Introduction
Мягком агаре образование колоний анализ представляет собой метод широко используется для оценки клеточной трансформации в пробирке. Исторически сложилось так, другой тест, клоногенности, описывается шайба и др. В 1956 г. был использован для оценки способности клеток образовывать колонии 1. В этой технике, клетки были рассеяны на культуральную чашку и выращивают в присутствии '' фидерных клеток или кондиционированной среды, чтобы обеспечить необходимые ростовые факторы. Ограничение этого способа в том, что это только при условии, информацию в отношении образования колоний. Нормальные клетки не имеют возможности крепления-независимого роста, из-за того или иного вида апоптоза, называемой anoikis 2. Тем не менее, трансформированные клетки обладают способностью расти и делиться без привязки к подложке. Чтобы извлечь выгоду из этой концепции, исследователи разработали программную агар анализа формирования колонии. Мягком агаре анализ образование колоний с тех пор были изменены, в последние годы, для решения Specific потребности. Один из вариантов включает включение флуорометрического красителем, чтобы позволить для подсчета колоний высокой пропускной. Еще один вариант предполагает использование специализированного раствора агара, чтобы обеспечить извлечение жизнеспособных клеток после образования колоний, когда белок или ДНК пробы нужны.
В традиционном мягком агаре колонии анализа пласта, клетки выращивают в слое мягком агаре, смешанного с клеточной культуральной среде, которая лежит на другом слое мягком агаре, также в смеси с клеточной культуральной среды, но содержащий более высокую концентрацию агара. Это предотвращает клетки от присоединения к культурального планшета, пока позволяет трансформированные клетки образуют видимые колонии. Смысл этого метода является то, что нормальные клетки зависит от клетки к внеклеточной матрицы контакте, чтобы иметь возможность расти и делиться. И наоборот, трансформированные клетки обладают способностью к росту и делению, независимо от окружающей их среды. Таким образом, клетки, способные образовывать колонии в опоре-независимым способом были Considered должны быть преобразованы и канцерогенными. Общая цель этого метода заключается в измерении эту возможность в клетках в полу-количественного и строгой манере.
Сигнальный путь Wnt является критическим в эмбриогенезе и часто де-регулируется в онкогенеза 3-6. Есть несколько путей, связанные с Wnt сигнализации. Канонический путь включает Wnt сигнализацию и регулирование вниз по течению транскрипции генов через его влияние на транскрипционный коактиватора бета-катенина. Wnts также сигнализировать через несколько неканонические путей, например, плоской клеточной полярности путь, который регулирует элементы, участвующие в структуре цитоскелета 7, и путь Wnt-кальция, который регулирует высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума 8. Wnt лигандов проявляют свою активность посредством связывания Frizzled рецепторы. Хотя несколько Wnts, как было показано, чтобы быть активируется при раке легкого, Wnt7a было показано, что подавляется в не-Smalрак легких л клеток через метилирования промоторов 9. Wnt7a связывает Fzd9 и действует как подавитель опухоли через неканонической пути. Восстановление Wnt-7а и FZD-9 подавляет рост немелкоклеточного рака легкого ячеек 10. Эффекты Wnt7a / Fzd9 опосредованы активацией ERK-5, который, в свою очередь, активирует пероксисом γ-рецептора активатора пролиферации (PPAR, 11,12). Здесь мы показываем, что избыточная экспрессия Wnt7a и Fzd9 приводит к подавлению крепления независимый рост мышиной линии карциномы легкого клеток. Мышиные CMT167 клетки были получены из карциномы легких у C57BL мышей / 13 КЗоТ и были стабильно трансфицированные Wnt7a и Fzd9. Сверхэкспрессия Wnt7a и Fzd9 были подтверждены количественного-ПЦР (Q-PCR) и функциональности Wnt7a и Fzd9 гиперэкспрессией было подтверждено через потоку активации PPAR,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материалов и реагентов
- Этикетка каждую лунку культуре ткани обрабатывают 6-луночного планшета соответственно для каждой клеточной линии или состояния, которое исследованы.
- Подготовьте 2x клеточную культуральную среду путем растворения 1 г порошка среды и 0,2 г бикарбоната натрия в деионизированной водой до конечного объема 50 мл.
- Передайте эту среду через 0,2 мкм фильтр для стерилизации.
- Добавить дополнительные компоненты, необходимые для нормальной культуры клеточной линии, представляющей интерес. Например, растут СМТ линию 167 клеток в RPMI 1640 среде, дополненной 10% FBS и 1% раствор пенициллина / стрептомицина. Теплый среднего до 37 ° С в ванну с горячей водой перед использованием.
- Приготовьте 1х клеточную культуральную среду отдельно, как для нормальной клеточной культуре клеточной линии, представляющей интерес.
- Приготовьте 1% агар благородный путем добавления 1 г благородный агар до 100 мл деионизированной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Благородный агар не растворится полностью при перемешивании в одиночку. - Подготовить0,6% благородный агар, добавив 0,6 г благородный агар в 100 мл деионизированной воды. Оба агар растворы могут быть сделаны в 100 мл стеклянных бутылках с закрывающимися крышками для длительного хранения.
- Автоклав благородные агар смеси для стерилизации. Эти смеси могут быть сделаны заранее и хранили при 4 ° С, но следует снова нагревали в момент эксперимента, пока агар полностью не растворится.
- Подготовьте нитросинем раствора хлорида тетразолия, сделав 1 мг / мл маточного раствора в 1х PBS (8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4, и 0,24 г КН 2 РО 4 в H 2 O до конечного объема 1000 мл ). Это будет использоваться в конце эксперимента, чтобы окрасить колоний.
2. Покрытие из нижнего слоя агара
- Ослабить крышку на бутылке 1% благородного агар и микроволновой печью около 1-2 мин. При нагревании в микроволновой печи, следить за решение тесно, чтобы избежать при кипении. Продолжайте нагревание, при смешивании с перерывами,пока агар полностью не растворится и раствор не станет прозрачным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте термостойкие перчатки для обработки колбу после нагревания. Несоблюдение этого требования может привести к ожогам или серьезным травмам. - Поместите расплавленный раствор агара и предварительно нагревают 2x культуральную среду в ледяной ведро с горячей водой (42 ° С). Кроме разместить 50 мл коническую трубку в держателе трубки в ведро со льдом с горячей водой. Трансфер ведро на капот культуре клеток для последующих шагов.
- Для нижнем слое агара, понадобится 1,5 мл смеси агара и среды на лунку 6-луночного планшета.
- Чтобы обеспечить достаточное количество смеси, готовят в общей сложности 12 мл для каждой 6-луночного планшета.
- Начало добавлением 6 мл культуральной среды в 50 мл коническую пробирку, а затем 6 мл 1% раствора агара благородного.
- Обратить конической трубе несколько раз перемешать. Работа в быстром темпе будет предотвратить преждевременное затвердевание мягкого агара.
- Составьте примерно 5,5 мл смеси в 5 мл серологической пиPette.
- Разрешить пузырьки воздуха, чтобы подняться до верхней части колонны пипетки перед нанесением 1,5 мл этой смеси в каждую лунку. Будьте осторожны, чтобы избежать осаждения пузырьков воздуха в лунки планшета.
- Покрытие пластин агара и позволяют смеси затвердеть при комнатной температуре, в капот культуре клеток, в течение 30 мин.
3. Покрытие верхнего слоя агара, содержащие клетки
- После того, как нижний слой агара затвердеет, начать подготовку верхнего слоя.
- Во-первых, урожай клеток путем обработки трипсином и разбавить их 1: 5 в культуральной среде (например, на 1 мл трипсина, добавить 4 мл среды) в 15 мл коническую пробирку.
- Граф клеток и рассчитать количество клеток на лунку, необходимых для получения конечной суспензии клеток в это время. Это количество будет варьироваться в зависимости от типа клеток. Используйте 5000 клеток / лунку в качестве отправной точки и корректировать по мере необходимости. Для этого числа клеток, вы бы подготовить клеточной суспензии из 6667 клеток / мл (т.е. каждый вэйл получит 0,75 мл этой суспензии и 0,75 мл агара для общего объема 1,5 мл; концентрация клеток будет также разводили 1: 2 для конечного общего количества клеток в 5000).
- Объем клеточной суспензии, необходимой на лунку 6-луночного планшета с вновь будет 1,5 мл. Подготовьте дополнительный клеточной суспензии на общую сумму 12 мл на 6-луночный планшет.
- Melt 0,6% раствора агара в микроволновой печи, как указано выше, и поместите в ведре со льдом, содержащей горячую воду вместе с 50 мл коническую пробирку в держателе трубки и конечной суспензии клеток со стадии 3.3.
- Трансфер ведро со льдом с топленым 0,6% агара в капот культуре клеток для последующих этапов.
- Смешайте 0,6% агара и клеточной суспензии в соотношении 1: 1, готовит общий объем 12 мл на 6-луночный планшет. Потребуется 1,5 мл на лунку, но дополнительное должны быть сделаны, как описано выше.
- Пипетка 6 мл клеточной суспензии в 50 мл коническую пробирку.
- Затем добавляют 6 мл 0,6% агара к трубе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура этой смеси должна бытьхранится около 42 ° C, чтобы избежать преждевременного затвердевания и максимизировать выживание клеток. - Работа быстро, пипетка эту смесь 2-3 раза распространять клетки, затем составить 5,5 мл смеси в 5 мл серологические пипетки.
- Разрешить пузырьки воздуха, чтобы подняться на вершину колонны пипетки перед нанесением 1,5 мл этой смеси в каждую лунку. Будьте осторожны, чтобы избежать осаждения пузырьков воздуха в лунки планшета.
- Разрешить клеток / агар смесь затвердевать при комнатной температуре, в капот культуре клеток, в течение 30 мин перед помещением в 37 ° C увлажненном инкубаторе культуры клеток.
- Время, необходимое для адекватного образования колоний варьирует для каждой клеточной линии, как правило, около 21 дней.
- Слой ростовой среды следует поддерживать на верхнем слое агара, чтобы предотвратить высыхание. 100 мкл среды, дополненной два раза в неделю достаточно для этой цели.
4. окрашивания пластин и Подсчет колоний
- Пятно клетки, добавляя 200 _6; л тетразола раствора хлорида на лунку и инкубирования пластин в течение ночи при 37 ° С.
- После того, как колонии окрашиваются, фотографировать скважин с использованием тепловизора и рассчитывать колонии, используя программное обеспечение для анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выражение Wnt7a и Fzd9 в CMT167 клеток является эффективным в подавлении опухолевого как свидетельствует наша мягкой агар анализа формирования колонии. Предварительно, мы использовали Q-PCR, чтобы показать, что Wnt7a и Fzd9 мРНК выражены в низких уровнях в CMT167 клеток. CMT167 клетки показали низкий уровень эндогенного Wnt7a и Fzd9 по сравнению с ОМП-12 клеток, SV40-трансформированные мышиные линии легкого эпителиальных клеток (рисунок 1). Мы тогда трансфецировали CMT167 клетки с двумя ретровирусные векторы избыточная экспрессия выражения человеческих построений Wnt7a (LNCX-Wnt7a) и Fzd9 (LPCX-Fzd9) для создания стабильной клеточной линии, которая выражает как Wnt7a и Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9). Мы подтвердили выражение Wnt7a и Fzd9 по Q-PCR в этой клеточной линии (рисунок 2). Поскольку наша предыдущая работа показала, PPAR, является нижестоящим эффектором сигнализации Wnt7a / Fzd9. Wnt сигнальных путей разнообразны. Поэтому, собственно выражение и активация определенной Wnt и его рецептора FZD должны быть ослыСЭД, используя нисходящий эффектор, что, как известно, быть активирована пары Wnt / FZD интереса. Для Wnt7a и Fzd9, PPAR, был выбран по этой причине. Мы трансфецировали CMT167 клетки с гиперэкспрессией пустые векторы (LNCX / LPCX) или Wnt7a / Fzd9 с репортером конструкции люциферазы, содержащего элемент ответа PPAR,. Мы показали, что наша CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 клеточная линия была почти в шесть раз увеличилось PPAR-RE активность (рисунок 3). И, наконец, как уже упоминалось ранее, для подтверждения супрессор опухолей активность Wnt7a и Fzd9 в пробирке, мы провели анализ мягком агаре образование колоний. CMT167 вектор экспрессии и Wnt7a / Fzd9 выражения стабильные клеточные линии высевали на чашки с агаром мягких и позволил формировать колонии в течение двух-трех недель. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 клетки образуются значительно меньше колонии по сравнению с векторными трансфицированными клеток, иллюстрирующая функцию опухоль супрессорную Wnt7a и Fzd9 (рисунок 4). Фотографии получают на всех пластинах, и Колониы были подсчитаны с помощью программного обеспечения Imager и изображений.
Рисунок 1: Снижение уровня Wnt7a и Fzd9 мРНК в CMT167 клеток по сравнению с ОМП-12 клеток анализ Q-ПЦР проводили для определения уровня мРНК Wnt7a и Fzd9 нормированные к GAPDH.. Уровни в CME167 клетках карциномы легких мышиный были по сравнению с теми, в MLE-12 SV40-трансформированных мышиных эпителиальных клеток легких, которые были нормализованы до 1,0. CMT167 клетки показали более низкие уровни Wnt7a (A) и (B Fzd9) мРНК по сравнению с MLE-12 клеток.
Рисунок 2:. Сверхэкспрессия Wnt7a / Fzd9 в CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 стабильная клеточная линия Wnt7a / Fzd9 стабильная избыточная экспрессия человека конструкции были сделаны с помощью LN CX ретровирусный вектор. Q-ПЦР проводили для Wnt7a и Fzd9, и уровни мРНК были нормированы на GAPDH в пустыми векторных трансфекции клеток и в Wnt7a / Fzd9 гиперэкспрессией клеток. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 клетки экспрессируют высокие уровни Wnt7a (A) и (B Fzd9) мРНК.
Рисунок 3: CMT167 Wnt7a / Fzd9 экспонаты клеточная линия стабильно с гиперэкспрессией увеличилось PPAR-RE активность промотора CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 или пустой вектор CMT167 LNCX / LPCX стабильные сверхэкспрессирующие трансфекции клеток с ответа PPAR элемент промоутер люциферазы плазмиды с использованием Lipofectamine реагента.. Промоутер активность количественно по сравнению с векторными трансфицированными клеток, где промоутер деятельность нормализовалась к 1,0. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 стабильные сверхэкспрессирующие клетки показали примерно шесть-кратное увеличение активности промотора PPAR.
Рисунок 4: мягком агаре. Колонии Формирование анализа векторных экспрессирующих CMT167 LNCX / LPCX клеток и CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 сверхэкспрессией клеток, экспрессирующих Vector CMT167 LNCX / LPCX клетки и CMT167 LL Wnt7a / Fzd9, избыточно экспрессирующие клетки высевали в мягком агаре образование колоний Анализ в соответствии с протоколом описано выше. CMT167 LL Wnt7a / Fzd9 клетки показали заметное снижение образования колоний. Представительства скважин, показывающие колонии для каждой клеточной линии. Изображение скважин представляют три независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экстракорпоральное подтверждения опухоли подавляющих функцию сигнальных белков трудно. Один из самых строгих анализов, доступных для расследования этого имущества является мягкий агар анализ образования колоний. Здесь мы проиллюстрировали мягкий агар анализа формирования колонии, используя мышиную линию карциномы легких клеток стабильно с гиперэкспрессией Wnt7a и Fzd9 по сравнению с его родительской линии CMT167 клеток.
Есть несколько важных моментов, которые необходимо учитывать в связи с мягкой агар анализа. Наиболее важным шагом в этом анализе является покрытие из клеток. Подсчет клеток должна быть точной, и раствор агара не должна быть слишком горячей. Если нет колонии не образуются, клетки могут быть повреждены из-за теплового стресса. В этой ситуации, анализ следует повторить, принимают меры предосторожности, чтобы поддерживать температуру агар как можно ближе к 42 ° С, как это возможно. С другой стороны, большее количество клеток может быть покрытием.
Есть несколько ограничений на мягком агаре анализа.Одним из таких ограничений является то, что она занимает от двух до трех недель для завершения. Другой является то, что оно не допускает извлечение клеток после завершения. Модификации этой методики используют специализированные агар решения для обеспечения клетки должны быть собраны для ДНК или белка после завершения анализа. Альтернативные методы также используют флуорометрического краситель, чтобы обеспечить высокую пропускную способность анализов. Тем не менее, традиционные мягком агаре анализ образование колоний остается одним из самых строгих тестов на подтверждение крепления-независимого роста клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cancer Cell Line of Interest | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 Cells |
| Powdered RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-089 | Used to prepare 2x cell culture medium. |
| Liquid RPMI 1650 Medium | Cellgro | 10-040-CV | Referred to as 1x cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30910.03 | Used to supplement cell culture medium. |
| Penicillin/Streptomycin | CellGro | 30-002-Cl | Used in cell culture medium. |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | 214230 | Used to prepare 1.0% and 0.6% agar. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP-328-1 | Used in 2x cell culture medium. |
| Trypsin | Cellgro | 25-050-Cl | |
| Sterile Bottle-Top Filters | Fisher | 09-761-126 | Used to sterile filter 2x medium. |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-020 | Used in PPAR-RE luciferase assay. |
| 6-well Plates Tissue-culture Treated | |||
| 37 °C/5% CO2 Incubator | |||
| Chemi-Doc Imager | Bio-Rad | Used to take pictures of colonies. | |
| Quantity One Software | Bio-Rad | Used to count cell colonies. | |
| 15 ml Conical Tubes | |||
| 50 ml Conical Tubes | |||
| 250 ml Erlenmeyer Flasks | |||
| Microwave | |||
| 5 ml Serological Pipettes | |||
| Pipette Aid | |||
| Micropipette | |||
| Hemacytometer w/ cover slip | |||
| Pipette Tips | |||
| Inverted Light Microscope | |||
| Centrifuge | |||
| Heat-Resistant Gloves | |||
| Saran Wrap | |||
| Ice Bucket |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
- Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
- Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
- De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
- Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
- Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
- Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
- Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
- Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).
