a TA.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 50 l de anticuerpo (o suero) por pocillo, se diluyó a la concentración apropiada en tampón de bloqueo. Típicamente, usar una concentración de 1 g / ml. Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave 3 veces con 100 l tampón de bloqueo y luego repetir 3x proceso de lavado con 100 l tampón de lavado.
- Aspirar el sobrenadante, añadir 100 l tampón de bloqueo, e incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 50 l de anticuerpo secundario, diluido 1/3000 en tampón de bloqueo. Variar dilución óptima de anticuerpo de acuerdo a las diferencias fabricante. Incubar 40 min a RT.
- Lave 3 veces con 100 l tampón de bloqueo y luego repetir 3x proceso de lavado con 100 l tampón de lavado.
4. Adquisición de Datos
- Aspirar el sobrenadante de la placa y añadir 30 l 1x aumento de quimioluminiscencia (ECL) de sustrato por pocillo.
- Adquirir chemiluminescence señal durante 1 seg / pocillo en un lector de placas adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo de lectura puede variar de acuerdo a las diferencias de hardware.
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Representative Results
Usando el procedimiento general descrito anteriormente, se adaptó el protocolo para ensayar el impacto de CD4 soluble (sCD4) y CD4 celular coexpressed en la exposición de los epítopos CD4i en cualquiera de tipo salvaje (wt) o mutado Env, como se describió previamente 18,24, 25,28. La figura 1 representa esquemáticamente el procedimiento general y la exposición de epítopos CD4i después del tratamiento con sCD4 o por coexpresión de CD4 celular 18. En la Figura 2, se utilizó sCD4 para inducir cambios conformacionales Env que exponen CD4i mAb 17b y 48d epítopos que solapan el sitio de unión del correceptor 24,29, mientras que el dominio exterior reconociendo mAb 2G12 no se ve afectada por este tratamiento como se esperaba 18,24.
El impacto de las mutaciones puntuales en Env conformación también se puede evaluar usando este ensayo, tal como se presenta en la Figura 3. Aquí se utiliza ya sea la capa 1 Env H66A mutante, conocida por tener una disminuciónd propensión a la muestra de forma espontánea la conformación unida a CD4 18,24,30,31 o un mutante (S375W) que predispone Env al estado CD4 unida 32 y obtenerse resultados concordantes (Figura 3A). En los casos donde se utilizan diferentes expressors Env, a menudo es necesario para normalizar los datos en bruto expresadas como unidades de luz relativas (RLU) de acuerdo con los niveles de expresión. En este caso, hemos utilizado PGT121, una parte mAb reconocimiento del escudo de glicano Env 33-35, como el anticuerpo de normalización (Figura 3B).
Como hemos descrito recientemente 18, la interacción de Env y CD4 en la misma célula conduce a cambios conformacionales env que exponen epítopos CD4i. En la Figura 4, cotransfected cantidades crecientes de un expressor CD4 junto con Env en el ensayo ELISA basado en células y se obtuvo el aumento de señales para CD4i mAb A32 y C11 18,36-38, que reconocen epítopos discontinuos en el dominio interior del GP120, mientras que el reconocimiento Env por el anticuerpo 2G12 conformacional-independiente no se vio afectada (Figura 4A). Con el fin de controlar la eficiencia de transfección entre las condiciones, los datos en bruto se normalizó a 2G12 (Figura 4B). El aumento de las señales obtenidas para A32 y los anticuerpos C11 dependía de la interacción Env-CD4, como se indica por la ausencia de A32 y C11 modulación cuando Env se cotransfectó con un mutante CD4 (F43H) con disminución de la capacidad para interactuar con Env 39.
Figura 1 Representación esquemática de la anti-Env ELISA basado en células. (A) Esquema general del procedimiento en el que las células HOS son transfectadas para expresar trimérica Env en la superficie celular. Env conformación puede ser muestreada por el uso de diferentes anticuerpos que reconocen específicaconformaciones (como CD4i mAbs). Las señales se detectan por quimioluminiscencia después de la tinción con mAbs anti-humanos-HRP conjugado. sCD4 (B) o coexpresión de celular CD4 (C) se puede utilizar para inducir Env cambios conformacionales que conducen a la exposición de epítopos CD4i.
Figura 2. sCD4 Env induce cambios conformacionales que conducen a la exposición de los epítopos CD4i. Interacción de sCD4 con el VIH-1 CO-JRFL? Ct Env mejora el reconocimiento por anticuerpos dirigidos a epítopos CD4i (17b, 48d), pero no por el anticuerpo que reconoce el dominio exterior gp120 2G12. Un plásmido que codifica el VIH-1 CO-JRFLΔCT Env se transfectó en cada pocillo y 48 horas después, las células se lavaron y se incubaron en presencia o ausencia de 4 mg / ml sCD4 durante 30 min a TA antes de continuing con el protocolo estándar (Día 4 - ELISA). A continuación, Env conformación se sondeó mediante incubación con 0,25 g / ml 2G12, 1 mg / ml 17b o 48d anti-Env mAbs durante 1 hora a RT. Las señales se detectaron por quimioluminiscencia después de la incubación con un anticuerpo anti-humano conjugado con HRP durante 45 min a TA. Se muestran los valores medios de RLU ± SD de seis repeticiones con señal obtenida de los pozos transfectadas con un plásmido irrelevante (sin Env) resta. Los datos son representativos de los resultados obtenidos en tres experimentos independientes, con un significado a prueba por dos vías ANOVA (ns, no significativo; ****, p <0,0001).
Figura 3. Modulación de Env conformación. VIH-1 YU2? Ct capa 1 mutante Env (H66A) disminuye CD4i reconocimiento 17b mientras que la variante de exposiciones S375Ws aumentó 17b de la señal y es suficiente para restablecer el fenotipo de la capa 1 mutante. (A) valores de RLU de las señales obtenidas utilizando anti-Env PGT121 y 17B mAbs. (B) las señales-PGT121 normalizado de CD4i mAb 17b después del tratamiento con o sin sCD4. Se muestran los valores medios ± SD de triplicados con la señal obtenida de pozos transfectadas con un plásmido irrelevante (sin Env) resta. Los datos son representativos de los resultados obtenidos en tres experimentos independientes, con significación probado por ANOVA de dos vías (**, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001).
Figura 4. coexpresión de CD4 celular aumenta el reconocimiento por los anticuerpos CD4i. Un plásmido que codifica CD4 se cotransfectó con VIH1 YU2? Ct Env para favorecerla conformación unida a CD4 18. (A) valores de RLU de las señales obtenidas utilizando anti-Env 2G12, A32 o C11 y el mAb anti-CD4 mAb OKT4. (B) Las señales 2G12-normalizados de CD4i mAb A32 y C11. Se muestran los valores medios ± SD de triplicados con la señal obtenida de pozos transfectadas con un plásmido irrelevante (sin Env) resta. Los datos son representativos de los resultados obtenidos en tres experimentos independientes. Barra gris indica en ausencia de CD4, mientras que la barra azul indica el aumento de un aumento gradual en la cantidad de CD4 expressor ser transfectadas (1,7 ng, 3.5 ng, y 7 ng) y barra roja indica la transfección de un mutante CD4 (F43H , 7 ng) con disminución de la capacidad para interactuar con gp120.
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Discussion
Este ensayo se optimiza para detectar la interacción de los mAb específicos con el VIH-1 trimérica Env expresada en la superficie celular. Una vez que el protocolo ha sido establecida, puede ser utilizado en medios a altos rendimientos con bajos costes de materiales globales y pequeñas cantidades de anticuerpos. Dado que este ensayo está basado en la transfección, puede ser fácilmente adaptado para la coexpresión de las proteínas celulares tales como CD4 con el fin de estudiar sus efectos sobre la conformación Env.
Sin embargo, la base de la transfección de este protocolo también implica que es uno de sus escollos más importantes. En primer lugar, los antígenos a estudiar con esta técnica están obligados a estar disponible en un vector de expresión independiente. Como tal, tendrían que ser subclonado en vectores de expresión de mamíferos genes env, procedentes de diversas fuentes clínicas o construcciones proviral. Mientras que de longitud completa proviral construcciones también se pueden utilizar en esta técnica (ver Veillette et al. 18), esto también implica actoive la producción de partículas virales por lo que requiere el trabajo en las instalaciones de biocontención adecuadas.
Por otra parte, el éxito de esta técnica está íntimamente ligada a la eficacia de transfección. Señales de baja obtenidos son a menudo debido a la mala expresión de antígenos transfectadas. Las fuentes típicas de los problemas son la calidad del ADN plásmido, reactivos de transfección. y células de viabilidad. Si es necesario, la optimización de las condiciones de transfección se podría realizar también utilizando otras técnicas, tales como citometría de flujo o transferencia Western. Es de destacar, también es importante ser conscientes de que la expresión de algunas construcciones Env podría ser subóptima y por lo tanto podría afectar el resultado de la técnica.
Aquí nos centramos en el sondeo del VIH-1 Env conformación utilizando descrito anteriormente CD4i mAbs. Esta configuración permite una amplia gama de análisis tales como sondeando el efecto de mutaciones puntuales Env o las consecuencias conformacionales de proteínas coexpressed. Por otra parte, la técnica descrita sere también se puede utilizar con mutantes Env bien caracterizado con diferente propensión conformacional con el fin de investigar la especificidad de diferentes mAbs para diversas conformaciones Env. Esto permite una caracterización fácil y rápida de mAbs recién aisladas, mientras que no requieren equipos de alta especialización o conocimientos técnicos.
Aunque sólo utilizamos este método contra Env de varios subtipos de VIH-1 y otros linajes pariente cercano (VIH-2, SIV / Mac) 18, creemos que este ensayo podría ser adaptado para los antígenos de superficie adicionales, tales como los de otras familias de virus.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de interés.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. James Robinson por su generosa donación de la A32, 17b, 48d, y C11 mAbs. PGT 121 se obtuvo a través del Programa de reactivos de SIDA de los NIH, la División de SIDA, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense para la Innovación Líder del Programa # 29866, por un operativo CIHR # 257792, por un Establecimiento FRQS de Joven Científico Grant # 24639 de la FA y por un subsidio continuo CRCHUM, así como por un CIHR subvención catalizador # 126630 a AF y RM. AF es el destinatario de un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 beca # 24639. MV fue apoyado por un Premio de Investigación Doctoral CIHR # 291485.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25,000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1 mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
References
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