Introduction
De zachte agar kolonievorming assay is een techniek veel gebruikt om cellulaire transformatie in vitro evalueren. Historisch andere test de clonogene assay beschreven door Puck et al. In 1956 werd gebruikt om het vermogen van cellen om kolonies te vormen 1 evalueren. In deze techniek werden cellen gedispergeerd op een kweekplaat en gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen of geconditioneerd medium noodzakelijke groeifactoren verschaffen. De beperking van deze techniek is dat het alleen informatie verstrekt over de vorming van kolonies. Normale cellen verhinderd verankering-onafhankelijke groei, door een bepaald type van apoptotische dood, genaamd anoikis 2. Echter, getransformeerde cellen hebben het vermogen om te groeien en delen zonder binding aan een substraat. Om te profiteren van dit concept, onderzoekers ontwikkelden de zachte agar kolonievorming assay. De zachte agar kolonieformatie assay is sindsdien gewijzigd, in meer recente jaren, te sp pakkenecifieke behoeften. Eén variatie omvat incorporatie van fluorometrische kleurstof om voor high-throughput kolonie tellen. Een andere variatie omvat het gebruik van gespecialiseerde agar oplossing om voor het ophalen van levensvatbare cellen na kolonievorming bij eiwit of DNA monsters nodig.
In de traditionele zachte agar kolonievorming assay worden cellen gekweekt in een laag zachte agar gemengd met celkweekmedium die rust op een laag zacht agar, ook gemengd met celkweekmedium, maar dat een hogere concentratie van agar. Dit voorkomt dat cellen van het naleven van de cultuur plaat, maar toch maakt getransformeerde cellen tot zichtbare kolonies vormen. De grondgedachte achter deze techniek is dat normale cellen afhankelijk cel extracellulaire matrix contact kunnen groeien en delen. Omgekeerd getransformeerde cellen kunnen groeien en verdeel ongeacht hun omgeving. Daarom cellen in staat zijn om kolonies te vormen in een verankering-onafhankelijke wijze werden considered te transformeren en carcinogeen. Het algemene doel van deze methode is deze mogelijkheid in cellen te meten in een semi-kwantitatief en strikte manier.
De Wnt signaleringsroute is van cruciaal belang in de embryogenese en vaak gedereguleerde in het ontstaan van tumoren 3-6. Er zijn meerdere routes in verband met Wnt-signalering. De canonieke weg omvat Wnt signalisatie en regulatie van de downstream-gen transcriptie door haar effecten op de transcriptionele coactivator beta-catenine. Wnts signaal ook door verscheidene nietcanonieke trajecten, bijvoorbeeld de planaire celpolariteit signaalweg die elementen voor het cytoskeletstructuur 7 regelt, en de Wnt-route calcium, wat afgifte van calcium reguleert van het endoplasmatisch reticulum 8. Wnt liganden oefenen hun activiteit uit door binding Frizzled receptoren. Hoewel verschillende Wnts is aangetoond opgereguleerd in longkanker, is Wnt7a aangetoond worden down-gereguleerd in niet-small cellige longkanker door promotor methylering 9. Wnt7a bindt Fzd9 en fungeert als een tumor suppressor via een niet-canonieke route. Herstel van Wnt-7a en VaZuDo-9 remt de groei van niet-kleincellige longkankercellen 10. De effecten van Wnt7a / Fzd9 worden gemedieerd door de activering van ERK-5, die op zijn beurt, activeert peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) 11,12. Hier tonen we aan dat overexpressie van Wnt7a en Fzd9 resulteert in de onderdrukking van verankering-onafhankelijke groei van een muizen longcarcinoom cellijn. Murine CMT167 cellen werden afgeleid van een longcarcinoom in C57BL / lcrf muizen 13 en werden stabiel getransfecteerd met Wnt7A en Fzd9. Overexpressie van Wnt7A en Fzd9 werden bevestigd door kwantitatieve PCR (Q-PCR) en de functionaliteit van Wnt7A en Fzd9 overexpressie werd bevestigd door stroomafwaartse activering van PPARy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de materialen en reagentia
- Label elk putje van een weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes adequaat voor elke cellijn of aandoening onderzocht.
- Bereid 2x celkweekmedium door het oplossen van 1 g poeder medium en 0,2 g natriumbicarbonaat in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml.
- Geef dit medium door een 0,2 um filter te steriliseren.
- Voeg extra componenten nodig voor normale kweek van de cellijn van belang. Zo groeien CMT 167 cellijn in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine oplossing. Warm medium tot 37 ° C in heet water bad vóór gebruik.
- Bereid 1x celcultuurmedium afzonderlijk als u zou doen voor een normale cel cultuur van de cellijn van belang.
- Bereid 1% noble-agar door 1 g nobel agar 100 ml gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Noble agar zal niet volledig oplossen met agitatie alleen. - Bereiden0,6% noble-agar door toevoeging van 0,6 g nobel agar 100 ml gedeïoniseerd water. Beide agar oplossingen kunnen worden gemaakt in 100 ml glazen flessen met afsluitbare deksels voor langdurige opslag.
- Autoclaaf de nobele agar mengsels te steriliseren. Deze mengsels kunnen vooraf worden gemaakt en bewaard bij 4 ° C maar moet zij opnieuw worden verwarmd op het moment van het experiment tot de agar volledig is opgelost.
- Bereid nitroblauwtetrazolium chloride oplossing door een 1 mg / ml voorraadoplossing in 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in H2O eindvolume van 1000 ml ). Dit wordt gebruikt aan het einde van het experiment om de kolonies vlekken.
2. Plating van onderlaag van Agar
- Draai de dop op de fles van 1% nobel agar en magnetron voor ongeveer 1-2 min. Bij verwarming in een magnetron, toezicht houden op de oplossing dicht om te voorkomen dat overkoken. Verhit, terwijl intermitterend mengen,tot agar volledig is opgelost en de oplossing helder is.
OPMERKING: Gebruik hittebestendige handschoenen om fles te behandelen na verhitting. Als u dit niet doet, kan brandwonden of ernstig letsel veroorzaken. - Plaats gesmolten agar-oplossing en voorverwarmde 2x kweekmedium in een ijs emmer gevuld met warm water uit de kraan (42 ° C). Plaats ook een 50 ml conische buis in een buis houder in het ijs emmer met heet water. Transfer emmer om celcultuur kap voor vervolgstappen.
- Voor de onderste laag van agar, zult u 1,5 ml van een mix van agar en medium per well van een 6-well plaat nodig.
- Om een voldoende hoeveelheid van het mengsel te garanderen, stelt een totaal van 12 ml per 6-wells plaat.
- Begin met het toevoegen 6 ml kweekmedium aan de 50 ml conische buis en vervolgens 6 ml van de 1% noble-agar oplossing.
- Inverteer de conische buis herhaaldelijk te mengen. Werken in een vlot tempo zal voortijdige verharding van de zachte agar te voorkomen.
- Opstellen van ongeveer 5,5 ml van het mengsel in een 5 ml serologische pipette.
- Laat de luchtbellen te stijgen naar de top van de pipet kolom voor het deponeren van 1,5 ml van dit mengsel in elk putje. Wees voorzichtig om afzetting van eventuele luchtbellen te vermijden in de putjes.
- Bedek de platen en laat agar mengsel stollen bij kamertemperatuur in celkweek kap, gedurende 30 min.
3. Plating de bovenste laag van Agar met cellen
- Zodra de onderste laag van agar gestold, beginnen bereiding van de bovenlaag.
- Eerst, oogst cellen door behandeling met trypsine en verdund ze 1: 5 in kweekmedium (bijvoorbeeld voor 1 ml trypsine wordt 4 ml medium) in een 15 ml conische buis.
- Aantal cellen en bereken het aantal cellen nodig is per putje om een uiteindelijke celsuspensie te bereiden op dit moment. Dit aantal zal variëren afhankelijk van celtype. Gebruik 5000 cellen / putje als uitgangspunt en indien nodig aanpassen. Voor dit aantal cellen, zou je een celsuspensie van 6667 cellen / ml te bereiden (dwz elke WELl wordt 0,75 ml van deze suspensie en 0,75 ml agar voor een totaal volume van 1,5 ml te ontvangen; de concentratie van cellen worden verdund 1: 2 bij een uiteindelijke totale celtelling 5000).
- Het volume celsuspensie nodig per putje van een 6-wells plaat weer 1,5 ml. Bereid extra celsuspensie in totaal 12 ml per 6-well plaat.
- Smelt 0,6% agar-oplossing in een magnetron als hierboven en het in een ijsemmer met warm water, samen met een 50 ml conische buis in een buis houder en de uiteindelijke celsuspensie van Stap 3.3.
- Breng de ijsemmer met gesmolten 0,6% agar aan celkweek kap voor vervolgstappen.
- Meng 0,6% agar en celsuspensie in een 1: 1 verhouding, het bereiden van een totaal volume van 12 ml per 6-wells plaat. 1.5 ml wordt per putje vereist maar extra moeten zijn zoals hierboven gesteld.
- Pipetteer 6 ml celsuspensie in de 50 ml conische buis.
- Vervolgens voegt 6 ml 0,6% agar aan de buis.
OPMERKING: De temperatuur van dit mengsel moet zijngehouden rond 42 ° C om voortijdige uitharding te voorkomen en celoverleving maximaliseren. - Snel werkende, pipet dit mengsel 2-3x om cellen te verdelen, dan is het opstellen van 5,5 ml van het mengsel in een 5 ml serologische pipet.
- Laat eventuele luchtbellen te laten stijgen naar de top van de pipet kolom voor het deponeren van 1,5 ml van dit mengsel in elk putje. Wees voorzichtig om afzetting van eventuele luchtbellen te vermijden in de putjes.
- Laat cellen / agar mengsel stollen bij kamertemperatuur in celkweek kap, 30 min alvorens in een 37 ° C bevochtigde celkweek incubator.
- De tijd vereist voor adequate kolonievorming verschilt voor elke cellijn, typisch rond 21 dagen.
- Een laag groeimedium te handhaven over de bovenste laag agar aan uitdroging te voorkomen. 100 pl medium tweemaal per week toegevoegd volstaat hiervoor.
4. het kleuren van de platen en Counting Koloniën
- Stain cellen door toevoeging van 200 _6, l nitroblauwtetrazolium chloride-oplossing per putje en incuberen platen overnacht bij 37 ° C.
- Zodra kolonies zijn gekleurd, neem foto's van putten met behulp van een imager en tel kolonies met behulp van software voor beeldanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De expressie van Wnt7A en Fzd9 in CMT167 cellen effectief in tumorsuppressie, zoals blijkt uit onze zachte agar kolonievorming assay. Voorlopig gebruikten we Q-PCR aangetoond dat Wnt7A en Fzd9 mRNA expressie in lage niveaus in CMT167 cellen. CMT167 cellen vertoonden lage niveaus van endogeen Wnt7A en Fzd9 vergelijking met MLE-12 cellen, een met SV40 getransformeerde murine long epitheliale cellijn (Figuur 1). We vervolgens getransfecteerd CMT167 cellen met twee retrovirale overexpressie vectoren die de menselijke constructies van Wnt7A (LNCX-Wnt7A) en Fzd9 (LPCX-Fzd9) om een stabiele cellijn die zowel Wnt7A en Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9) uitdrukt. We bevestigden de expressie van Wnt7A en Fzd9 door Q-PCR in deze cellijn (Figuur 2). Zoals onze eerdere werk heeft aangetoond, PPARy- is een downstream effector van Wnt7A / Fzd9 signalering. Wnt signaling pathways zijn divers. Daarom moeten de juiste expressie en activering van een bepaalde Wnt en haar FZD receptor ezels zijnsed gebruik van een stroomafwaartse effector die bekend is om te worden geactiveerd door de Wnt / FZD paar van belang. Voor Wnt7A en Fzd9, werd PPARy- gekozen om deze reden. We getransfecteerde CMT167 cellen overexpressie lege vectoren (LNCX / LPCX) of Wnt7A / Fzd9 met een luciferase reporter construct dat een PPARy- respons element. We toonden aan dat onze CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 cellijn had bijna verzesvoudigd PPAR-RE-activiteit (Figuur 3). Tenslotte, zoals eerder vermeld, de tumor suppressor activiteit van Wnt7A en Fzd9 in vitro bevestigen voerden we een zachte agar kolonievorming assay. CMT167 vector expressie en Wnt7A / Fzd9 expressie stabiele cellijnen werden uitgeplaat op zachte agar platen en liet kolonies vormen twee tot drie weken. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 gevormde cellen significant minder kolonies in vergelijking met vector getransfecteerde cellen illustreert de tumor suppressor functie Wnt7A en Fzd9 (figuur 4). Foto's zijn genomen van alle platen, en colonies werden geteld met behulp van een imager en imaging software.
Figuur 1: Verlaagde niveaus van Wnt7A en Fzd9 mRNA in CMT167 cellen vergeleken MLE-12 cellen Q-PCR-analyse werd uitgevoerd op mRNA niveaus van Wnt7a en Fzd9 genormaliseerd naar GAPDH bepalen.. Niveaus in CME167 murine longcarcinoomcellen werden vergeleken met die in MLE-12-SV40 getransformeerde murine long epitheelcellen, die genormaliseerd tot 1,0 waren. CMT167 cellen vertoonden lagere Wnt7a (A) en Fzd9 (B) mRNA in vergelijking met MLE-12 cellen.
Figuur 2:. Overexpressie van Wnt7a / Fzd9 in CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabiele cellijn Wnt7A / Fzd9 stabiele overexpressie menselijke constructies werden gemaakt met behulp van een LN CX retrovirale vector. Q-PCR werd uitgevoerd voor Wnt7A en Fzd9, en mRNA niveaus werden genormaliseerd tot GAPDH in lege vector getransfecteerde cellen en in Wnt7A / Fzd9 overexpressie cellen. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 cellen brachten hoge niveaus van Wnt7a (A) en Fzd9 (B) mRNA.
Figuur 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 stabiel tot overexpressie cellijn vertoont verhoogde PPAR-RE promotor activiteit CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 of lege vector CMT167 LNCX / LPCX stabiele overexpressie-cellen werden met een PPAR respons element promotor luciferase plasmide behulp lipofectaminereagens.. Promotoractiviteit werd gekwantificeerd vergeleken met vector getransfecteerde cellen, waarbij promotoractiviteit werd genormaliseerd tot 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabiele overexpressie cellen vertoonden een ongeveer zesvoudige toename PPAR promotoractiviteit.
Figuur 4:. Zachte Agar Kolonie Formatie Assay van-vector die CMT167 LNCX / LPCX cellen en CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 overexpressie cellen-vector die CMT167 LNCX / LPCX cellen en CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 overexpressie cellen werden uitgezet in een zachte agar kolonievorming per assay hierboven beschreven protocol. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 cellen vertoonden een duidelijke afname in de vorming van kolonies. Vertegenwoordiger putten waaruit kolonies voor elke cellijn. Afbeelding van putten representatief voor drie onafhankelijke experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro bevestiging van de tumor onderdrukkende functie van signaaleiwitten is moeilijk. Een van de meest rigoureuze testen waarover deze eigenschap onderzoeken is de zachte agar kolonievorming assay. Hier hebben we de zachte agar kolonieformatie test met behulp van een muizen longcarcinoomcellijn stabiel overexpressie Wnt7a en Fzd9 ten opzichte van zijn ouderlijke CMT167 cellijn geïllustreerd.
Er zijn een aantal belangrijke punten om te overwegen met betrekking tot de zachte agar assay. De meest kritische stap in deze test is het plateren van de cellen. Celtellingen moeten nauwkeurig zijn, en de agar-oplossing mag niet te heet zijn. Als er geen kolonies worden gevormd, kunnen de cellen zijn beschadigd door hittestress. In deze situatie moet de test worden herhaald, waarbij voorzorgsmaatregelen agar temperatuur dicht bij 42 ° C mogelijk. Als alternatief kan een groter aantal cellen uitgeplaat.
Er zijn een aantal beperkingen aan de zachte agar assay.Een dergelijke beperking is dat het twee tot drie weken voltooid. Een andere is dat het niet mogelijk voor mobiele ophalen na afloop. Modificaties van deze techniek gebruiken gespecialiseerde agar oplossingen om voor cellen voor DNA of eiwit assay na voltooiing worden geoogst. Alternatieve methoden gebruiken ook fluorometrisch kleurstof toe te staan voor high throughput assays. Niettemin de traditionele zachte agar kolonievorming test steeds één van de meest strenge tests voor bevestiging van verankering onafhankelijke celgroei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
