Introduction
有配对并tissuesis 1的医学科学，因为在一个组织ororgan的病变可以是失能，并且在一些情况下，致命的themain目标的再生。在上下文中，卫生工作者和研究人员一直在寻找技术，方法和工具，提供了新的治疗同类软件推广有一双再生受损组织的过程。因此，生物医学科学的重点是间充质干细胞（MSC），尤其是成体干细胞的研究，因为这种细胞谱系表示研究该组织再生的过程中，一个理想的模型，由于其潜在的分化为外胚层，中胚层，内胚层和细胞谱系不过，为了使治疗用的MSC现实，MSC的thetherapeutic潜在的表征必须伴随着使用的生物材料和细胞支架是保证在宿主组织的MSCs的期望的行为的新的细胞培养技术的实施。
Protocol
按照世界医学协会的有关研究涉及人类的道德行为赫尔辛基宣言进行这项研究并批准了Facultad德医学设备，墨西哥国立自治大学（项目编号101-2012）的研究伦理委员会。
1.隔离人类骨髓间充质干细胞
- 试剂的制备
- 制备磷酸盐缓冲盐水液（PBS），并补充有1％的抗生素 - 抗真菌剂溶液。
- 制备的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，高葡萄糖（HG-DMEM）中，并通过过滤通过0.2微米的过滤器中添加10％胎牛血清（FBS）和1％抗菌 - 抗霉菌solution.Sterilize此培养基。
- 准备在100U / ml的胶原酶II溶液中的HG-DMEM无FBS或抗生素 - 抗真菌剂溶液。
- 消毒以下手术器械，其所需的隔离，通过高压：标准剪S，简单解剖钳，细点和齿镊和手术刀手柄（＃4）。
- 羊膜的间充质干细胞的分离
- 用一只手握住脐带并用另一只手，拆下羊膜（AM），它看起来像一透光性片，以得到的大约5厘米2的片段。如果绒毛膜部分是存在于样品中，通过手动解剖分离底层绒毛膜如绒毛膜部比羊膜厚。
- 除去残留的血液用5毫升的PBS洗涤三次，并除去血块用简单的钳子。做一个小切口，在AM与手术刀产生的约为0.5 平方厘米的碎片。
- 羊膜酶消化
- 孵育在AM用5ml 0.125％胰蛋白酶的/ 0.5mM EDTA的在5％CO 2的气氛中的溶液在37℃下进行30分钟，在50ml锥形管中在37℃。离心机在250XG和25℃进行5分钟，然后通过丢弃上清液除去胰蛋白酶溶液。
- 加入15 ml胶原酶II型溶液孵育2小时，在37℃在5％CO 2的气氛中利用根据莱瓦等偶尔摇动。9
- 立即消化用胶原酶II，之后加入15毫升的PBS和离心机在250×g离心并25℃下进行10分钟。
- 弃去上清液，并用15毫升PBS溶液和离心机在250×g离心并25℃下进行15分钟，洗涤细胞沉淀。弃去上清液。
- 通过摇动轻轻悬浮在10ml的HG-DMEM中的细胞团。
- 膨胀间质干细胞
- 种子2毫升细胞悬浮液（1×10 4个细胞/ cm 2）在培养瓶中，并在一个5％CO 2的气氛中加2ml HG-DMEM中孵育所述细胞在37℃。通过改变后5-7培养基消除非粘附细胞天。
- 在此时间后，改变培养基，每3天额外7-10天，以获得90％的蜂窝汇合。
- 回收细胞，并培育它们进行5分钟，在37℃下在5％CO 2的气氛中以0.125％胰蛋白酶/ EDTA溶液（胰蛋白酶）。
- 立即胰蛋白酶消化后，收集细胞用吸管，并转移到15毫升锥形管中并离心，在250×g离心5分钟。
- 弃上清，悬浮细胞团在10毫升HG-DMEM的。
- 两个75cm 2的培养瓶中培养的细胞悬浮液（5毫升每个烧瓶），并维持培养直至90％汇合。
- 重复步骤1.4.3。到1.4.6，直到第九通道或亚文化。
- 恢复细胞胰蛋白酶在步骤1.4.3至1.4.5流式细胞仪或其他研究。
2.制备多孔骨基质盘（NKB）
- 湿润NKB盘（直径12毫米;厚度2mm）的。，孵育每个磁盘过夜用3ml在5％的CO 2，在37℃的潮湿空气中的HG-DMEM无胎牛血清，根据Fassina 等人 5
- 润湿过程后，将盘在50ml锥形管中并旋转，在250×g离心5分钟以除去过量的培养基。放置盘在24孔细胞培养板。
- 加入500微升的HG-DMEM中并温育30分钟，在25℃。确保无气泡存在的NKB盘青睐的营养物质和细胞的正确分布上。
- 如果气泡在磁盘上观察到，震动和添加300微升培养基，并在5％的CO 2的潮湿空气中孵育15分钟，在37℃。在此时间后取出300微升培养基中通过孔细胞培养的壁抽吸，并确认没有气泡形成。
- 放置在磁盘中使用简单的镊子一个新的24孔板中。
- 从三个亚文化种子的蜂窝悬浮液（5×10 5的AM-的hMSCs在100μlHG-DMEM中），预润湿的生物材料的磁盘的表面上，并在5％的CO 2的潮湿空气中孵育30分钟，在37 ℃。在生物材料上的上表面上慢慢地和连续地进行此步骤，以使细胞与所有支架的地形交互。注意：此过程实现附着在表1中示出的生物材料的细胞的60％。
- 添加1.5毫升HG-DMEM中，在37℃，并维持培养3天，在5％的CO 2的潮湿气氛中在37℃。不会产生湍流，除了培养基为避免细胞在培养板培养皿的底部的沉积。这是最初的时候。
4.细胞表面标志特征流动Cytometry
- 他们播种基质磁盘上之前分离9 日传代细胞。使用0.25％胰蛋白酶/ 1mM EDTA和修复它们在冰冷的2％甲醛30分钟。下列固定，用0.05％的PBS洗一次细胞。
- 阻断非特异性结合通过在冰上孵育细胞，用20％的人免疫球蛋白为3分钟，并孵育0.1×10 6个细胞的等分试样用藻红蛋白（PerCP）偶联的单克隆抗CD73，FITC缀合的单克隆抗体CD90，抗CD34的PE缀合的单克隆抗体，FITC缀合的单克隆抗体的CD45和PE缀合的单克隆抗体CD105 1小时，在25℃在黑暗中。同种型匹配FITC缀合的单克隆抗体，PE缀合的MAb andPerCP共轭的MAb将作为阴性对照。
- 计算使用软件进行数据采集和分析的表面标志物的表达水平。
5.细胞粘附检测用扫描电子显微镜
- 用PBS漂洗，在培养3天后的细胞的样品盘的两倍和fixthe样品用4％（体积/体积）戊二醛solutionin的0.1M的Na-卡可酸盐缓冲液（pH 7.2）。
- 制备的样品进行显微观察，如先前报道里维拉-N 等人 ，10，并观察使用扫描电子显微镜以15千伏的电位，并在500X和2000X的放大倍数。
6.细胞增殖试验
- 到含1.5毫升培养培养基中，所述细胞-磁盘样品中的5％CO 2的潮湿气氛中添加150微升，根据重要的着色剂（AB）的制造商的指导方针和孵育所述细胞在37℃。
- 立即加入B（0小时）和每24小时，直到达到培养细胞7天之后，测量570nm处的吸光度与600nm的参考波长。
7.菌落形成单位（CFU）11
- 每100mm组织培养迪斯HG-DMEM中培养100细胞孵育14天，在5％的CO 2，在37℃的潮湿空气中。
- 在甲醇中，在室温下5-10分钟洗培养，用PBS和染色用0.5％的结晶紫。
- 洗用PBS将板两次，并使用血细胞计数器计数的可见菌落。
Representative Results
人类骨髓间充质干细胞分离
从利用钝性剥离（ 图1）绒毛膜调幅的机械分离后，用胰蛋白酶和胶原酶II消化得到的粘附细胞群。 3天附着在培养皿PRESENTA成纤维细胞样细胞形态，这些细胞群体后分离自健康捐赠者的母亲，得到如图所示的光学显微照片（ 图2A）和扫描电子显微照片（ 图2B）在这项工作中使用.The胎盘withprevious知情同意书。
流式细胞仪细胞特征
从上午获得，该细胞群体是强反应性的表面间质标记物CD90 +（93.5％±6.85）和CD73 +和CD105 +（79％±3.46），并显示出阴性反应造血标志物例如CD34及CD45。因此，在这项工作中所使用的AM-的hMSCs均充质，在先前报道莱瓦等（ 图3）accordancewith信息。此外，这个结果正好与间充质干细胞，建立了国际社会为细胞疗法（ISCT）的免疫特性。
在骨基质细胞粘附
扫描显微照片表明分层对NKB后对AM-的hMSCs七天的行为。生物材料的表面覆盖球形细胞（天1），以及一些扩频细胞显然附着在牛基质表面上的第七天。在更高的放大倍率，扩频细胞似乎是经由 filipodial进程（佛罗里达州）（ 图4）紧密接触。
在骨基质细胞增殖
在AB检测结果呈小幅下降相对吸光度ü 1天后孵化，然后在第五天，支架的存在下诱导的增加的细胞增殖与在不存在的牛进行的培养相比统计学显著尼特牛矩阵条件（+骨基质）的（RAU）基质（-bone矩阵）（ 图5）。
菌落形成单位
的CFU是一个传统上测定干细胞。在AM-的hMSCs隔离在这项工作中保留了其形成在文化14天独立的殖民地的能力。
图1：羊膜隔离。 （A）的脐带（UC）是用一只手握住，以确定获得羊膜中的区域。（B）的羊膜（AM），类似于一个半透明的薄膜无血神经支配。
图2：干细胞从人羊膜形态特征的AM-的hMSC在培养后3天的隔离用光学显微镜观察和示出的成纤维细胞样的形态。
图3：流式细胞术表征从人羊膜的细胞主要是间充质细胞，因为它们呈阳性反应，间质标记物（CD73，CD90，CD105），如由直方图到右边的位移，和阴性造血标志物（CD34和CD45），证实了直方图向左的位移。抗原列于红色直方图，而isotypesfor在PE和FITC荧光的控制中被观察黑色。
图4：对牛的骨基质的一系列SEM图像示于生物材料的孔附着的细胞的细胞粘附（A）一种 NKB孔与附着于生物材料中的球形状态（CS）的几个单元的全景视野和平的（CF）在生物材料的表面上，也有可能在三个天培养的牛矩阵的欣赏骨空隙表示为（LAC）。（B）在表面调整过程中的细胞的扩增通过filipodial预测材料（C）两个单元坚持和扁平的牛基体之间的相互作用（C1，电池1;和C2，小区2）。 请点击此处VIEW这个数字的放大版本。
图5：细胞对牛骨基质细胞增殖的增殖，AB降低评估，并表达了相对吸光度单位以及7天栽培。结果示骨基质（+骨基质）中的AM-的hMSCs增殖为与所述负状态（-bone矩阵）比较静态不同的影响。 （* P <0.05）
图6：MSC的CFU试验最初铺板以变化的密度，孵育14天（平均* / -的SD，N = 10）。
| 细胞贴壁 | 细胞粘附（％） | |
| 在底部的细胞 | 187667±1208 | 62.47 |
| 在支架上的细胞 | 312333±1208 | 37.53 |
表1：对牛基质粘附的效率附着到板培养皿的底部，并附着在支架上的细胞中的细胞通过血细胞计数器中回收由表中给出trypsinization.The数据之后，计数对应于独立为一式三份2实验±标准偏差
Discussion
从人羊膜（ 图1）中获得的干细胞表现出成纤维细胞样形态，类似于间充质细胞（ 图2）并且是主要的MSC。此外，流式细胞术分析显示，这些细胞表达间充质细胞标志物（CD73，CD90，和CD105）和阴性造血谱系标记物（CD34，CD45）（ 图3）。另外，在AM-的hMSCs分离在这项工作中呈现形成的CFU（ 图6）的能力。类似地，间充质干细胞中分离以这种形式保留附加到osteoinductor生物材料（ 图4），和增殖的支架（ 图5）的能力。
由于这些原因，AM-的hMSCs的大孔骨的生物材料的培养方法，该方法是在这项工作中使用的是一个机会以插入内受伤骨组织的细胞，并诱导其各色ntiation的成骨细胞谱系。该培养系统不需要增加成骨细胞的电感器来维持成骨细胞的表型和成骨细胞分化过程，因为NKB是一种骨传导andosteoinductive材料8。利用废料的组织，如人胎盘，表示一个简单和伦理替代访问干细胞群以潜力分化为间充质干，在与其他来源经常涉及侵入性方法或低细胞产量比较。
所提出的培养方法，可以外推到体内系统，因为将细胞接种在微块的顶部表面的材料，并将细胞定居和适当的孵育时间后粘附到整个生物材料的表面上。此外，复杂的试剂，设备和程序是不需要的，不象现有的方法实施该技术时微质量cultureas以及在材料上的细胞的等分试样的缓慢而稳定的沉积，以确保细胞优先与生物材料相互作用，并且不与该板的底部。另一个关键点是在培养细胞之前用预湿的材料，因为这确保了细胞将具有从培养基中的必需营养素当它们被集成到该材料无论它们是否在表面上或微孔中。最后，因为它避免了另外的外部因素来诱导和维持成骨细胞分化的使用的骨诱导材料的是这一进程的关键。该技术的限制是，它是基于牛基质的骨诱导潜力;然而，所提出的培养系统可以外推到20至200微米的孔分布的任何多孔材料。因此，在这种工作中提出的程序是用于在各种材料吨间质干细胞培养的另一种方法帽子被用于组织工程，特别是对骨再生。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们承认奖学金，并由理事会全国国立西恩西亚ŸTECNOLOGIA（国家科学技术委员会No.49887），Facultad去医学设备，墨西哥国立自治大学DGAPA IN201510和DGAPA IN216213提供了资金支持;国家研究所Perinatología萨尔瓦多·科雷亚的帮助，生物材料;和Biocriss，SA德C. V捐出Nukbone。也感谢给ING。 IIM，墨西哥国立自治大学的赫克托·马丁内斯和CINVESTAV技术援助了M ENÇ法比奥拉·冈萨雷斯。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
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