Introduction
Het koppelen en regeneratie van tissuesis één van themain doel van de medische wetenschap omdat een laesie in een weefsel ororgan invaliderend zijn en in sommige gevallen dodelijk. In de context, worden de gezondheid van werknemers en onderzoekers voortdurend op zoek technieken, methoden en instrumenten te voorzien van nieuwe therapeutische Alternatieve bevorderen er pair-regeneratieproces van beschadigd weefsel. Daarom hebben biomedische wetenschappen gericht op de studie van mesenchymale stamcellen (MSC's), met name volwassen stamcellen, omdat deze cellijn is een ideaal model voor de weefselregeneratie te bestuderen, vanwege de mogelijkheid om te differentiëren naar ectodermale, mesodermale en endodermale cellijnen Echter, om de therapie te maken met MSC's een realiteit, dient de karakterisering van thetherapeutic potentieel van MSC's gepaard gaan met de implementatie van nieuwe celkweek technieken met behulp van biomaterialen en cellulaire steigers die het gewenste gedrag van de MSC's in de ontvangende weefsel garanderen.
Protocol
Dit onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van de World Medical Association's van Helsinki betreffende de ethische gedrag van onderzoek met mensen en werd goedgekeurd door de Research Ethic Raad van Facultad de Medicina, UNAM (projectnummer 101-2012).
1. Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen
- Bereiding van het reagens
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en vullen met 1% antibiotica-antimycotische oplossing.
- Bereid Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, hoog glucose (HG-DMEM) en voeg 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycoticum solution.Sterilize dit kweekmedium door filtratie door een 0,2 urn filter.
- Bereid een collagenase II oplossing bij 100 U / ml in HG-DMEM zonder FBS en antibioticum-antimycotische oplossing.
- Steriliseer de volgende chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de isolatie, autoclaaf: standaard schaars, eenvoudige ontleden tang, puntig en getande tang en een scalpel handgreep (# 4).
- Isolatie van mesenchymale stamcellen van humane amniotische membraan
- Houd de navelstreng met één hand en met de andere hand, maak de amnionmembraan (AM), die lijkt op een doorschijnende foelie, om een fragment van ongeveer 5 cm2 verkrijgen. Als het gedeelte chorion in het monster aanwezig is, scheiden de onderliggende chorion handmatig dissectie het gedeelte chorion is dikker dan het amnion.
- Resten bloed met drie wassingen van 5 ml PBS en stolsels schaffen eenvoudige tang. Maak een kleine snede in de AM met de scalpel om fragmenten van ongeveer 0,5 cm 2 te genereren.
- Enzymatische afbraak van amnionmembraan
- Incubeer de AM met 5 ml 0,125% trypsine / 0,5 mM EDTA oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min in een 50 ml conische buis bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Centrifugeer 250xg en 25 ° C gedurende 5 minuten en verwijder de trypsine-oplossing door afdanking van het supernatant.
- Voeg 15 ml collagenase type II oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer met af schudden volgens Leyva et al. 9
- Direct na digestie met collagenase II, voeg 15 ml PBS en centrifugeer bij 250 xg en 25 ° C gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en was de cellulaire pellet met 15 ml PBS oplossing en centrifugeer bij 250 xg en 25 ° C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellulaire pellet in 10 ml van HG-DMEM Door licht schudden.
- Uitbreiding van mesenchymale stamcellen
- Zaad 2 ml celsuspensie (1 x 10 4 cellen / cm2) in cultuur kolf en voeg 2 ml van HG-DMEM en incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Elimineer de niet-hechtende cellen door het veranderen van het kweekmedium na 5-7dagen.
- Hierna verandert het kweekmedium elke 3 dagen nog eens 7-10 dagen met een mobiel samenvloeiing van 90% verkregen.
- Herstel de cellen en incubeer ze gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer met 0,125% trypsine / EDTA-oplossing (trypsine).
- Onmiddellijk na behandeling met trypsine, verzamel cellen met een pipet overgebracht in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellulaire pellet in 10 ml van HG-DMEM.
- Cultuur celsuspensie in twee 75 cm2 kolven (5 ml per kolf) en de kweek tot 90% confluentie handhaven.
- Herhaal de stappen 1.4.3. naar 1.4.6, tot 9 passage of subcultuur.
- Herstel cellen door behandeling met trypsine in stap 1.4.3 tot 1.4.5 voor flowcytometrie of andere studies.
2. Voorbereiding van de poreuze botmatrix Disk (NKB)
- Te nat de NKB schijven(Diameter 12 mm, dikte 2 mm). Incuberen elke schijf overnacht met 3 ml van HG-DMEM zonder FBS in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C, volgens Fassina et al 5
- Na de bevochtiging proces, plaatst u de schijf in een 50 ml conische buis en draaien op 250 xg gedurende 5 minuten om het overtollige kweekmedium te verwijderen. Plaats de schijf in een 24 goed celkweekplaat.
- Voeg 500 ul van HG-DMEM en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 ° C. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn op de NKB schijf naar de juiste verdeling van voedingsstoffen en cellen voorstander zijn.
- Wanneer luchtbellen worden waargenomen op de schijf, schud en voeg 300 pl cultuurmedium en incubeer gedurende 15 min in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Na deze tijd verwijderen 300 ul kweekmedium zuigen door de wand van zowel celculturen en bevestigen dat er geen luchtbellen vormen.
- Plaats de schijf in een nieuwe 24-well plaat met eenvoudige tang.
- Seed een celsuspensie (5 x 10 05:00-hMSCs in 100 pl van HG-DMEM) drie subculturen, op het oppervlak van de vooraf bevochtigde biomateriaal schijf en incubeer gedurende 30 min in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Voer deze stap langzaam en continu op het bovenvlak van het biomateriaal om de cellen te interageren met de topografie van scaffold. Opmerking: Dit proces komt 60% van de cellen bevestigd aan de in de tabel 1 biomateriaal.
- Voeg 1,5 ml van HG-DMEM bij 37 ° C en houdt de kweek gedurende 3 dagen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Gebruik turbulentie genereren in de toevoeging van kweekmedium voor voorkomen dat de afzetting van cellen op de bodem van kweekplaat schotel. Dit is de eerste keer.
4. celoppervlaktemerkers Karakterisering door Flow CytomEtry
- Maak de cellen van 9 e subcultuur voor het zaaien ze op de matrix schijf. Gebruik 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en bevestig ze gedurende 30 min in ijskoude 2% formaldehyde. Na fixatie, was de cellen eenmaal met 0,05% PBS.
- Blokkeer niet-specifieke binding door incuberen van de cellen met 20% humaan immunoglobuline gedurende 3 minuten op ijs geïncubeerd en 0,1 x 10 6 cellen monsters met phycoerythrine (PerCP) geconjugeerd Mab tegen CD73 FITC-geconjugeerde MAb CD90, PE-geconjugeerde MAb tegen CD34 FITC-geconjugeerd CD45 MAb en PE-geconjugeerde MAb CD105 gedurende 1 uur bij 25 ° C in het donker. Overeenkomend isotype FITC-geconjugeerde MAb, PE-geconjugeerde MAb andPerCP-geconjugeerde MAb zal dienen als negatieve controles.
- Bereken de expressieniveaus van het oppervlak markers met software voor data acquisitie en analyse.
5. Cel Adhesie Detectie door Scanning Electron Microscopy
- Spoel de cel-schijf monsters op 3 dagen van de cultuur tweemaal met PBSen fixthe monsters met 4% (v / v) glutaaraldehyde solutionin een 0,1 M Na-cacodylaatbuffer (pH 7,2).
- Bereid de monsters voor microscopische waarneming, zoals eerder gerapporteerd door Rivera-N et al. 10 en observeren met een scanning elektronenmicroscoop op een elektrische potentiaal van 15 kV en bij een vergroting van 500X en 2000X.
6. celproliferatietest
- De cel-disk monsters met 1,5 ml kweekmedium, voeg 150 pl vitale kleurstof (AB) volgens de richtlijnen van de fabrikant en incubeer de cellen in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.
- Onmiddellijk na toevoeging van AB (0 uur) en elke 24 uur tot aan 7 dagen celkweek, meet de absorptie bij 570 nm met een referentie golflengte van 600 nm.
7. Colony Forming Unit (CFU) 11
- Cultuur 100 cellen per 100 mm weefselkweek Diskin HG-DMEM en incubeer gedurende 14dagen in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.
- Was de cultuur met PBS en vlek met 0,5% kristalviolet in methanol gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de plaatjes met PBS twee keer en tel de zichtbare kolonies met behulp van een hemocytometer.
Representative Results
Menselijke mesenchymale stamcellen isoleren
Na mechanisch scheiden van de AM van het chorion middels stompe dissectie (figuur 1), werd een hechtende celpopulatie verkregen door trypsine en collagenase digestie II. Deze celpopulaties bevestigd de kweekschaal presentaties fibroblastachtige celmorfologie op 3 dagen na isolatie zoals in de optische microfoto (figuur 2A) en scanning elektronenmicroscoop (Figuur 2B) .De placenta in dit werk werden verkregen van gezonde donor moeders withprevious informed consent.
Cel karakterisering door flowcytometrie
De celpopulatie die is verkregen uit het AM was sterk reactief met het oppervlak mesenchymale markers CD90 + (93.5% ± 6,85) en CD73 + en CD105 + (79% ± 3,46) en vertoonde een negatieve reactie op hematopoïetische merkers zoals CD34 en CD45. Aldusde AM-hMSCs in dit werk waren mesenchymale in Accordancewith informatie eerder gerapporteerd door Leyva et al. (Figuur 3). Bovendien, dit resultaat valt samen met de immunofenotype kenmerken die zijn vastgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) voor mesenchymale stamcellen.
Celadhesie aan botmatrix
Het scannen microfoto tonen het gedrag van de AM-hMSCs zeven dagen na lagen op de NKB. Het oppervlak van het biomateriaal was bedekt met sferische cellen (dag) en sommige verspreiding cellen kennelijk aan de runder matrijsoppervlak op de zevende dag. Bij hogere vergroting, de verspreiding cellen bleek in nauw contact via filipodial processen (FL) (figuur 4).
Cel proliferatie botmatrix
De resultaten van de AB assay toonde een kleine afname in relatieve extinctie u neten (RAU) van rundermatrix aandoening (+ botmatrix) na 1 dag van incubatie en op de vijfde dag, de aanwezigheid van de steiger induceert een toename van de celproliferatie statistisch significant in vergelijking met de kweek uitgevoerd in afwezigheid van runderen matrix (Hong been matrix) (figuur 5).
Colony Forming Unit
De CFU is een traditioneel bepaling van stamcellen. De AM-hMSCs geïsoleerd in dit werk bewaard gebleven zijn vermogen om discrete kolonies bij 14 dagen in cultuur te vormen.
Figuur 1: Isolatie van amnionmembraan. (A) De navelstreng (UC) wordt vastgehouden met een hand aan de regio waarin het amniotische membraan verkregen identificeren. (B) De amnionmembraan (AM) lijkt een doorschijnende film zonder bloed innervatie.
Figuur 2:. Morfologische kenmerken van stamcellen uit de humane amniotische membraan AM-hMSC kweken 3 dagen na isolatie werden waargenomen met een optische microscoop en getoond de fibroblast-achtige morfologie.
Figuur 3:. Flowcytometrie karakteristiek De cellen van humane amniotische membraan waren meestal mesenchymale cellen omdat zij positief voor mesenchymale merkers (CD73, CD90, CD105) waren, zoals blijkt uit de verplaatsing van histogram naar rechts en negatief voor hematopoïetische merkers (CD34 en CD45), zoals bevestigd door de verplaatsing van het histogram naar links. De antigenen worden getoond in rood histogrammen, terwijl de controlegroep isotypesfor de PE en FITC fluorochromen worden waargenomen inzwart.
Figuur 4:.. Cell hechting op runderen botmatrix Een reeks SEM beelden die hechting van de cellen aan poriën van het biomateriaal (A) panoramische beeld van een NKB porie met meerdere cellen gehecht aan het biomateriaal in de bolvormige toestand (CS) en afgeplatte (CF) op het oppervlak van het biomateriaal, ook mogelijk om het bot leemte geeft als (Lac) drie dagen van cultuur op de rundermatrix waarderen. (B) Amplificatie van de cel in de aanpassing aan het oppervlak van het materiaal door filipodial projecties (C) Interactie tussen twee cellen gehandeld en afgeplat aan de runder-matrix (C1, cel 1 en C2, cel 2).. Klik hier om vIEW een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5:. Proliferatie van de cellen op runderen botmatrix celproliferatie werd geëvalueerd door AB reductie en uitgedrukt in relatieve absorptie-eenheden langs 7 dagen van kweken. Resultaten zijn getoond de invloed van botmatrix (+ botmatrix) AM-hMSCs proliferatie die statistisch significant verschillend in vergelijking met de negatieve voorwaarde (Hong been matrix) was. (* P <0.05)
Figuur 6: CFU assay van MSC aanvankelijk uitgeplaat bij variërende dichtheden en gedurende 14 dagen (gemiddeld * / - SD, n = 10).
| Cellen gehandeld | Celadhesie (%) | |
| Cellen onderaan | 187.667 ± 1208 | 62,47 |
| Cellen op het schavot | 312.333 ± 1208 | 37,53 |
Tabel 1:. Doelmatigheid van hechting op rundermatrix De cellen gehecht aan de bodem van de plaat schaal en de cellen hechten aan de steiger werden geteld door hemocytometer na teruggewonnen door trypsinization.The gegevens in de tabel komen overeen met twee onafhankelijke experimenten voor drievoud ± standaarddeviatie
Discussion
De stamcellen die zijn verkregen van humane amniotische membraan (figuur 1) toonde een fibroblast-achtige morfologie, vergelijkbaar met mesenchymale cellen (figuur 2) en waren hoofdzakelijk MSCs. Bovendien flowcytometrie assays bleek dat deze cellen waren positief voor mesenchymale cellen merkers (CD73, CD90 en CD105) en negatief voor hematopoietische afkomst merkers (CD34, CD45) (figuur 3). Ook de AM-hMSCs die in dit werk geven de mogelijkheid van het vormen CFU's (figuur 6). Ook de mesenchymale stamcellen in deze vorm het vermogen behielden om aan osteoinductor biomateriaal (figuur 4), en prolifereren op de steiger (figuur 5).
Om deze redenen is de kweekmethode van AM-hMSCs op macroporeus been biomateriaal dat werd gebruikt in dit werk een kans om cellen binnen verwond botweefsel invoegen en induceren de differentiation de osteoblastische afstamming. Deze cultuur systeem niet de toevoeging van osteoblastische inductors vereisen om de osteoblasten fenotype en osteoblastische differentiatie proces te behouden omdat NKB is een osteoconductief andosteoinductive materiaal 8. Het gebruik van afval weefsels, zoals humane placenta, is een eenvoudige en ethische alternatief om een populatie van stamcellen met de potentie om te differentiëren in MSC's, in vergelijking met andere bronnen die vaak om invasieve of lage celopbrengst.
De voorgestelde kweekmethode kan worden geëxtrapoleerd naar in vivo systemen omdat de cellen uitgezaaid in micro-massa op het bovenoppervlak materiaal en de cellen koloniseren en zich aan het gehele biomateriaal na daarom incubatietijden. Verder verfijnde reagentia, apparatuur en procedures zijn niet goed vereist, in tegenstelling tot bestaande methoden bij de uitvoering van deze techniek worden de micro-massa cultureas als delangzaam en regelmatig afzetting van het cellulaire monster van het materiaal dat de cellen bij voorkeur interageren met het biomateriaal, en niet met de onderkant van de plaat. Een kritisch punt is het gebruik van vooraf bevochtigd materiaal voor het kweken van de cellen, aangezien dit ervoor zorgt dat de cellen de benodigde voedingsstoffen uit het kweekmedium wanneer ze zijn geïntegreerd in het materiaal of ze nu op het oppervlak of in de poriën. Tenslotte, het gebruik van een osteo-inductief biomateriaal is essentieel voor dit proces, omdat het voorkomt de toevoeging van externe factoren voor inductie en osteoblastische differentiatie behouden. De beperking van de techniek is dat het gebaseerd is op het osteo-inductieve potentieel van de rundermatrix; echter kan het voorgestelde kweeksysteem worden geëxtrapoleerd naar elk poreus materiaal met een porie verdeling van 20 tot 200 urn. Daarom is het in dit werkvolgorde is een alternatieve methode voor het kweken van mesenchymale stamcellen in diverse materialen thoed worden ingezet voor tissue engineering, vooral voor de regeneratie van bot.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen de beurs en de financiële steun van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 en DGAPA IN216213; Salvador Correa van Instituto Nacional de Perinatología voor hulp bij het biologisch materiaal; en Biocriss, SA de C. V voor het doneren van Nukbone. Ook dank aan Ing. Héctor Martínez van IIM, UNAM en M en C Fabiola Gonzalez van Cinvestav voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
