Introduction
소프트 한천 콜로니 형성 분석은 널리 시험 관내 세포 변형을 평가하는데 사용되는 기술이다. 역사적으로, 퍽 등의 문헌에 의해 기술. 1956 년 다른 분석법, 클론 원성 분석은, 콜로니 하나를 형성하는 세포의 능력을 평가하는 데 사용 하였다. 이 기술에서, 세포는 배양 접시 상에 분산시키고, 필요한 성장 인자를 제공하기위한 '피더'세포 조정 배지의 존재하에 성장. 이 기술의 한계는 단지 콜로니 형성에 관한 정보를 제공하는 것이 었습니다. 정상 세포 인해 anoikis이 호출 아폽토시스 죽음의 특정 유형으로, 앵커리지 - 독립된 성장이 방지된다. 그러나, 형질 전환 된 세포는 기판에 결합하지 않고 성장 능력과 격차가있다. 이 개념을 활용하기 위해, 연구진은 부드러운 한천 콜로니 형성 분석을 개발했다. 소프트 한천 콜로니 형성 분석은 이후 SP를 해결하기 위해,보다 최근에는, 개질 된ecific 필요가있다. 하나의 변화는 높은 처리량 콜로니 카운팅 있도록 형광 염료의 혼입을 포함한다. 또 다른 변화는 단백질 또는 DNA 샘플이 필요할 때 콜로니 형성 후 생존 세포의 검색을 허용하기 위해 전문화 된 한천 용액의 사용을 포함한다.
전통적인 소프트 한천 콜로니 형성 어 세이에서, 세포는 또한 세포 배양 배지와 혼합 된 연질 한천, 다른 층에 달려 세포 배양 배지와 혼합 된 연질 한천 층에서 성장하지만, 한천의 높은 농도를 함유한다. 이 배양 접시에 부착 세포를 방지하면서도 가시 콜로니를 형성하는 형질 전환 세포를 허용한다. 이 기술 뒤에 근거는 정상 세포의 성장과 분할 할 수 있도록 세포 외 기질 접촉 세포에 의존한다는 것입니다. 반대로, 형질 전환 된 세포의 성장과 무관하게 항상 주변 환경 분할하는 능력을 가지고있다. 따라서, 앵커리지 독립적 인 방식으로 식민지를 형성 할 수 세포는 C했다onsidered은 변형과 암을 유발한다. 이 방법의 전반적인 목표는 반 정량적 엄격한 방식으로 세포에서이 기능을 측정하는 것입니다.
Wnt 신호 전달 경로는 배아 발생에서 중요한 종종 종양 3-6에서 해제 조절된다. Wnt 신호와 관련된 여러 경로가 있습니다. 정식 경로는 전사 보조 활성화 베타 카테닌 (β-catenin)에 미치는 영향을 통해 Wnt 신호 및 다운 스트림 유전자 전사 조절을 포함한다. Wnts는 예를 들어, 여러 비정규 경로를 통해 신호, 소포체 (8)에서 칼슘의 방출을 조절하는 세포 골격 구조 (7)에 관련된 요소를 조절하는 평면 셀 극성 통로, 그리고이 Wnt 칼슘 통로. 이 Wnt 리간드 Frizzled 수용체 결합을 통해 활성을 발휘한다. 여러 Wnts 폐암에서 상향 조절되는 것으로 도시 하였지만, Wnt7a 비 스말에서 하향 조절되는 것으로 밝혀졌다프로모터 메틸화 내지 9 리터 세포 폐암. Wnt7a가 아닌 정식 경로를 통해 종양 억제로 Fzd9과 행위를 결합한다. 이 Wnt-7a 및 FZD-9의 복원은 비 - 소세포 폐암 세포 (10)의 성장을 억제한다. Wnt7a / Fzd9의 효과 ERK-5, 차례로, 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ를 활성화 (PPARγ) 11,12의 활성화를 통해 매개된다. 여기서는 Wnt7a 및 Fzd9 과발현은 뮤린 폐 암종 세포주의 앵커리지 - 독립된 성장의 억제 결과 것을 보여준다. 쥐의 CMT167 세포는 C57BL / lcrf 마우스 (13)의 폐암에서 파생 된 안정적 Wnt7A과 Fzd9로 형질 감염시켰다. Wnt7A 및 Fzd9의 과발현이 양적-PCR (Q-PCR) 및 Wnt7A과 Fzd9 과발현의 기능에 의해 확인 하였다는 PPARγ의 다운 스트림 활성화를 통해 확인되었다.
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Protocol
재료 및 시약 1. 준비
- 레이블 조직 배양의 각 웰은 각각의 세포주 또는 조건에 맞게 6 웰 플레이트 치료가 연구되고.
- 분말 매체의 1g 및 50 ㎖의 최종 부피로 탈 이온수에 탄산 수소 나트륨 0.2 g을 용해시켜 배 세포 배양 배지를 준비한다.
- 소독하는 0.2 μm의 필터를 통해이 매체를 전달합니다.
- 관심의 세포 라인의 일반 문화에 필요한 추가 구성 요소를 추가합니다. 예를 들어, 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액으로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 CMT 167 세포주 성장. 사용하는 뜨거운 물을 욕조에 37 ° C 따뜻한 매체는 이전에.
- 만약 관심 세포주의 정상 세포 배양 용 마찬가지로 별도로 배속 세포 배양 배지를 준비한다.
- 탈 이온수의 고귀한 한천 100 ml의 1 g을 추가하여 1 % 귀족 한천을 준비합니다.
참고 : 빛나는 한천 혼자 교반 완전히 용해되지 않습니다. - 준비0.6 % 탈 이온수 100 ㎖에 귀금속 한천 0.6 g을 첨가하여 한천 노블. 두 한천 용액은 장기간 저장을 위해 폐쇄 가능한 뚜껑 100 ml의 유리 병에서 만들어 질 수있다.
- 소독 고귀한 한천 혼합물을 압력솥. 이러한 혼합물은 사전에 4 ° C에서 저장하지만 한천이 완전히 용해 될 때까지 실험시 재가열되어야 할 수있다.
- 1000 ml의 최종 부피로 H 2 O에 PO 4 HPO 4 1X PBS (8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g이 나트륨에 1 ㎎ / ㎖ 원액함으로써 nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드 용액을 준비하고, 0.24 g KH 2 ). 이 콜로니 얼룩이 실험의 마지막에 사용된다.
한천의 하단 레이어 2. 도금
- 약 1-2 분 동안 1 % 귀족 한천과 전자 레인지의 병 뚜껑을 풉니 다. 전자 레인지에 가열하면서, 끓어 방지하기 위해 밀접하게 솔루션을 모니터링 할 수 있습니다. 간헐적으로 혼합하면서 가열을 계속,한천이 완전히 용해 될 때까지 용액을 분명하다.
참고 : 가열 후 플라스크를 처리하기 위해 내열 장갑을 사용합니다. 그렇지 않을 경우 화상 또는 심각한 부상을 초래할 수 있습니다. - 뜨거운 수돗물 (42 ° C)로 가득 얼음 양동이에 녹아 한천 솔루션과 미리 예열 배 배양 배지를 놓습니다. 또한 뜨거운 물을 얼음 통에 튜브 홀더에 50 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 다음 단계는 세포 배양 후드에 버킷을 전송합니다.
- 한천의 맨 아래 층의 경우, 6 웰 플레이트 잘 당 한천의 믹스와 매체의 1.5 ml의가 필요합니다.
- 혼합물의 적절한 양을 보장하기 위해, 각각의 6- 웰 플레이트 12 ㎖가 총을 준비한다.
- 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배양 배지 6 ㎖의 1 % 귀금속 한천 용액, 6㎖를 첨가하여 시작.
- 혼합 원뿔 튜브를 여러 번 반전. 활발한 속도로 작업 부드러운 한천의 조기 경화를 방지 할 수 있습니다.
- 5 ml의 혈청 학적 파이로 혼합물의 약 5.5 ml의를 그립니다pette.
- 기포가 아니라 각에이 혼합물의 1.5 ml의 증착하기 전에 피펫 컬럼의 상단까지 상승 할 수 있습니다. 판 우물에 공기 방울의 증착을 방지하기 위해주의해야합니다.
- 플레이트를 덮고 한천 혼합물을 30 분 동안 세포 배양 후드에서 실온에서 고화 할 수있다.
3. 도금 한천 함유 세포의 상층
- 한천의 하층이 응고되면, 상층의 준비를 시작한다.
- (트립신 1 ml의 예 : 매체의 4를 가하여) 배지에서 5 15 ML 원뿔 튜브로 첫째, 트립신에 의해 수확 세포와 그들에게 일을 희석.
- 세포를 세어 이때 최종 세포 현탁액을 제조 웰 당 필요한 세포의 수를 계산한다. 이 숫자는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 5000 세포 / 웰 같은 시작점을 사용하고 필요에 따라 조정한다. 이 세포 수의 경우, 즉, 각 아 (6667 세포 / ml의 세포 현탁액을 제조 할난이 서스펜션의 0.75 mL 및 1.5 ml의 전체 볼륨에 대한 한천 0.75 ㎖를 받게됩니다; 5000의 최종 총 세포 수)가 2 : 세포 농도는 1 희석한다.
- 6- 웰 플레이트의 웰 당 필요한 세포 현탁액의 부피는 다시 1.5 ml의 것이다. 6 웰 플레이트 당 12 ml의 총 추가 세포 현탁액을 준비합니다.
- 상기와 전자 레인지의 0.6 % 한천 솔루션을 녹여 튜브 홀더 50 ML 원뿔 튜브와 단계 3.3에서 최종 세포 현탁액과 함께 뜨거운 물을 포함하는 얼음 양동이에 배치합니다.
- 후속 단계에 대한 세포 배양 후드에 녹은 0.6 % 한천과 얼음 통을 전송합니다.
- 6- 웰 플레이트 당 12 ml의 총 부피를 조제 : 1 비율 (1)에 0.6 % 한천 및 세포 현탁액을 섞는다. 1.5 ml를 웰 당 요구되지만 여분 위와 이루어져야한다.
- 피펫 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액의 6 ml의.
- 이어서, 튜브에 0.6 % 한천 (6)를 가하여.
참고 :이 혼합물의 온도를해야합니다조기 경화를 방지하고 세포 생존을 최대화하기 위해 약 42 ° C를 유지했다. - 피펫 세포를 배포 할 수있는이 혼합물을 2 ~ 3 배 빠르게 작동 후 5 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 혼합물의 5.5 ml의를 그립니다.
- 기포가 아니라 각에이 혼합물의 1.5 ml의 증착하기 전에 피펫 컬럼의 상단까지 상승 할 수 있습니다. 판 우물에 공기 방울의 증착을 방지하기 위해주의해야합니다.
- 셀 / 한천 혼합물을 37 ° C 가습 세포 배양 용 인큐베이터에 배치하기 전에 30 분 동안 세포 배양 후드에서 실온에서 고화하도록 허용.
- 적절한 콜로니 형성에 필요한 시간은 약 이십일일 전형적 각 세포주에 대해 변화한다.
- 성장 배지의 층은 탈수를 방지하기 위해 한천의 상층에 걸쳐 유지되어야한다. 회씩 첨가 배지 100 ㎕이 목적을 위해 충분하다.
4. 플레이트를 염색하고 계산 식민지
- 200을 첨가하여 스테인 셀 _6 웰, 37 ° C에서 밤새 배양 접시 당 nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드 용액 리터.
- 콜로니 염색되면, 이미 저를 사용하여 웰의 사진 촬영과 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 콜로니를 카운트.
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Representative Results
우리 소프트 한천 콜로니 형성 분석으로 도시 된 바와 같이 CMT167 세포 Wnt7A과 Fzd9의 발현은 종양 억제에 효과적이다. 예비, 우리는 Wnt7A과 Fzd9의 mRNA가 CMT167 세포에서 낮은 수준에서 표현되는 것을 보여주기 위해 Q-PCR을 사용했다. MLE-12 세포, SV40 형질 전환 쥐의 폐 상피 세포주 (도 1)과 비교할 때 CMT167 세포는 내인성 Wnt7A과 Fzd9 낮은 수준을 보였다. 우리는 두 개의 레트로 바이러스 과발현 벡터가 Wnt7A과 Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9)을 모두 표현하는 안정적인 세포주를 만들 Wnt7A (LNCX-Wnt7A)과 Fzd9 (LPCX-Fzd9)의 인간의 구조를 표현하는 CMT167 세포를 형질 전환. 우리는이 세포주 (그림 2)에서 Q-PCR에 의한 Wnt7A과 Fzd9의 발현을 확인했다. 우리의 이전 작업이 수 있듯이, PPARγ는 Wnt7A / Fzd9 신호의 다운 스트림 이펙터입니다. Wnt 신호 전달 경로는 다양하다. 따라서, 특정의 Wnt 및 FZD 수용체의 적절한 표현과 활성화 엉덩이해야합니다관심이 Wnt / FZD 쌍에 의해 활성화되는 것으로 알려져있다 하류 이펙터를 사용 나오지. Wnt7A 및 Fzd9를 들어, PPARγ는 이런 이유로 선택되었다. 우리는 PPARγ 반응 요소를 포함하는 루시퍼 라제 리포터 작 제물과 빈 벡터 (LNCX / LPCX) 또는 Wnt7A / Fzd9 CMT167 과발현 세포를 형질. 우리는 우리의 CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 세포주는 거의 6 배 증가 PPAR-RE 활동 (그림 3)를 가지고 있음을 보여 주었다. 시험 관내 및 Wnt7A Fzd9의 종양 억제 활성을 확인하기 위해, 이전에 언급 한 바와 같이 마지막으로, 우리는 연질 한천 콜로니 형성 분석을 수행 하였다. CMT167 벡터는 발현 및 Wnt7A / Fzd9 안정한 세포주 소프트 한천 플레이트 상에 도금 2~3 주 동안 콜로니를 형성시켰다 발현. Wnt7A 및 Fzd9 (도 4)의 종양 억제 기능을 나타내는 벡터 - 형질 감염된 세포에 비해 CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 세포는 훨씬 적은 콜로니 형성. 사진은 모든 플레이트의 촬영 및 콜로니했다S는 이미 저 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 계수 하였다.
도 1 : MLE-12 세포에 비해 CMT167 세포 Wnt7A과 Fzd9의 mRNA 수준을 감소 Q-PCR 분석을 GAPDH로 정상화 Wnt7a 및 Fzd9의 mRNA 수준을 결정하기 위해 수행되었다.. CME167 뮤린 폐 암종 세포에서의 수준은 1.0으로 정규화 된 MLE-12 SV40 형질 전환 된 쥐의 폐 상피 세포의 것과 비교 하였다. CMT167 세포 MLE-12 세포에 비해 Wnt7a (A)와 Fzd9 (B)의 mRNA의 낮은 수준을 보였다.
그림 2 :. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 안정적인 세포주에서 Wnt7a / Fzd9의 과발현 Wnt7A / Fzd9 안정적으로 과발현 인간의 구조는 LN을 사용하여 만들어졌다 CX 레트로 바이러스 벡터. Q-PCR은 Wnt7A 및 Fzd9 수행하고, mRNA 수준은 빈 벡터로 형질 감염된 세포 및 Wnt7A / Fzd9 과발현 세포에서 GAPDH로 정상화 하였다. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 세포는 Wnt7a (A)와 Fzd9 (B)의 mRNA의 높은 수준을 나타냈다.
그림 3 : CMT167 Wnt7a / Fzd9 안정적으로 과발현 세포주 전시 PPAR-RE의 프로모터 활성을 증가 CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 또는 빈 벡터 CMT167 LNCX / LPCX 안정적으로 과발현 세포를 리포 펙 타민 시약을 사용하여 PPAR 응답 요소 발기인 루시 페라 제 플라스미드로 형질 감염시켰다.. 프로모터 활성은 프로모터 활성을 1.0으로 정규화 된 벡터 형질 감염된 세포와 비교하여 정량 하였다. CMT167 LL Wnt7a은 / Fzd9 안정한 과발현 세포 PPAR 프로모터 활성의 약 6 배 증가 하였다.
그림 4 :. 세포를 과발현 세포를 과발현 벡터 발현 CMT167 LNCX / LPCX 세포와 CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 소프트 한천 콜로니 형성 분석 벡터 표현 CMT167 LNCX / LPCX 세포와 CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 부드러운 한천 콜로니 형성에 도금했다 프로토콜 당 분석은 전술. CMT167 LL Wnt7A은 / Fzd9 세포 콜로니 형성의 현저한 감소를 보였다. 각 세포주에 대한 식민지를 보여주는 대표적인 우물. 웰의 그림은 세개의 독립된 실험의 대표 값이다.
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Discussion
시그널링 단백질의 종양 억제 기능의 확인 시험 관내에서 곤란하다. 이 속성을 조사하기 위해 사용할 수있는 가장 엄격한 분석 중 하나는 부드러운 한천 콜로니 형성 분석이다. 여기서는 안정적으로 그 부모 CMT167 세포주에 비해 Wnt7a 및 Fzd9 과발현 뮤린 폐 암종 세포주를 사용하여 연질 한천 콜로니 형성 분석을 보여왔다.
부드러운 한천 분석에 대해 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항이있다. 이 분석에서 가장 중요한 단계는 세포 도금된다. 세포 수는 정확해야하며, 한천 솔루션은 너무 뜨거운 안됩니다. 어떠한 콜로니가 형성되지 않은 경우, 셀은 열 응력에 의한 손상되었을 수도있다. 이 상황에서 분석이 가능한 42 ° C에 가까운 한천 온도를 유지하기 위해 예방 조치, 반복해야합니다. 대안 적으로, 셀들의보다 많은 수의 도금 될 수있다.
부드러운 한천 분석에 몇 가지 제한 사항이 있습니다.하나는 이러한 한계는 완료 2-3 주 정도입니다. 또이 완료되면 셀 검색을 허용하지 않는 것입니다. 이 기술의 수정은 세포 분석이 완료되면 DNA 또는 단백질을 수확 할 수 있도록 전문 한천 솔루션을 사용합니다. 다른 방법은 또한 높은 처리량 분석법 있도록 형광 염료를 이용한다. 그럼에도 불구하고, 기존의 소프트 한천 콜로니 형성 분석은 앵커리지 독립적 세포 성장을 확인하기위한 가장 엄격한 시험 중 하나로 남아있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
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