Introduction
Den myke agar-kolonidannelse analyse er en teknikk som er mye brukt til å evaluere celletransformasjon in vitro. Historisk ble en annen prøvemetode, ble klonogene assay beskrevet av Puck et al. I 1956 brukt til å evaluere evnen til cellene for å danne en kolonier. I denne teknikken ble cellene dispergert på en dyrkingsplate og dyrkes i nærvær av '' mateceller eller kondisjonert medium for å tilveiebringe nødvendige vekstfaktorer. Begrensningen av denne teknikken var at det bare gitt informasjon om kolonidannelse. Normale celler er forhindret fra forankrings-uavhengig vekst, på grunn av en bestemt type apoptotisk død, kalt anoikis 2. Imidlertid transformerte celler har evnen til å vokse og dele seg uten binding til et substrat. For å kapitalisere på dette konseptet, utviklet forskere myk agar kolonidannelse analysen. Den myke agar kolonidannelse analysen har siden blitt endret, i de senere år, for å ta opp specific behov. En variant involverer inkorporering av fluorometrisk fargestoff for å tillate høy gjennomstrømming kolonitelling. En annen variant innebærer bruk av spesialisert agar-løsning for å tillate uthenting av levedyktige celler etter kolonidannelse når protein eller DNA-prøver er nødvendig.
I den tradisjonelle soft agar-kolonidannelse analysen, blir cellene dyrket i et lag av myk agar blandet med cellekulturmedium som hviler på et lag av myk agar, også blandet med cellekulturmedium, men inneholdende en høyere konsentrasjon av agar. Dette forhindrer at cellene fester seg til kulturplate, men likevel tillater transformerte celler for å danne synlige kolonier. Tanken bak denne teknikken er at normale celler er avhengige av cellen til ekstracellulære matrise kontakt for å være i stand til å vokse og dele seg. Omvendt, transformerte celler har evnen til å vokse og dele uavhengig av deres omgivende miljø. Derfor celler i stand til å danne kolonier i et forankrings-uavhengig måte ble considered å bli forvandlet og kreftfremkallende. Det overordnede målet med denne metoden er å måle denne evnen i celler i en semi-kvantitativ og strengere måte.
Wnt signalveien er kritisk i embryogenese og ofte de-regulert i tumorigenesis 3-6. Det finnes flere ulike veier forbundet med Wnt signalering. Den kanoniske veien involverer Wnt signalisering og regulering av nedstrøms gentranskripsjon gjennom dens virkninger på transkripsjons coactivator beta-catenin. Wnts også signal via flere ikke-kanonisk reaksjonsveier, for eksempel, den plane celle polaritet reaksjonsvei, som regulerer elementer involvert i cytoskeletal struktur 7, og Wnt kalsium-reaksjonsvei, som regulerer frigjøring av kalsium fra det endoplasmatiske retikulum 8. Wnt ligander utøve sin aktivitet gjennom bindende frizzled reseptorer. Selv om flere Wnts har vist seg å være oppregulert ved lungekreft, Wnt7a har blitt vist å bli nedregulert i ikke-small celle lungekreft gjennom promoter metylering 9. Wnt7a binder Fzd9 og fungerer som en svulst suppressor gjennom en ikke-kanonisk sti. Restaurering av Wnt-7a og Fzd-9 hemmer veksten av ikke-småcellet lungekreft celler 10. Virkningene av Wnt7a / Fzd9 blir mediert gjennom aktivering av ERK-5, som i sin tur, aktiverer peroksisom proliferator-aktivert reseptor γ (PPARγ) 11,12. Her viser vi at overekspresjon av Wnt7a og Fzd9 resulterer i undertrykkelse av forankrings-uavhengig vekst av en murin lunge carcinoma cellelinje. Murine CMT167 celler ble avledet fra en lunge carcinoma in C57BL / LCRF mus 13 og ble stabilt transfektert med Wnt7A og Fzd9. Overuttrykte Wnt7A og Fzd9 ble bekreftet av kvantitativ-PCR (Q-PCR) og funksjonaliteten til Wnt7A og Fzd9 overekspresjon ble bekreftet gjennom nedstrøms aktivering av PPARγ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av materialer og reagenser
- Merk hver brønn av en vevskultur behandlede 6-brønn plate på passende for hver cellelinje eller tilstand som skal undersøkes.
- Forbered 2x cellekulturmediet ved å oppløse 1 g pulver medium og 0,2 g natriumbikarbonat i de-ionisert vann til et sluttvolum på 50 ml.
- Pass dette mediet gjennom et 0,2 mikrometer filter for å sterilisere.
- Legg til flere komponenter som trengs for normal kulturen i cellelinje av interesse. For eksempel, vokser CMT 167 cellelinje i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin-løsning. Varm mediet til 37 ° C i varmt vannbad før bruk.
- Forbered 1x cellekulturmedium separat som du ville gjort for normal cellekultur av cellelinje av interesse.
- Tilbered en edel% agar ved tilsetning av 1 g av edel agar til 100 ml avionisert vann.
MERK: Noble agar vil ikke oppløses helt med agitasjon alene. - Forbered0,6% agar edel ved tilsetning av 0,6 g edel agar til 100 ml avionisert vann. Begge agar løsninger kan lages i 100 ml glassflasker med lukkbare lokk for langtidslagring.
- Autoklav de edle agar blandinger å sterilisere. Disse blandinger kan fremstilles på forhånd og lagret ved 4 ° C, men bør være oppvarmet på nytt ved tidspunktet for forsøket inntil agaren er helt oppløst.
- Forbered nitro-tetrazoliumklorid løsning ved å lage en 1 mg / ml stamløsning i 1 x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2 HPO 4, og 0,24 g KH 2PO 4 i H 2 O til sluttvolum på 1000 ml ). Dette vil bli brukt ved slutten av forsøket for å farge de kolonier.
2. Plating av nedste laget av Agar
- Løsne lokket på flasken med 1% edel agar og mikrobølgeovn i ca 1-2 min. Mens oppvarming i mikrobølgeovn, overvåke løsningen nøye for å unngå å koke over. Fortsett oppvarming, mens miksing midlertidig,inntil agar er fullstendig oppløst og oppløsningen er klar.
MERK: Bruk varmebestandige hansker for å håndtere kolbe etter oppvarming. Å ikke gjøre dette kan føre til forbrenninger eller alvorlige skader. - Plasser smeltet agar løsning og forvarmet 2x dyrkingsmedium i en isen bøtte fylt med varmt vann fra springen (42 ° C). Også plassere en 50 ml konisk rør i et rør holder i isen bøtte med varmt vann. Overfør bøtte til cellekultur hette for etterfølgende trinn.
- For den nederste lag av agar, må du 1,5 ml av en blanding av agar-medium og per brønn i en 6-brønns plate.
- For å sikre en tilstrekkelig mengde av blandingen, lage en total av 12 ml for hver 6-brønns plate.
- Start ved tilsetning av 6 ml kulturmedium til 50 ml konisk rør og deretter 6 ml av den 1% edel agar-løsning.
- Invertere det koniske røret flere ganger for å blande. Å jobbe i et høyt tempo vil hindre for tidlig herding av myk agar.
- Tegn opp ca 5,5 ml av blandingen i en 5 ml serologisk pipette.
- La de luftbobler til å stige til toppen av pipette kolonne før deponering 1,5 ml av denne blandingen i hver brønn. Vær forsiktig for å unngå deponering av eventuelle luftbobler inn i platebrønnene.
- Dekk platene og la agar blanding å stivne ved romtemperatur, i cellekultur hette, i 30 min.
3. Plating det øverste laget av agarholdig Cells
- Når det nedre lag av agar har størknet, begynner fremstillingen av det øvre lag.
- Først, slakte celler ved trypsinering og fortynne dem 1: 5 i kulturmedium (for eksempel for 1 ml av trypsin, tilsett 4 ml medium) over i et 15 ml konisk rør.
- Cellene telles og beregne antall celler per brønn som trengs for å fremstille en endelig cellesuspensjon på dette tidspunktet. Dette antall vil variere avhengig av celletype. Bruk 5000 celler / brønn som utgangspunkt og justere etter behov. For denne celle nummer, vil du forberede en celle suspensjon av 6667 celler / ml (dvs. hver well vil motta 0,75 ml av denne suspensjon og 0,75 ml agar for et totalvolum på 1,5 ml; Konsentrasjonen av cellene vil også bli fortynnet 1: 2 for en endelig totalcelletall på 5.000).
- Volumet av cellesuspensjonen nødvendig per brønn i en 6-brønn plate vil igjen være 1,5 ml. Forbered ekstra cellesuspensjon til sammen 12 ml per seks-brønns plate.
- Smelt 0,6% agaroppløsning i en mikrobølgeovn som ovenfor, og plasser det i isen bøtte inneholdende varmt vann sammen med et 50 ml konisk rør i et rør holderen og den endelige cellesuspensjon fra trinn 3.3.
- Overfør isen bøtte med smeltet 0,6% agar til cellekultur hette for etterfølgende trinn.
- Bland 0,6% agar og cellesuspensjon i et 1: 1 forhold, å fremstille et totalt volum på 12 ml per 6-brønns plate. 1,5 ml vil være nødvendig per brønn, men ekstra bør gjøres som ovenfor.
- Pipetter 6 ml cellesuspensjon i 50 ml konisk rør.
- Deretter legger 6 ml 0,6% agar til røret.
MERK: Temperaturen av denne blanding må væreholdt rundt 42 ° C for å unngå for tidlig herding, og for å maksimere celleoverlevelse. - Arbeider raskt, pipette denne blanding 2-3x å fordele cellene, så tegne opp 5,5 ml av blandingen inn i en 5 ml serologisk pipette.
- La eventuelle luftbobler til å stige til toppen av pipette kolonne før deponering 1,5 ml av denne blandingen i hver brønn. Vær forsiktig for å unngå deponering av eventuelle luftbobler inn i platebrønnene.
- Tillat celle / agar blandingen å stivne ved romtemperatur, i cellekultur hette, i 30 minutter før de plasseres i et 37 ° C fuktet cellekulturinkubator.
- Den tid som kreves for adekvat kolonidannelse varierer for hver cellelinje, vanligvis rundt 21 dager.
- Et lag av vekstmedium bør bli opprettholdt over den øvre lag av agar for å hindre uttørking. 100 ul medium tilsatt to ganger ukentlig er tilstrekkelig for dette formål.
4. farging Plater og Counting Colonies
- Flekk celler ved å legge 200 _6; l av nitro-blå tetrazolium-klorid-oppløsning per brønn og inkubering av platene over natten ved 37 ° C.
- Når kolonier er farget, ta fotografier av brønnene ved hjelp av et kamera og telle kolonier som bruker programvare for bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekspresjonen av Wnt7A og Fzd9 i CMT167 celler er effektive i tumor suppresjon, som vist ved våre myk agar-kolonidannelse assay. Foreløpig har vi brukt Q-PCR for å vise at Wnt7A og Fzd9 mRNA er uttrykt i lave nivåer i CMT167 celler. CMT167 celler viste lave nivåer av endogen Wnt7A og Fzd9 når sammenlignet med MLE-12-celler, en SV40-transformerte muse-lunge epitelcellelinje (figur 1). Vi deretter transfektert CMT167 celler med to retrovirale høyekspresjonsystemer vektorer uttrykke menneskelige konstruksjoner av Wnt7A (LNCX-Wnt7A) og Fzd9 (LPCX-Fzd9) for å skape en stabil cellelinje som uttrykker både Wnt7A og Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Vi bekreftet ekspresjon av Wnt7A og Fzd9 av Q-PCR i denne cellelinjen (Figur 2). Som tidligere arbeidet vårt har vist, er PPARγ en nedstrøms effektor av Wnt7A / Fzd9 signalering. Wnt signalveier er mangfoldig. Derfor må riktig ekspresjon og aktivering av en bestemt Wnt og dens reseptor Fzd være assessed bruker en nedstrøms effektor som er kjent for å bli aktivert av Wnt / Fzd par av interesse. For Wnt7A og Fzd9, ble PPARγ valgt på grunn av dette. Vi transfektert CMT167 celler overekspresjon tomme vektorer (LNCX / LPCX) eller Wnt7A / Fzd9 med en Luciferase reporter konstruere inneholder en PPARγ respons element. Vi viste at vår CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 cellelinje hadde nesten seksdoblet økt PPAR-RE aktivitet (figur 3). Til slutt, som nevnt tidligere, for å bekrefte aktiviteten til tumor-suppressor og Wnt7A Fzd9 in vitro, utførte vi en myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen. CMT167 vektor som uttrykker og Wnt7A / Fzd9 uttrykker stabile cellelinjer ble platet ut på agarplater myke og tillatt å danne kolonier i to til tre uker. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler dannet betydelig mindre kolonier sammenlignet med vektor-transfiserte celler, som illustrerer tumor suppressor funksjon av Wnt7A og Fzd9 (figur 4). Bildene ble tatt av alle platene, og colonies ble telt ved hjelp av et kamera og bildebehandling.
Figur 1: reduserte nivåer av Wnt7A og Fzd9 CMT167 mRNA i celler sammenlignet med MLE-12-celler Q-PCR-analyse ble utført for å bestemme mRNA-nivåer av Wnt7a og Fzd9 normalisert til GAPDH.. Nivåer i CME167 murin lunge carcinoma celler ble sammenlignet med de i MLE-12 SV40-transformerte muse-lunge epitelceller, som var normalisert til 1,0. CMT167 celler viste lavere nivåer av Wnt7a (A) og Fzd9 (B) mRNA sammenlignet med MLE-12-celler.
Figur 2:. Overuttrykte Wnt7a / Fzd9 i CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabil cellelinje Wnt7A / Fzd9 stabil høyekspresjonsystemer menneskelige konstruksjoner ble gjort ved hjelp av en LN CX retroviral vektor. Q-PCR ble utført for Wnt7A og Fzd9, og mRNA nivåer ble normalisert til GAPDH i tom-vektor transfekterte celler og i Wnt7A / Fzd9 overekspresjon celler. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9-celler uttrykte høye nivåer av Wnt7a (A) og Fzd9 (B) mRNA.
Figur 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 stabil overuttrykke cellelinje utstillinger økt PPAR-RE promoteraktivitet CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 eller tom vektor CMT167 LNCX / LPCX stabile overekspresjon celler ble transfektert med en PPAR respons element promoter luciferase plasmid hjelp Lipofectamine reagent.. Arrangøren aktivitet ble kvantifisert i forhold til vektor-transfekterte celler, der arrangøren aktivitet ble normalisert til 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 stabile overekspresjon celler viste en ca seksdobling i PPAR promoter aktivitet.
Figur 4:. Soft Agar Colony Formation analyse av vektor-uttrykke CMT167 LNCX / LPCX celler og CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 overekspresjon celler Vector-uttrykke CMT167 LNCX / LPCX celler og CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 overekspresjon Cellene ble sådd i en myk agar kolonidannelse assay per protokoll beskrevet ovenfor. CMT167 LL Wnt7A / Fzd9 celler viste en markant nedgang i kolonidannelse. Representative brønner som viser kolonier for hver cellelinje. Bilde av brønner er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro bekreftelse av tumorundertrykkende funksjon av signaleringsproteiner er vanskelig. En av de mest grundige analyser tilgjengelig for å undersøke denne egenskapen er myk agar kolonidannelse analysen. Her har vi illustrert i soft agar-kolonidannelse assay ved å bruke en murin lunge carcinoma cellelinje som stabilt overuttrykker Wnt7a og Fzd9 i forhold til sin CMT167 foreldrecellelinje.
Det er flere viktige punkter å vurdere om den myke agar analysen. Den mest kritiske trinn i denne analyse er plating av cellene. Celletall må være nøyaktig, og agar løsningen må ikke være for varmt. Hvis ingen kolonier dannet, kan cellene er blitt skadet på grunn av varmestress. I denne situasjonen bør analysen gjentas, å ta forholdsregler til å holde temperaturen agar så nær 42 ° C som mulig. Alternativt, kan et større antall celler som skal pletteres.
Det er noen begrensninger i myk agar analysen.En slik begrensning er at det tar to til tre uker for ferdigstillelse. En annen er at den ikke tillater for celle henting ved ferdigstillelse. Modifikasjoner av denne teknikken anvende spesialiserte agar løsninger for å tillate cellene å bli høstet for DNA eller protein ved analysen er fullført. Alternative metoder også benytte fluorometrisk fargestoff for å tillate høye gjennomstrømnings analyser. Likevel gjenstår den tradisjonelle soft agar-kolonidannelse assay som en av de mest strenge tester for bekreftelse av forankringsuavhengig cellevekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
