Introduction
軟寒天コロニー形成アッセイは、広く、インビトロで細胞形質転換を評価するために使用される技術である。歴史的に、別のアッセイは、パックらによって記載され 1956年にクローン原性アッセイは、コロニー1を形成する細胞の能力を評価するために使用した。この技術では、細胞を培養プレート上に分散させ、必要な成長因子を提供するための「フィーダー」細胞または馴化培地の存在下で増殖させた。この技術の制限は、それが唯一のコロニー形成に関する情報を提供したことであった。正常細胞は、アノイキス2と呼ばれるアポトーシス死の特定のタイプに、足場非依存性増殖を防止することができる。しかし、形質転換細胞は、基質に結合することなく成長し、分裂する能力を有する。この概念を活用するために、研究者らは軟寒天コロニー形成アッセイを開発しました。軟寒天コロニー形成アッセイは、以降のspに対応するために、より近年では、改変されているecificニーズ。一変形形態では、ハイスループットコロニー計数を可能にするために、蛍光色素の取り込みを含む。別の変形例は、タンパク質またはDNAのサンプルが必要な場合にコロニーを形成した後の生存細胞の回収を可能にするために特殊な寒天溶液の使用を含む。
従来の軟寒天コロニー形成アッセイにおいて、細胞は、軟寒天の別の層上に載っている細胞培養培地を含む軟寒天混合物の層で増殖される細胞培養培地と混合したが、寒天、より高い濃度で含有する。これは、培養プレートに付着する細胞を防ぎ、まだ目に見えるコロニーを形成する細胞を形質転換することを可能にする。この手法の背後にある理論的根拠は、正常細胞が成長し、分裂することができるように、細胞外マトリックスへの細胞接触に依存することである。逆に、形質転換された細胞は成長し、関係なく周囲の環境の分裂能を有している。したがって、足場非依存性の方法でコロニーを形成することができる細胞は、cた形質転換されるonsideredと発がん性。この方法の全体的な目標は、半定量的かつ厳格な方法で、細胞内でこの機能を測定することである。
Wntシグナル伝達経路は、胚発生に重要な、しばしば腫瘍形成3-6で脱調節されている。 Wntシグナル伝達に関連する複数の経路がある。標準経路は、転写コアクチベータカテニンに対するその効果を通してWntシグナル伝達および下流の遺伝子転写の調節を必要とする。 Wntはまた、例えば、いくつかの非標準的な経路を介して細胞骨格構造7、および小胞体8からのカルシウムの放出を調節するのWnt-カルシウム経路に関与する要素を調節する平面細胞極性経路を、信号。 Wntシグナルリガンドが結合フリッツルド受容体を介してその活性を発揮する。いくつかのWntが肺癌において上方制御されることが示されているが、Wnt7a、非Smalの中でダウンレギュレートされることが示されているプロモーターのメチル化9を介してLの細胞肺癌。 Wnt7aはFZD9を結合し、非標準的経路を介して腫瘍抑制因子として機能します。のWnt-7aおよびFZD-9の回復は、非小細胞肺癌細胞10の成長を阻害する。 Wnt7a / FZD9の効果は、ERK-5、今度は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）11,12を作動させるの活性化を介して媒介される。ここでは、Wnt7aおよびFZD9の過剰発現は、マウス肺癌細胞株の足場非依存性増殖の抑制をもたらすことを示している。マウスCMT167細胞はC57BL / lcrfマウス13で肺癌に由来しかつ安定Wnt7AおよびFZD9トランスフェクトした。 Wnt7AとFZD9の過剰発現は、定量的PCR（Q-PCR）によって確認したとWnt7AとFZD9過剰発現の機能は、PPARγの下流の活性化を介して確認された。
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Protocol
材料および試薬の調製
- 組織培養の各ウェルは、調査されて各細胞株または状態に対して適切に6ウェルプレートを処理したラベル。
- 粉末培地1gを、50mlの最終体積まで脱イオン水に炭酸水素ナトリウム0.2gを溶解することにより2倍の細胞培養培地を準備する。
- 滅菌するために0.2μmのフィルターを介してこのメディアを渡します。
- 関心のある細胞株の通常の培養に必要な追加コンポーネントを追加します。たとえば、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI 1640培地中でCMT 167細胞株を成長させる。湯浴中で37℃に温培地使用前に。
- あなたが興味のある細胞株の正常な細胞培養の場合と同じように別々の1x細胞培養培地を準備します。
- 脱イオン水100mlに希寒天1gを添加することにより、1％希寒天を準備する。
注：ノーブル寒天単独で攪拌しながら完全に溶解しない。 - 準備する脱イオン水100mlに希寒天0.6gを添加することにより寒天希0.6％。両方の寒天溶液は、長期保存のための閉鎖可能な蓋付きの100mlのガラス瓶中で行うことができる。
- 殺菌するために高貴な寒天の混合物をオートクレーブ。これらの混合物は、事前に作製し、4℃で保存したが、寒天が完全に溶解するまで、実験の際に再加熱されるべきであることができる。
- 千ミリリットルの最終容量に8gのNaCl、0.2gのKCl、1.44グラムHPO 4 2のNa、0.24グラムのKH H 2 Oで2 PO 4（1×PBS中1mg / mlのストック溶液を作製することにより、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液を調製）。これは、コロニーを染色するために、実験の終了時に使用される。
寒天の底層の2めっき
- 約1〜2分間、1％高貴寒天およびマイクロ波のボトルのキャップを緩めます。電子レンジで加熱しながら、オーバー沸騰を避けるために密接にソリューションを監視します。断続的に混合しながら、加熱を継続し、寒天を完全に溶解されるまで、溶液は透明である。
注：加熱後にフラスコを処理するために、耐熱手袋を使用してください。そうしないと、火傷や重傷を引き起こす可能性があります。 - 熱い水道水（42℃）で満たされたアイスバケット内で溶融した寒天液と予め温め2xの培養液を置きます。また、お湯でアイスバケット内チューブホルダーに50ミリリットルコニカルチューブを配置します。後続のステップのための細胞培養フードにバケツを転送します。
- 寒天の最下層では、6ウェルプレートのウェルあたり寒天培地の混合液1.5mlを必要とする。
- 混合物の十分な量を確保するために、各6ウェルプレート、12 mLの合計を準備する。
- 50mlのコニカルチューブに培地を6mlを添加することによって開始し、次いで1％の希寒天溶液を6ml。
- 混合するコニカルチューブを数回転倒。活発なペースで働くこと軟寒天の早すぎる硬化を防ぐことができます。
- 5ミリリットルの血清学的パイに、混合物の約5.5ミリリットルを策定pette。
- 気泡が各ウェルにこの混合物に、1.5mlの堆積前に、ピペットカラムの上部に上昇することを可能にする。プレートウェルに気泡の付着を避けるために注意してください。
- プレートをカバーし、寒天混合物を30分間、細胞培養フード内で、室温で固化することを可能にする。
3.細胞を含む寒天の上層めっき
- 寒天下層が凝固した後、上層の準備を開始する。
- （トリプシンの1ミリリットル用など培地4mlを加える）培地中で5 15ミリリットルコニカルチューブに：まず、トリプシン処理によって収穫細胞とは、彼らに1を希釈。
- 細胞をカウントし、この時点で最終的な細胞懸濁液を調製し、ウェル当たりに必要な細胞の数を計算する。この数は、細胞型に依存して変化する。 5000細胞/ウェルとしての出発点を使用し、必要に応じて調整します。この細胞数のために、 すなわち 、各welの（6667細胞/ mlの細胞懸濁液を調製うlはこの懸濁液の0.75ミリリットルと1.5ミリリットルの全容積のための寒天の0.75ミリリットルを受け取ります。 5000最後の総細胞数）が2：細胞の濃度はまた、1に希釈される。
- 6ウェルプレートのウェルあたりに必要な細胞懸濁液の量が再び1.5ミリリットルであろう。 6ウェルプレート当たり12ミリリットル合計追加の細胞懸濁液を準備します。
- 上記のように電子レンジで0.6％寒天溶液を融解し、ステップ3.3からのチューブホルダーおよび最終細胞懸濁液に50mlの円錐チューブに沿ってお湯を含むアイスバケットに入れる。
- 後続のステップのための細胞培養フードに溶融した0.6％の寒天をアイスバケットを転送します。
- 6ウェルプレートあたり12 mLの総体積を調製1：1の比で0.6％寒天および細胞懸濁液を混合する。 1.5ミリリットルウェルあたり必要とされますが、余分な上記のようになされるべきである。
- ピペット50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を6ml。
- その後、チューブに0.6％寒天の6ミリリットルを追加します。
注：この混合物の温度でなければならない時期尚早の硬化を回避し、細胞の生存を最大化するために周りに42°Cに保った。 - ピペットの細胞を分配するためにこの混合物を2〜3倍、迅速に作業し、その後5ミリリットルの血清学的ピペットに、混合物の5.5ミリリットルを策定。
- 気泡が各ウェルにこの混合物を1.5mlの堆積前に、ピペットカラムの上部に上昇することを可能にする。プレートウェルに気泡の付着を避けるために注意してください。
- セル/寒天混合物を37℃で加湿細胞培養インキュベーター中に配置する前に30分間、細胞培養フード内で、室温で固化することを可能にする。
- 適切なコロニー形成に要する時間は、約21日、典型的には、各細胞株ごとに異なる。
- 成長培地の層は乾燥を防ぐために、寒天の上層の上に維持されるべきである。週二回添加した培地100μlのは、この目的のために十分である。
4.プレートを染色し、コロニー数を計測
- 200を追加することによって染色細胞_6;ウェル当たりニトロブルーテトラゾリウムクロリド溶液リットル、37℃で一晩プレートをインキュベートする。
- コロニーを染色すると、撮像装置を使用して、ウェルを撮影し、画像解析ソフトウェアを用いてコロニーを数え。
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Representative Results
我々の軟寒天コロニー形成アッセイによって示されるようにCMT167細胞におけるWnt7AおよびFZD9の発現は、腫瘍抑制に有効である。予め、我々はWnt7AおよびFZD9 mRNAがCMT167細胞において低レベルで発現されることを示すためにQ-PCRを用いた。 MLE-12細胞は、SV40形質転換マウス肺上皮細胞株（ 図1）と比較した場合CMT167細胞は、内因性Wnt7AおよびFZD9の低いレベルを示した。私たちは、その後Wnt7AとFZD9（CMT LL Wnt7a / FZD9）の両方を発現する安定な細胞株を作成するためにWnt7A（LNCX-Wnt7A）とFZD9（LPCX-FZD9）の人間構築物を発現する2レトロウイルス過剰発現ベクターでCMT167細胞をトランスフェクトした。我々は、この細胞株（ 図2）においてQ-PCRによってWnt7AおよびFZD9の発現を確認した。私たちの前の仕事が示しているように、PPARγはWnt7A / FZD9シグナル伝達の下流エフェクターである。 Wntシグナル伝達経路は多様である。したがって、特定のWntおよびそのFZD受容体の適切な発現および活性化は、ロバでなければなりません関心のあるWntシグナル/ FZD対によって活性化されることが知られている下流のエフェクターを使用してsedの。 Wnt7AとFZD9の場合は、PPARγはこのような理由のために選択した。私たちは、PPARγ応答エレメントを含むルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、空のベクター（LNCX / LPCX）またはWnt7A / FZD9を過剰発現するCMT167細胞をトランスフェクトした。私たちは、CMT167 LL Wnt7A / FZD9細胞株はほぼ6倍に増加したPPAR-RE活性（ 図3）を有したことを示した。最後に、in vitroで Wnt7AおよびFZD9の腫瘍抑制活性を確認するために、前述のように、我々は、軟寒天コロニー形成アッセイを行った。 CMT167ベクターを発現させ、Wnt7A / FZD9は、安定発現細胞株は軟寒天プレートに播種し、2~3週間のためにコロニーを形成させた。 CMT167 LL Wnt7A / FZD9細胞はWnt7AおよびFZD9（ 図4）の腫瘍抑制機能を説明するための、ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して有意に少ないコロニーを形成した。写真は、すべてのプレートを撮影し、コロニーたsは、イメージャおよびイメージングソフトウェアを使用して計数した。
図1：MLE-12細胞と比較してCMT167細胞におけるWnt7AおよびFZD9 mRNAのレベルの減少 Q-PCR分析は、GAPDHに対して正規化Wnt7aおよびFZD9のmRNAレベルを測定した。 CME167中のレベルは、マウス肺癌細胞を1.0に正規化したMLE-12 SV40形質転換マウス肺上皮細胞のものと比較した。 MLE-12細胞と比較した場合CMT167細胞はWnt7a（A）およびFZD9（B）のmRNAのより低いレベルを示した。
図2：CMT167 LL Wnt7a / FZD9安定した細胞株におけるWnt7a / FZD9の過剰発現 Wnt7A / FZD9安定した過剰発現は、人間の構築物は、LNを用いて行った CXレトロウイルスベクター。 Q-PCRは、Wnt7AおよびFZD9を行った後、mRNAレベルは、空ベクタートランスフェクト細胞およびWnt7A / FZD9過剰発現する細胞においてGAPDHに対して正規化した。 CMT167 LL Wnt7a / FZD9細胞はWnt7a（A）およびFZD9（B）のmRNAを高レベルで発現した。
図3：CMT167 Wnt7a / FZD9安定した過剰発現細胞株の展示は CMT167 LL Wnt7a / FZD9 PPAR-REプロモーター活性を増加または空のベクターCMT167 LNCX / LPCX安定した過剰発現している細胞は、リポフェクタミン試薬を用いて、PPAR応答要素プロモータールシフェラーゼプラスミドでトランスフェクトした。プロモーター活性は、プロモーター活性が1.0に正規化したベクターでトランスフェクトした細胞と比較して定量した。 CMT167 LL Wnt7a / FZD9安定過剰発現する細胞は、PPARのプロモーター活性の約六倍の増加を示した。
図4：細胞を過剰発現する細胞を過剰発現ベクターの発現CMT167 LNCX / LPCX細胞およびCMT167 LL Wnt7a / FZD9の軟寒天コロニー形成アッセイベクター発現CMT167 LNCX / LPCX細胞およびCMT167 LL Wnt7A / FZD9は軟寒天コロニー形成に播種したプロトコールアッセイは、上記。 CMT167 LL Wnt7A / FZD9細胞は、コロニー形成の顕著な減少を示した。各細胞株についてコロニーを示す代表的な井戸。ウェルの写真は、3つの独立した実験の代表である。
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Discussion
シグナル伝達タンパク質の腫瘍抑制機能のインビトロでの確認は困難である。このプロパティを調査するために利用できる最も厳格なアッセイの1つは、軟寒天コロニー形成アッセイである。ここでは、安定的にその親CMT167細胞株と比較して、Wnt7aおよびFZD9を過剰発現するマウス肺癌細胞株を用いて、軟寒天コロニー形成アッセイを例示している。
軟寒天アッセイに関して考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。このアッセイにおいて最も重要なステップは、細胞のプレーティングされる。細胞計数は正確でなければならない、と寒天ソリューションは、熱すぎてはいけません。はコロニーが形成されていない場合は、細胞は熱ストレスによる損傷を受けている可能性があります。この状況では、アッセイは、可能な限り42°Cに近い寒天温度を保つための予防措置を取って、繰り返されるべきである。あるいは、細胞のより多数のメッキすることができる。
軟寒天アッセイにはいくつかの制限があります。一つのそのような制限は、それが完了するのを2〜3週間かかることである。もう一つは、それが完了すると、セルの検索のために許可していないということです。この技術の改変は、細胞は、アッセイの完了時にDNA又はタンパク質のために採取することを可能にするために特殊な寒天の手段を採用する。代替的な方法は、高スループットアッセイを可能にするために蛍光色素を利用する。それにもかかわらず、従来の軟寒天コロニー形成アッセイは、足場非依存性細胞増殖を確認するための最も厳格な試験の一つとして残る。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
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