Introduction
O ensaio de formação de colónia em agar mole é uma técnica amplamente utilizada para avaliar a transformação celular in vitro. Historicamente, um outro ensaio, o ensaio clonogénico, descrito por Puck et al., Em 1956, foi utilizado para avaliar a capacidade das células para formarem colónias 1. Nesta técnica, as células foram dispersas numa placa de cultura e cultivadas na presença de células "alimentadoras" ou meio condicionado para fornecer factores de crescimento necessários. A limitação dessa técnica é que ele só forneceu informações sobre a formação de colônias. As células normais são impedidas de crescimento independente de ancoragem, devido a um determinado tipo de morte apoptótica, chamado anoikis 2. No entanto, as células transformadas têm a capacidade de crescer e dividir-se sem se ligar a um substrato. Para capitalizar sobre este conceito, os pesquisadores desenvolveram o ensaio de formação de colônia agar macio. O ensaio de formação de colónia em agar mole foi modificado desde que, nos anos mais recentes, para tratar spnecessidades ecific. Uma variação envolve a incorporação de corante fluorométrico para permitir a high-throughput contagem de colónias. Outra variação envolve a utilização de solução de agar especializada para permitir a recuperação de células viáveis após a formação de colónias quando são necessárias amostras de proteína ou de ADN.
No ensaio de formação de colónia em agar mole tradicional, as células são cultivadas numa camada de agar mole misturado com meio de cultura de células que repousa sobre uma outra camada de agar mole, também misturado com meio de cultura celular, mas que contém uma maior concentração de ágar. Isto impede que as células adiram à placa de cultura, ainda permite células transformadas de modo a formar colónias visíveis. O raciocínio por detrás desta técnica é que as células normais de células dependem de contacto de matriz extracelular para ser capaz de crescer e dividir. Por outro lado, as células transformadas têm a capacidade de crescer e dividir independentemente do seu ambiente circundante. Portanto, as células capazes de formar colónias de uma forma independente de ancoragem foram cConsiderado para ser transformada e carcinogénico. O objetivo geral deste método é medir essa capacidade das células de uma forma semi-quantitativa e rigorosa.
A via de sinalização Wnt é essencial na embriogênese e muitas vezes de-regulada na tumorigênese 3-6. Existem vários caminhos associados à sinalização Wnt. A via de sinalização Wnt canônica envolve e regulação da transcrição de genes a jusante através de seus efeitos sobre o coactivator transcricional beta-catenina. Wnts também sinalizar através de várias vias não canónicos, por exemplo, a via planar polaridade celular, que regula os elementos envolvidos na estrutura do citoesqueleto 7, e da via Wnt-cálcio, que regula a libertação de cálcio do retículo endoplasmático 8. Ligantes Wnt exercer a sua actividade através de receptores Frizzled obrigatório. Embora vários Wnts foram mostrados para ser regulada positivamente em cancro do pulmão, Wnt7a demonstrou ser regulada para baixo em não-smalcâncer de pulmão de células l através metilação do promotor 9. Wnt7a se liga Fzd9 e actua como um supressor de tumor através de uma via não-canónica. Restauração de Wnt-7a e FZD-9 inibe o crescimento de células não-pequenas de cancro do pulmão de células 10. Os efeitos da Wnt7a / Fzd9 são mediados através da activação de ERK-5, que por sua vez, activa γ do receptor activado por proliferador de peroxissoma (PPARy) 11,12. Aqui, mostramos que a sobre-expressão de Wnt7a e Fzd9 resulta na supressão do crescimento independente de ancoragem de uma linha de células de carcinoma de pulmão de murino. CMT167 células de ratinho foram derivadas de um carcinoma do pulmão em ratos C57BL / 13 e lcrf ratinhos foram estavelmente transfectadas com Wnt7a e Fzd9. A sobre-expressão de Wnt7a e Fzd9 foram confirmados por PCR quantitativo e em (Q-PCR) e a funcionalidade de Wnt7a e Fzd9 superexpressão foi confirmada através da activação de PPARy jusante.
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Protocol
1. Preparação de Materiais e Reagentes
- Rotular cada poço de uma cultura de tecido de 6 poços tratados placa de forma adequada para cada linha de célula ou condição a ser investigada.
- Prepare meio de cultura de células 2x por dissolução de 1 g de meio em pó e 0,2 g de bicarbonato de sódio em água desionizada até um volume final de 50 ml.
- Passa este meio através de um filtro de 0,2 um para esterilizar.
- Adicionar os componentes adicionais necessários para a cultura normal da linha celular de interesse. Por exemplo, crescer CMT linha 167 das células em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina solução. Aquece-se a média de 37 ° C em banho de água quente antes de ser utilizado.
- Prepare meio de cultura celular 1x separadamente, como você faria para cultura de células normais da linha de células de interesse.
- Prepare 1% de agar nobre por adição de 1 g de agar nobre a 100 ml de água desionizada.
NOTA: ágar Noble não se dissolverá completamente com agitação só. - Preparar0,6% de agar nobre por adição de 0,6 g de agar nobre a 100 ml de água desionizada. Ambas as soluções de agar podem ser feitas em garrafas de 100 ml de vidro com tampas que podem ser fechadas para armazenagem a longo prazo.
- Autoclave as misturas de agar nobres para esterilizar. Estas misturas podem ser feitas com antecedência e guardadas a 4 ° C, mas deve ser aquecido novamente no momento do experimento de agar até se ter dissolvido completamente.
- Preparar a solução de cloreto de tetrazólio nitroazul, fazendo uma solução mãe de 1 mg / ml em 1x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em H2O para volume final de 1000 ml ). Isto irá ser utilizado no final da experiência para corar as colónias.
2. chapeamento de camada inferior de Agar
- Solte a tampa na garrafa de 1% agar nobre e micro-ondas por cerca de 1-2 min. Durante o aquecimento no microondas, monitorar de perto a solução para evitar a ferver. Continuar o aquecimento, enquanto se mistura intermitentemente,ágar até estar completamente dissolvido e a solução é clara.
NOTA: Use luvas resistentes ao calor para lidar com frasco após o aquecimento. Não fazer isso pode causar queimaduras ou ferimentos graves. - Coloque solução agar derretido e pré-aquecido meio de cultura 2x em um balde de gelo cheia de água quente da torneira (42 ° C). Também se coloca um tubo cónico de 50 ml num suporte de tubos no balde de gelo com água quente. Balde para capa de cultura de células de transferência para as etapas subseqüentes.
- Para a camada inferior de agar, vai precisar de 1,5 ml de uma mistura de agar e meio por poço de uma placa de 6 poços.
- Para garantir uma quantidade adequada da mistura, preparar um total de 12 ml para cada placa de 6 poços.
- Comece por adição de 6 ml de meio de cultura para o tubo de 50 ml e em seguida 6 ml de solução de agar nobre a 1%.
- Inverter o tubo cónico várias vezes para misturar. Trabalhando em um ritmo acelerado irá prevenir o endurecimento prematuro do agar macio.
- Elaborar cerca de 5,5 ml de mistura em um 5 ml pi sorológicapette.
- Permitir que as bolhas de ar a subir para o topo da coluna antes de depositar pipeta 1,5 ml desta mistura para cada poço. Tenha cuidado para evitar a deposição de quaisquer bolhas de ar nos poços da placa.
- Cobrir as placas e permitir uma mistura de agar a solidificar à temperatura ambiente, na capa de cultura de células, durante 30 min.
3. chapeamento camada superior do agar contendo células
- Uma vez que a camada inferior de agar ter solidificado, começar a preparação da camada superior.
- Em primeiro lugar, as células de colheita por tripsinização e diluí-los 1: 5 em meio de cultura (por exemplo, para 1 ml de tripsina, adicionar 4 ml de meio) num tubo de 15 ml.
- Contagem de células e calcular o número de células por poço necessários para preparar uma suspensão de células final neste momento. Este número irá variar dependendo do tipo de célula. Use 5.000 células / poço como ponto de partida e ajustar, conforme necessário. Para este número de celular, você iria preparar uma suspensão de células de 6.667 células / ml (ou seja, cada poçol receberão 0,75 mL desta suspensão e 0,75 ml de ágar para um volume total de 1,5 ml; a concentração de células também será diluído 1: 2 para uma contagem de células total final de 5000).
- O volume de suspensão de células por poço necessária de uma placa de 6 poços irá novamente ser de 1,5 ml. Prepare suspensão de células adicional totalizando 12 ml por 6 poços.
- Derreter solução de agar a 0,6% em um micro-ondas como acima e colocar em balde de gelo contendo água quente juntamente com um tubo de 50 ml num suporte de tubos e a suspensão celular final do Passo 3.3.
- Transfira o balde de gelo derretido com 0,6% de agar para capa de cultura de células para as etapas subseqüentes.
- Misture 0,6% de agar e suspensão de células numa proporção de 1: 1, preparando-se um volume total de 12 ml por placa de 6 poços. 1,5 ml vai ser necessária por poço mas extra deve ser feita como acima.
- Pipetar 6 ml de suspensão de células para o tubo de 50 ml.
- Em seguida, adicionar 6 mL de 0,6% de agar para o tubo.
NOTA: A temperatura desta mistura deve sermantido em torno de 42 ° C para evitar o endurecimento prematuro e para maximizar a sobrevivência celular. - Trabalhando rapidamente, pipeta esta mistura 2-3x para distribuir células, em seguida, elaborar 5,5 ml de mistura em uma pipeta de 5 ml sorológica.
- Permitir que as bolhas de ar a subir para o topo da coluna antes de depositar pipeta 1,5 ml desta mistura para cada poço. Tenha cuidado para evitar a deposição de quaisquer bolhas de ar nos poços da placa.
- Permitir mistura de células / agar para solidificar à temperatura ambiente, na capa de cultura de células, durante 30 minutos antes de colocar um 37 ° C humidificado incubadora de cultura de células.
- O tempo necessário para a formação de colónias adequada varia para cada linha celular, tipicamente cerca de 21 dias.
- Uma camada de meio de crescimento deve ser mantido ao longo da camada superior de ágar-ágar para evitar a dessecação. 100 ul de meio adicionado duas vezes por semana é suficiente para esta finalidade.
4. coloração das placas e contagem de colônias
- Células Stain, adicionando 200 _6; l de solução de cloreto de tetrazólio nitroazul por cavidade e incubando as placas durante a noite a 37 ° C.
- Uma vez que as colônias estão manchadas, tirar fotografias de poços utilizando um gerador de imagens e contagem das colónias, usando software de análise de imagem.
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Representative Results
A expressão de Wnt7a e Fzd9 em CMT167 células é eficaz na supressão de tumores, como ilustrado pelo nosso ensaio de formação de colónia em agar mole. Preliminarmente, utilizou-Q-PCR para mostrar que Wnt7a Fzd9 ARNm e são expressos em níveis baixos em células CMT167. CMT167 células mostraram níveis baixos de Wnt7a endógena e Fzd9 quando comparado com células MLE-12, uma linha de células epiteliais de pulmão de murino transformadas com SV40 (Figura 1). Em seguida, transfectadas CMT167 células com dois vetores retrovirais superexpressão expressando construções humanas de Wnt7a (LNCX-Wnt7a) e Fzd9 (LPCX-Fzd9) para criar uma linha celular estável que expressa tanto Wnt7a e Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Confirmou-expressão de Wnt7a e Fzd9 por Q-PCR nesta linha de células (Figura 2). Como o nosso trabalho anterior mostrou, PPAR é um efetoras jusante da sinalização Wnt7a / Fzd9. Vias de sinalização Wnt são diversas. Portanto, a expressão correcta e a activação de um determinado Wnt e o seu receptor FZD deve ser burrossed usando um efector a jusante que é conhecida por ser activada pelo par de Wnt / FZD de interesse. Para Wnt7a e Fzd9, PPAR foi escolhido por este motivo. Nós transfectadas CMT167 células com superexpressão vetores vazios (LNCX / LPCX) ou Wnt7a / Fzd9 com uma construção repórter luciferase contendo um elemento de resposta PPAR. Nós mostramos que a nossa linha de células / Fzd9 CMT167 LL Wnt7a tinha quase seis vezes a atividade aumentou PPAR-RE (Figura 3). Finalmente, conforme mencionado anteriormente, para confirmar a actividade supressora de tumores de Wnt7a Fzd9 e in vitro, foi realizado um ensaio de formação de colónia em agar mole. CMT167 vector expressando e Wnt7a / Fzd9 expressando linhas celulares estáveis foram plaqueadas em placas de agar mole e deixa-se formar colónias de duas a três semanas. Células CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 formado significativamente menos colónias quando comparado com células transfectadas com vector, que ilustra a função supressora de tumores de Wnt7a e Fzd9 (Figura 4). Fotos foram tiradas de todas as placas e colonies foram contadas utilizando um software gerador de imagens e de imagem.
Figura 1: Níveis de Wnt7a e Fzd9 ARNm diminuída em comparação com células CMT167 MLE-12 células análise Q-PCR foi realizada para determinar os níveis de mRNA de Wnt7a e Fzd9 normalizadas para GAPDH.. Níveis em CME167 células de carcinoma de pulmão de murino foram comparados com aqueles em MLE-12 de murino do pulmão de células epiteliais transformadas com SV40, que foram normalizadas para 1,0. CMT167 células mostraram níveis mais baixos de Wnt7a (A) e Fzd9 ARNm (B) quando comparado com células MLE-12.
Figura 2:. Superexpressão de Wnt7a / Fzd9 em CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 linha celular estável Wnt7a / Fzd9 superexpressão estável construções humanas foram feitas usando um LN CX vector retroviral. Q-PCR foi realizada para Wnt7a e Fzd9, e os níveis de ARNm foram normalizados para GAPDH em células transfectadas com vector vazio e em células que sobre-expressam Wnt7a / Fzd9. Células CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 expressa níveis elevados de Wnt7a (A) e Fzd9 (B) mRNA.
Figura 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 exposições que sobre-expressam estável da linha de células aumentou a actividade do promotor de PPAR-RE células que sobre-expressam estáveis CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 ou vector vazio CMT167 LNCX / LPCX foram transfectadas com um elemento de resposta PPAR promotor de plasmídeo da luciferase utilizando o reagente Lipofectamina.. A actividade do promotor foi quantificada em comparação com células transfectadas com vector, em que a actividade do promotor foi normalizada para 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 células com superexpressão estáveis mostraram um aumento de cerca de seis vezes na atividade do promotor PPAR.
Figura 4: Agar Mole. Ensaio de Formação de Colónia CMT167 LPCX células que expressam vectores LNCX e / CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 células que sobre-expressam CMT167 LPCX células que expressam Vector LNCX / e CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 que sobre-expressam as células foram plaqueadas com a formação de colónia em agar suave ensaio de acordo com o protocolo descrito acima. CMT167 LL Wnt7a / células Fzd9 mostrou uma acentuada diminuição na formação de colônias. Poços representativos mostrando colônias para cada linha celular. Imagem de poços são representativos de três experiências independentes.
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Discussion
Em confirmação vitro da função supressora tumoral de proteínas de sinalização é difícil. Um dos ensaios mais rigorosos disponíveis para investigar essa propriedade é o ensaio de formação de colônia agar macio. Aqui, ilustramos o ensaio de formação de colónia em agar macio, utilizando uma linha de células de carcinoma de pulmão de murino que sobre-expressa de forma estável e Wnt7a Fzd9 em comparação com a sua linha de células parental CMT167.
Há vários pontos importantes a considerar em relação ao ensaio de agar macio. O passo mais importante neste ensaio é o plaqueamento das células. As contagens de células devem ser precisas, e a solução de ágar não deve ser demasiado quente. Se não houver colônias são formadas, as células podem ter sido danificados devido ao estresse térmico. Nesta situação, o ensaio deve ser repetido, tomando precauções para manter a temperatura de agar o mais próximo possível de 42 ° C quanto possível. Alternativamente, um maior número de células podem ser plaqueadas.
Há algumas limitações para o ensaio de agar mole.Uma tal limitação é que ele leva de duas a três semanas para a conclusão. Outra é que ela não permite a recuperação de células após a conclusão. Modificações desta técnica empregar soluções de agar especializados para permitir que as células a serem colhidas para o DNA ou proteínas por ensaio de conclusão. Métodos alternativos também utilizar corante fluorométrico para permitir ensaios de alto rendimento. No entanto, o ensaio de formação de colónia em agar mole tradicional permanece como um dos testes mais rigorosos para a confirmação do crescimento celular independente de ancoragem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
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